MALDI-TOF-IMS分析DAI大鼠腦組織內(nèi)差異蛋白的分布

任冠恒，翁榕花，施　妍，黃　平，鄧愷飛，劉寧國，陳憶九（.司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 20006；2.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 5055；.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 500）

·論著·

MALDI-TOF-IMS分析DAI大鼠腦組織內(nèi)差異蛋白的分布

任冠恒1，2，翁榕花3，施妍1，黃平1，鄧愷飛1，劉寧國1，陳憶九1
（1.司法部司法鑒定科學技術(shù)研究所 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；
2.南方醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院法醫(yī)學系，廣東 廣州 510515；3.莆田市公安局城廂分局，福建 莆田 351100）

目的 基于基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜成像（matrix assisted laser desorption/ionizationtime of flight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術(shù)建立彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）大鼠腦組織內(nèi)蛋白差異化表達的質(zhì)譜成像方法。方法 應(yīng)用AutoflexⅢ MALDI-TOF質(zhì)譜儀在質(zhì)荷比1000～20000范圍內(nèi)對DAI組和對照組腦組織進行質(zhì)譜掃描，利用ClinProTool 2.2軟件對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，挑選出存在表達差異的蛋白質(zhì)分子進行質(zhì)譜成像，觀察不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)分子在腦組織中的分布情況。結(jié)果 質(zhì)荷比為4963、5634、6253、6714及7532的5個蛋白質(zhì)分子在DAI大鼠腦組織內(nèi)表達量存在差異。結(jié)論 MALDI-TOF-IMS可用于大鼠DAI后腦組織內(nèi)差異蛋白的研究，初步建立了質(zhì)譜成像技術(shù)檢測DAI大鼠腦組織中差異蛋白分布的分析方法。

法醫(yī)病理學；彌漫性軸索損傷；質(zhì)譜分析法；基質(zhì)輔助激光解吸電離；腦干；大鼠

彌漫性軸索損傷（diffuse axonal injury，DAI）是一種以腦白質(zhì)軸索彌漫性損傷為主的外傷性腦損傷，常伴有明顯的神經(jīng)病學和行為學的改變［1］。臨床上其死亡率和發(fā)病率均較高，在法醫(yī)學實際檢案中DAI也并不少見，有學者［2］認為約30%因顱腦損傷死亡的案例與DAI有關(guān)。然而，DAI病理學機制的闡明仍是法醫(yī)病理學者面臨的一大難題。近年來，分子標志物對研究病理學機制起到越來越重要的作用，而差異蛋白質(zhì)組學的研究方法已廣泛應(yīng)用于分子標志物的尋找、鑒定等方面［3］。迄今為止，已有多種用于分析樣品中蛋白質(zhì)的技術(shù)方法，如雙向凝膠電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組學研究中應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)分析方法，但該技術(shù)的缺點是樣品制備過程破壞了組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)與特征蛋白質(zhì)的直接關(guān)系，與細胞組成和空間分布相關(guān)的蛋白質(zhì)信息幾乎全部丟失［4］，在樣本收集過程中存在細胞異質(zhì)性的問題。

基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜成像（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight imaging mass spectrometry，MALDI-TOF-IMS）技術(shù)是近年來發(fā)展最快的蛋白質(zhì)組學新技術(shù)之一，已成功用于直接分析生物組織切片，該方法不僅避免了繁瑣的樣品提取、純化和分離步驟，而且能夠獲取生物組織中蛋白質(zhì)和多肽表達譜，并繪制二維質(zhì)譜圖像［5］，已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物研發(fā)等領(lǐng)域［6］。本研究利用MALDI-TOF-IMS技術(shù)對DAI大鼠腦組織進行質(zhì)譜掃描，獲取腦組織切片上每個點的質(zhì)荷比（m/z）信息，繪制二維質(zhì)譜圖像，得到不同質(zhì)荷比蛋白質(zhì)分布情況的完整質(zhì)譜圖，為研究DAI蛋白質(zhì)分子的空間分布奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1主要儀器與試劑

AutoflexⅢ MALDI-TOF IMS、Leica CM 1950冷凍切片機、ImagePrep自動基質(zhì)噴霧裝置、MALDI專用導(dǎo)電玻片、基質(zhì)芥子酸（sinapic acid，SA）、蛋白標準品Ⅰ均購自德國Bruker公司，OCT冰凍切片包埋劑（美國Sakura公司），色譜純乙腈（美國Fluka公司），三氟乙酸（美國Sigma公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，水為超純水（德國Millipore公司）。

1.2實驗動物與分組

正常雄性SD大鼠15只，體質(zhì)量200～220g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，隨機分成DAI組（n=10）和對照組（n=5）。

1.3動物模型制作

參照Marmarou方法［7］制備大鼠DAI損傷模型，對照組同樣暴露，但不進行打擊致傷。

1.4樣品制備

大鼠致傷24 h后，用 1%苯巴比妥鈉溶液以50 mg/kg腹腔注射麻醉，斷頭取腦，腦組織用鋁箔松軟包裹后立即轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中冷凍保存。

利用冰凍切片機將大鼠的大腦、小腦、腦干沿矢狀面分別進行連續(xù)切片，厚度為10μm，并進行HE染色和嗜銀染色。

另取冰凍切片組織放置在導(dǎo)電玻片上，然后將載有切片的載玻片轉(zhuǎn)入真空干燥器干燥40min，再依次放入70%、90%、100%的乙醇溶液中，各浸洗30 s，再次真空干燥。用含0.2%三氟乙酸的60%乙腈水溶液配制成10mg/mL的SA基質(zhì)溶液。使用ImagePrep自動基質(zhì)噴霧裝置將基質(zhì)溶液均勻覆蓋在切片上。

1.5數(shù)據(jù)分析

1.5.1質(zhì)譜掃描成像

使用FlexControl 3.0質(zhì)譜操控軟件（德國Bruker公司）設(shè)置質(zhì)譜掃描條件，激光束直徑200 μm，正離子模式和線性模式，質(zhì)量掃描范圍m/z 1000～20000；對DAI組和對照組大鼠腦組織切片進行質(zhì)譜掃描，并使用FlexImaging 3.0軟件（德國Bruker公司）對質(zhì)譜掃描數(shù)據(jù)進行分析和成像。

1.5.2數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計學分析

利用ClinProTool 2.2軟件對兩組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，找出DAI組和對照組大鼠腦組織切片之間存在表達量差異的蛋白質(zhì)條帶，采用FlexImaging 3.0軟件對其進行質(zhì)譜成像。

2　結(jié)　果

2.1染色結(jié)果

HE染色：DAI組腦組織軟腦膜下大腦皮質(zhì)呈片狀出血，軸索腫脹，組織結(jié)構(gòu)疏松（圖1A）；對照組未見異常。

嗜銀染色：DAI組可見腦神經(jīng)軸索斷裂、增粗、扭曲變形及收縮球形成，排列稀疏（圖1B）；對照組未見異常。

2.2蛋白質(zhì)組學差異分析及質(zhì)譜成像結(jié)果

將DAI組和對照組樣品數(shù)據(jù)導(dǎo)入ClinProTool 2.2軟件經(jīng)統(tǒng)計分析后，挑選出其中5個存在表達量差異的蛋白質(zhì)分子（P＜0.05），質(zhì)荷比分別為4 963、5 634、6253、6714及7532。與對照組相比，DAI組中質(zhì)荷比為4963的蛋白質(zhì)分子在小腦中表達下調(diào)，在大腦皮質(zhì)、髓質(zhì)及腦干中表達上調(diào)；質(zhì)荷比為5 634的蛋白質(zhì)分子在大腦皮質(zhì)及髓質(zhì)中表達量下調(diào)，在小腦和腦干中表達量上調(diào)；質(zhì)荷比為6253的蛋白質(zhì)分子在大腦皮質(zhì)、髓質(zhì)及小腦中表達下調(diào)，在腦干中表達上調(diào)；質(zhì)荷比為6714的蛋白質(zhì)分子在大腦皮質(zhì)、髓質(zhì)及小腦中表達下調(diào)，在腦干中表達上調(diào)；質(zhì)荷比為7532的蛋白質(zhì)分子在大腦髓質(zhì)中表達下調(diào)，在大腦皮質(zhì)、小腦及腦干中表達上調(diào)（表1）。質(zhì)譜成像圖中的彩色斑點代表蛋白質(zhì)的定位，每個斑點顏色的深淺與激光在每一個點或像素上檢測到的信號大小相關(guān)，即顏色越深，則蛋白質(zhì)的表達越豐富。從質(zhì)譜成像圖中可以看出，不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)分子在兩組大鼠腦組織的表達量不同，在腦組織中的分布存在明顯差異（圖2）。

表1　5個差異蛋白峰

3　討　論

DAI是重要的腦外傷類型之一，自從1956年Strich首次報道DAI損傷的病理學改變后，很多學者對DAI的發(fā)生機制及病理形態(tài)學改變進行了大量研究［8］。目前認為DAI的發(fā)生機制是由于外力作用于頭部對腦組織引起的剪切、牽張及旋轉(zhuǎn)作用，使神經(jīng)纖維扭曲或牽拉過度導(dǎo)致神經(jīng)纖維斷裂，形成原發(fā)性軸索損傷所致［9］。隨著差異蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，對DAI病理學改變的觀察主要為對蛋白質(zhì)的檢測。迄今為止，已有多種用于分析組織樣本中蛋白質(zhì)的技術(shù)方法，最常用的方法是利用二維凝膠電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì)和利用質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫搜索的方法鑒定蛋白質(zhì)［10-11］。

Boone等［12］報道利用激光捕獲切割顯微（laser capture microdissection，LCM）技術(shù)從混合種群的腦細胞中獲取特定的同類細胞乃至單個細胞，利用實時PCR技術(shù)和微陣列分析技術(shù)對mRNA進行分析，研究外傷性腦損傷海馬中基因表達的情況。該方法不僅解決了細胞異質(zhì)性的問題，而且在一定程度上可研究腦損傷后海馬中基因表達的分布情況。這為外傷性腦損傷的基礎(chǔ)研究起到重要作用，但這種方法操作較為繁瑣，是一項費時費力的工作。

本實驗采用MALDI-TOF-IMS對DAI大鼠腦組織內(nèi)差異蛋白進行質(zhì)譜成像，觀察不同蛋白質(zhì)分子在腦組織中的分布情況，初步建立了基于MALDI質(zhì)譜成像的DAI大鼠腦組織內(nèi)差異蛋白的質(zhì)譜成像方法。實驗采用ClinProTool 2.2軟件對DAI組和對照組的樣品數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，挑選出5個差異蛋白，并利用這5個差異蛋白進行質(zhì)譜成像。從質(zhì)譜成像圖中可以看出，不同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)分子在腦組織中分布不同，相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)分子在對照組和DAI組中的分布也不同，本研究結(jié)果清晰顯示了成像圖中蛋白質(zhì)分子在腦組織中的分布情況。與對照組相比，質(zhì)荷比為4 963的蛋白質(zhì)分子在DAI組胼胝體部位分布較為密集，提示胼胝體部位該蛋白表達量上升；質(zhì)荷比為5 634的蛋白質(zhì)分子在DAI組大腦中分布較少，腦干中分布較多，而在對照組大腦中分布較多，腦干中分布較少；質(zhì)荷比為6253的蛋白質(zhì)分子在DAI組腦干中分布較對照組多；質(zhì)荷比為6714的蛋白質(zhì)分子在大腦髓質(zhì)及小腦分布較多，大腦皮質(zhì)中的分布較少，在DAI組腦干中分布較明顯，但在對照組腦干中幾乎沒有分布；質(zhì)荷比為7532的蛋白質(zhì)分子主要分布于大腦皮質(zhì)，在DAI組的小腦及腦干有分布，但在對照組的小腦及腦干則幾乎沒有分布。

DAI好發(fā)于灰、白質(zhì)交界區(qū)，其中胼胝體、腦干等部位為其特征性部位［13］。根據(jù)質(zhì)譜成像圖的觀察分析，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，5個蛋白質(zhì)分子在DAI組腦干中分布均明顯增多，而質(zhì)荷比為4963的蛋白質(zhì)分子在DAI組胼胝體分布也相對密集，5個蛋白在DAI組腦干和胼胝體中分布增多提示該易損部位發(fā)生了蛋白質(zhì)表達上調(diào)的情況，很可能成為DAI的潛在標志物。

本結(jié)果顯示，應(yīng)用MALDI-TOF-IMS研究DAI大鼠腦組織內(nèi)差異蛋白的分布是可行的，為進一步篩選、鑒定和定位DAI蛋白標志物提供了重要線索。后續(xù)研究將進一步擴大樣品量，特別是系統(tǒng)分析這些蛋白標志物在不同損傷時間的變化特征和規(guī)律，對法醫(yī)病理學研究具有重要意義。

［1］ Hammoud DA，Wasserman BA.Diffuse axonal injuries：pathophysiology and imaging［J］.Neuroimaging Clin N Am，2002，12（2）：205-216.

［2］ Davceva N，Janevska V，Ilievski B，et al.Dilemmas concerning the diffuse axonal injury as a clinicopathological entity in forensic medical practice［J］. J Forensic Leg Med，2012，19（7）：413-418.

［3］劉寧國，陳憶九.MALDI-TOF-MS成像技術(shù)及其在法醫(yī)損傷標志物篩選中的應(yīng)用［J］.法醫(yī)學雜志，2014，30（5）：367-370.

［4］ Kriegsmann J，Kriegsmann M，Casadonte R.MALDI TOF imaging mass spectrometry in clinical pathology：a valuable tool for cancer diagnostics（review）［J］. Int J Oncol，2015，46（3）：893-906.

［5］ Caprioli RM，F(xiàn)armer TB，Gile J.Molecular imaging of biological samples：localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS［J］.Anal Chem，1997，69（23）：4751-4760.

［6］ Walch A，Rauser S，Deininger SO，et al.MALDI imaging mass spectrometry for direct tissue analysis：a new frontier for molecular histology［J］.Histochem Cell Biol，2008，130（3）：421-434.

［7］ Marmarou A，F(xiàn)oda MA，van den Brink W，et al. A new model of diffuse brain injury in rats.PartⅠ：Pathophysiology and biomechanics［J］.J Neurosurg，1994，80（2）：291-300.

［8］ Zheng W，Niu L，Zhang C，et al.Brain edema and protein expression of c-Fos and c-Jun in the brain after diffused brain injury［J］.Int J Clin Exp Pathol，2014，7（6）：2809-2817.

［9］Crooks DA.The pathological concept of diffuse axonal injury；its pathogenesis and the assessment of severity［J］.J Pathol，1991，165（1）：5-10.

［10］Lahm HW，Langen H.Mass spectrometry：a tool for the identification of proteins separated by gels［J］. Electrophoresis，2000，21（11）：2105-2114.

［11］Godovac-Zimmermann J，Brown LR.Perspectives for mass spectrometry and functional proteomics［J］.Mass Spectrom Rev，2001，20（1）：1-57.

［12］Boone DR，Sell SL，Hellmich HL.Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or singleneuronsforgeneexpressionanalysisafter traumatic brain injury［J］.J Vis Exp，2013，（74）.doi：10.3791/50308.

［13］Adams JH，Doyle D，F(xiàn)ord I，et al.Diffuse axonal injury in head injury：definition，diagnosis and grading［J］.Histopathology，1989，15（1）：49-59.

（本文編輯：鄒冬華）

Analysis of Differentially Expressed Proteins Distribution in the Rat Brains with DAI by MALDI-TOF-IMS

REN Guan-heng1，2，WENG Rong-hua3，SHI Yan1，HUANG Ping1，DENG Kai-fei1，LIU Ning-guo1，CHEN Yi-jiu1
（1.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Shanghai Forensic Service Platform，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R.China，Shanghai 200063，China；2.Department of Forensic Science，School of Basic Medicine Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；3.Chengxiang Branch of Putian Public Security Bureau，Putian 351100，China）

Objective To establish the imaging mass spectrometry for analysis of differentially expressed proteins distribution in the rat brains with diffuse axonal injury（DAI）based on matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight imaging mass spectrometry（MALDI-TOF-IMS）.Methods MALDITOF-IMS scanning were conducted on the brains of DAI group and control group in the m/z range of 1000 to 20000 using AutoflexⅢ MALDI-TOF spectrometer.ClinProTool 2.2 software was used for statistical analysis on the data of two groups，and then the differentially expressed proteins were picked out to conduct imaging.The distribution of the proteins with different m/z in the rat brains was observed. Results Five proteins with different m/z，including 4 963，5 634，6 253，6 714 and 7 532，differentially expressed in the rat brains with DAI.Conclusion MALDI-TOF-IMS can be used for studying the differentially expressed proteins in rat brains with DAI and the analysis method is established for exploring the distribution of differentially expressed proteins in the rat brains with DAI using imaging mass spectrometry. Key words：forensic pathology；diffuse axonal injury；mass spectrometry；matrix-assisted laser desorptionionization；brain stem；rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.04.001

1004-5619（2016）04-0241-04

國家自然科學基金資助項目（81273338、81273339、81571851）；中央級科研院所科研專項（GY2015G-2、GY2013Z-3）；上海市科委社會發(fā)展專項（14231202500）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項目（16DZ2290900）

任冠恒（1990—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病

理學研究；E-mail：rgh_0101@163.com

劉寧國，男，研究員，主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學研究；E-mail：liuningguo@foxmail.com

陳憶九，男，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法

醫(yī)病理學研究；E-mail：chenyj@ssfid.cn

2015-12-23）