響應面法優(yōu)化超聲輔助提取白蘭葉總黃酮工藝

陳建福,林　洵,林萍萍,莊遠紅

(1.漳州職業(yè)技術學院 食品與生物工程系,福建漳州 363000;2.閩南師范大學 生物科學與技術學院,福建漳州363000;3.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心,福建漳州 363000)

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響應面法優(yōu)化超聲輔助提取白蘭葉總黃酮工藝

陳建福1,2,3,林洵1,3,林萍萍2,莊遠紅2

(1.漳州職業(yè)技術學院 食品與生物工程系,福建漳州 363000;2.閩南師范大學 生物科學與技術學院,福建漳州363000;3.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應用技術工程中心,福建漳州 363000)

為優(yōu)化超聲波輔助提取白蘭葉總黃酮工藝,在單因素實驗的前提下,以總黃酮得率為響應值,選擇乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度4個因素為自變量,進行Box-Behnken實驗設計,研究4個因素及其交互作用對白蘭葉總黃酮得率的影響。研究結果表明超聲波輔助提取白蘭葉總黃酮的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為54%,液料比為19 mL/g,超聲時間為25 min,超聲溫度為66 ℃,在此條件下,測得白蘭葉總黃酮的得率為9.94%,與預測值相對誤差為0.30%,說明回歸模型的擬合度較高,該研究為白蘭葉開發(fā)成天然抗氧劑奠定了理論基礎和科學依據(jù)。

白蘭葉,總黃酮,超聲波提取,響應面法

白蘭(Micheliaalba)又名白蘭花、緬桂,屬木蘭科,含笑屬常綠喬木,在我國各地均有栽種,尤其是東南地區(qū)和西部,是名貴的觀賞香味型園林植物[1-2]。白蘭花和葉中具有揮發(fā)性的芳香精油,不僅能供人觀賞,還具有諸多藥理功能的黃酮、多糖等生物活性成分[3-4]。黃酮類物質(zhì)是植物體內(nèi)重要的天然化合物,具有明顯的抗炎、清除自由基、抑制細菌、抗瘤、抗衰老、增強免疫力等作用[5-6]。隨著生活水平的提高,人們越來越崇尚回歸自然,一些富含黃酮等天然有效成分的產(chǎn)品日益受到人們的追捧,然而目前尚未有對白蘭葉總黃酮提取的相關報道。另外隨著科技的發(fā)展,超聲波輔助技術在植物提取方面的優(yōu)勢越來越顯著[7],利用超聲波產(chǎn)生的高加速度、猛烈振動、劇烈的空化作用、熱效應以及攪拌作用等能夠使植物有效成分更易進入溶劑,具有省時、節(jié)能、高效和操作簡單的特點。本研究以白蘭葉為原料,通過超聲技術對白蘭葉總黃酮進行提取,在單因素的前提下運用響應面法,以總黃酮得率為指標對提取工藝進行優(yōu)化,為白蘭葉黃酮資源的深入研究以及白蘭葉抗氧化劑的開發(fā)利用提供參考和指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

白蘭葉采摘于漳州市勝利西路;蘆丁標準品>98%上海滬宇生物試劑公司;95%乙醇,食品醫(yī)藥級河南浩宇食品添加劑有限公司;氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁等均是分析純。

Q-250B高速多功能粉碎機上海冰都電器有限公司;KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;UV-1100型紫外可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司;AR124CN電子天平奧豪斯儀器上海有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1總黃酮含量的測定以蘆丁為標準品,按文獻[8]方法,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法,繪制標準曲線,得回歸方程。準確量取一定量的提取液于10 mL容量瓶中,按照文獻方法進行測試,代入回歸方程計算出總黃酮濃度,通過式(1)換算成總黃酮的得率。

式(1)

其中:m為白蘭葉粉末的質(zhì)量(g);b為總黃酮質(zhì)量濃度(mg/L);V為提取液體積(L)。

1.2.2單因素實驗設計將采摘的白蘭葉用清水浸泡洗凈,取出晾干,放進烘箱干燥,粉碎后備用。精確稱取1.0 g原料于100 mL圓底燒瓶中,在設定好溫度、時間的超聲波清洗器中回流浸提,提取結束后,冷卻過濾,稀釋,定容,按1.2.1中的方法算出白蘭葉總黃酮的得率。

1.2.2.1乙醇濃度對總黃酮得率的影響固定料液比為30 mL/g,超聲時間45 min,超聲溫度60 ℃的條件下,研究不同乙醇濃度(45%、55%、65%、75%、85%)對白蘭葉總黃酮得率的影響。

1.2.2.2液料比對總黃酮得率的影響固定乙醇濃度為55%,超聲時間45 min,超聲溫度60 ℃的條件下,考察不同液料比(10、20、30、40、50 mL/g)對白蘭葉總黃酮得率的影響。

1.2.2.3超聲時間對總黃酮得率的影響固定乙醇濃度為55%,液料比為20 mL/g,超聲溫度為60 ℃的條件下,研究不同超聲時間(15、25、35、45、55 min)對白蘭葉總黃酮得率的影響。

1.2.2.4超聲溫度對總黃酮得率的影響在乙醇濃度為55%,液料比為20 mL/g,超聲時間25 min的條件下,研究不同超聲溫度(50、55、60、65、70 ℃)對白蘭葉總黃酮得率的影響。

1.2.3響應面實驗設計在單因素的基礎上,用Box-Behnken對表1中ABCD四個變化因素,進行四因素三水平響應面實驗,4個自變量因素編碼及水平見表1。最后利用響應面軟件對數(shù)據(jù)進行處理,以獲得最佳提取條件。

表1　Box-Behnken分析因素水平表Table 1　Factors and levels of Box-Behnken

1.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”,n=3。實驗數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05b、Origin7.5和Excel 2003進行處理。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1乙醇濃度對白蘭葉總黃酮得率的影響由圖1可得,乙醇濃度增加,總黃酮得率跟著增加,當乙醇濃度達到55%時,得率出現(xiàn)峰值,隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加,得率反而降低。這是因為太高的乙醇濃度,導致更多的脂溶性雜質(zhì)(鞣質(zhì)、色素等)溶出而使得水溶性黃酮的溶出減少,從而降低了黃酮的得率[9]。因此最佳乙醇濃度為55%。

圖1　乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

圖2　液料比對總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of material-liquid ratio on extraction yield of total flavonoids

2.1.2液料比對白蘭葉總黃酮得率的影響由圖2可得,液料比從10 mL/g增大到20 mL/g,總黃酮得率急劇上升,在液料比為20 mL/g時,對總黃酮得率的影響最明顯,隨著液料比的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)下降的趨勢。這是因為液料比越大,體系間的濃度差就越大,促進總黃酮的充分浸出,使得得率提高。但是過大的液料比,使超聲波能量更容易被溶劑吸收,空化泡對能量的吸收則相應減少,導致細胞壁不完全破裂,目標提取物不能充分溶出細胞[10],從而大大降低了總黃酮得率。同時溶劑過多不僅會影響體系間的傳熱和傳質(zhì),還會造成能源的浪費,因此從節(jié)約能源考慮,液料比應選擇20 mL/g。

2.1.3超聲時間對白蘭葉總黃酮得率的影響由圖3可得,白蘭葉總黃酮得率隨著超聲時間的延長而迅速提升,在超聲25 min時達到峰值,繼續(xù)增加超聲時間,得率不但沒有升高還呈下降趨勢。這是因為超聲時間過長時,長時間的超聲作用使得已溶出的黃酮類化合物降解以及溶劑揮發(fā)導致乙醇濃度降低,最后造成黃酮得率不斷下降。因此最佳超聲時間為25 min。

圖3　超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoids

2.1.4超聲溫度對白蘭葉總黃酮得率的影響由圖4可得,超聲溫度在50～65 ℃之間,總黃酮得率不斷上升,這是因為溫度升高加快了分子的平均動能,提高了總黃酮的溶出,從而提高了得率。但是繼續(xù)升高溫度,得率卻呈直線下降,這是因為總黃酮容易在過高的溫度下發(fā)生氧化或降解,從而降低了總黃酮的得率[11]。因此最佳的溫度應為65 ℃。

圖4　超聲溫度對總黃酮得率的影響Fig.4　Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2響應面法優(yōu)化結果及分析

2.2.1數(shù)學模型及方差分析根據(jù)單因素結果和Box-Behnken中心組合實驗設計原理,采用Design-Expert 8.0.6軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸設計,利用Box-Behnken實驗的4因素3水平組成29個實驗點(白蘭葉總黃酮得率見表2),包含24個析因?qū)嶒?5個中心點實驗。自變量取值在乙醇濃度(A)、液料比(B)、超聲時間(C)、超聲溫度(D)所構成的三維頂點,后5個是區(qū)域的中心點,用來估計實驗誤差。

表2　響應面分析方案及結果Table 2　Experiment design and result of response surface method analysis

經(jīng)軟件對表2的實驗數(shù)據(jù)進行分析后,得到白蘭葉總黃酮得率(Y)的回歸模型為:Y=9.93-0.31A-0.14B+0.10C+0.22D-0.12AB+0.17AC+0.0075AD+0.13BC+0.19BD-0.098CD-2.03A2-0.40B2-0.44C2-0.38D2

并對該回歸方程進行顯著性檢驗。由統(tǒng)計學相關知識對表3進行分析,可得p<0.0001,該數(shù)據(jù)說明模型達到極顯著水平,方程的回歸系數(shù)R2=0.9929,說明模型的擬合度好,該模型可以解釋超過99%的數(shù)據(jù);失擬度p=0.1076>0.05,不顯著,表明回歸方程與實驗值擬合較好,實驗誤差小;根據(jù)F值大小可以得出各關鍵因素對得率的影響力度為:乙醇濃度>超聲溫度>液料比>超聲時間。其中A、B、D、BD、A2、B2、C2和D2對結果影響極其明顯(p<0.01),C、AC對結果影響顯著(p<0.05),說明所考察的四個工藝條件與總黃酮得率之間不是簡單的線性關系。綜上所述,該模型可以分析和預測白蘭葉總黃酮得率,并確定最佳提取工藝條件。

表3　回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance for the regression equation

注:*p<0.05,差異顯著;**p<0.01,差異極顯著。

2.2.2響應面分析響應面和相應的等高線圖可以直觀地看出各因素極其交互作用對白蘭葉總黃酮得率的影響,每個響應面控制兩個因素不變,分析另外兩個因素對響應值的影響。等高線的形狀也可反映出交互效應的強弱,趨向橢圓且橢圓的軸線與坐標軸存在一個角度,表明交互作用明顯;反之,則交互作用較低。將所有等高線圖經(jīng)等高線性質(zhì)分析,可得乙醇濃度與超聲時間、液料比與超聲溫度存在明顯的交互作用,其余因素交互作用則不顯著。交互作用最顯著的響應面圖,如圖5所示。

圖5　液料比和超聲溫度對總黃酮得率的影響Fig.5　Effect of liquid-material ratio and ultrasonic temperature on yield of total flavonoids

從圖5可得:液料比(B)和超聲溫度(D)的等高線呈上升現(xiàn)象,在液料比較小時,等高線比較平坦,說明白蘭葉總黃酮得率受液料比的影響不明顯,而當液料比(B)較高水平時,等高線排列相對緊湊,表明液料比對總黃酮得率的影響相對比較明顯;而且等高線圖形趨向橢圓,說明2個因素間的交互作用顯著。

2.2.3最佳工藝條件的確定通過Design Expert 8.0.6軟件,對回歸模型進行預測得到超聲輔助提取白蘭葉總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度為54.29%,液料比為19.10 mL/g,超聲時間為25.61 min,提取溫度為66.26 ℃;在該工藝條件下,白蘭葉總黃酮得率理論值可達9.97%,考慮到實際操作條件,將工藝條件修正為乙醇濃度為54%,液料比為19 mL/g,超聲時間為25 min,提取溫度為66 ℃進行驗證實驗,實際測得白蘭葉總黃酮的得率為9.94%,其相對誤差為0.30%,說明回歸模型的擬合度較高,可利用響應面法對白蘭葉總黃酮提取工藝進行優(yōu)化。

3　結論

在單因素實驗的前提下,選擇乙醇濃度、液料比、超聲時間、超聲溫度作為自變量進行Box-Behnken中心組合實驗設計,并應用軟件進行數(shù)據(jù)擬合,建立了超聲提取白蘭葉總黃酮的數(shù)學回歸模型。模型分析表明,這個模型具有較高的穩(wěn)定性。并根據(jù)模型的回歸方程及其等高線圖,對各關鍵因素及其相互作用進行研究,得到因素的主效應順序為:乙醇濃度>超聲溫度>液料比>超聲時間。液料比與超聲溫度之間存在明顯的交互作用。超聲輔助提取白蘭葉總黃酮的最佳工藝條件為:乙醇濃度為54%,液料比為19 mL/g,超聲時間為25 min,提取溫度為66 ℃,在該條件下,測得白蘭葉總黃酮得率為9.94%,與預測值其相對誤差為0.30%,說明回歸模型的擬合度較高,可用于優(yōu)化白蘭葉總黃酮提取工藝,該研究為白蘭葉開發(fā)成天然抗氧化劑品奠定了理論基礎和科學依據(jù)。

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Ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids fromMicheliaAlbaleaves using response surface methodology

CHEN Jian-fu1,2,3,LIN Xun1,3,LIN Ping-ping2,ZHUANG Yuan-hong2

(1.Department of Food and Biology Engineering,Zhangzhou Institute of Technology,Zhangzhou 363000,China;2.College of Biological Science and Technology,Minnan Normal University,Zhangzhou 363000,China;3. Applied Technology Engineering Center of Fujian University for Further Processing and Safety of Agricultural Products,Zhangzhou 363000,China)

The ultrasonic-assisted extraction conditions of polyphenol frommicheliaalbaleaves were optimized by response surface methodology. Based on single factor test,a 4-factor,3-level Box-Behnken experimental was adopted including dependent variables(ethanol concentration,liquid to material ratio,ultrasonic time and ultrasonic temperature)and independent variable(yield of polyphenols). The results showed that the optimum conditions were ethanol concentration 54%,liquid to material ratio 19 mL/g,ultrasonic time 25 min,ultrasonic temperature 66 ℃. The yield of total flavonoids could be up to 9.94% under the optimal extraction condition,the relative error was 0.30% compared to the predictive value,which indicated the feasible model fitted well with the experimental data. The research could be developed a theoretical foundation and a scientific basis for the extraction of total flavonoids frommicheliaalbaleaves into natural antioxidant.

MicheliaLeaves;total flavonoids;ultrasonic-assisted;response surface methodology

2016-01-14

陳建福(1982-)，男，博士，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學工藝，E-mail：qjf1996@163.com。

福建省高校杰出青年科研人才培育計劃(閩教科[2015]54號)；福建省中青年教師教育科研項目計劃(JA15688)；漳州職業(yè)技術學院科技計劃項目(ZZY1502)。

TS201

B

1002-0306(2016)15-0238-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.038