牛流行熱病例的綜合診斷及預(yù)警防控

杜培杰　程子龍　劉瑋孟　王軍一　張 靜　王方昆　劉思當(dāng)*（山東省臨沂市畜牧站　2760372　山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院　山東 泰安　山東省臨沂市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心　山東省臨沂市羅莊區(qū)沂黨鎮(zhèn)政府）

牛流行熱病例的綜合診斷及預(yù)警防控

杜培杰①①程子龍①劉瑋孟③王軍一①張 靜④王方昆①劉思當(dāng)①*
（①山東省臨沂市畜牧站2760372①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東 泰安③山東省臨沂市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心④山東省臨沂市羅莊區(qū)沂黨鎮(zhèn)政府）

2015年9月山東某肉牛場(chǎng)從吉林一次性購牛300多頭，到場(chǎng)后先后出現(xiàn)30頭5月齡犢牛精神沉郁、食欲不振、高燒不退、咳嗽氣喘，起初治療效果不明顯，最終由于呼吸困難導(dǎo)致8頭犢牛死亡。通過病理剖檢、病理組織學(xué)觀察、分子生物學(xué)檢測(cè)，最終確診為牛流行熱繼發(fā)巴氏桿菌感染，該牛場(chǎng)做了充分的生物安全措施，控制了牛流行熱疫情。這是繼2013年以來山東地區(qū)又一次發(fā)現(xiàn)牛流行熱病例，引起了當(dāng)?shù)匦竽凉芾聿块T和牛場(chǎng)的高度重視并采取相應(yīng)的預(yù)警防控措施，未使疫情擴(kuò)散蔓延。

牛流行熱，是由牛流行熱病毒引起的一種牛和水牛的急性熱性傳染病，又名暫時(shí)熱、三日熱、僵硬病。本病的臨床特征為突發(fā)高熱、呼吸促迫、流淚、流泡沫性涎、消化機(jī)能障礙、全身虛弱、僵硬、跛行，多為良性經(jīng)過，大部分患病牛經(jīng)2～3d即可恢復(fù)正常［1］。該病傳播迅速，流行面廣，有一定的周期性，曾在我國(guó)多個(gè)省份多次發(fā)生流行，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降，乳品質(zhì)降低，役用牛跛行或癱瘓，部分懷孕牛流產(chǎn)，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展［2］。該病臨床病例常表現(xiàn)為流行熱繼發(fā)細(xì)菌感染，尤其是巴氏桿菌，特征為發(fā)病急、發(fā)病快，往往來不及治療就出現(xiàn)死亡，大部分病牛經(jīng)及時(shí)治療可以耐過，但部分病牛則很難治愈，轉(zhuǎn)為慢性肺炎，生長(zhǎng)緩慢。

1　臨床背景

山東菏澤某肉牛場(chǎng)從吉林地區(qū)一次性購牛300多頭，其中包括母牛、架子牛和犢牛，經(jīng)過25h的長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)竭_(dá)山東菏澤地區(qū)，到場(chǎng)后30頭5月齡的犢牛先后出現(xiàn)咳嗽、氣喘、持續(xù)高燒，體溫高達(dá)42℃，精神沉郁，食欲減退，起初治療效果不明顯，最終因呼吸困難而窒息死亡8頭犢牛。

2　診斷方法

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)把采取的肺臟、喉頭等病料，用平板劃線法［3］接種血瓊脂平板，放37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。挑取單個(gè)菌落，涂片，革蘭氏染色，油鏡下觀察。

2.2藥物敏感試驗(yàn)用圓紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法［4］進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，分別挑取單個(gè)菌落用滅菌的PBS稀釋，稀釋好后用涂布棒在血瓊脂平板上均勻涂布，然后均勻貼上頭孢噻呋鈉、鹽酸環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、乳酸恩諾沙星、慶大霉素、林可霉素、羅紅霉素藥敏片，于37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24h，觀察結(jié)果，根據(jù)藥物紙片周圍有無抑菌圈及其直徑大小，來判定該菌對(duì)各種藥物的敏感程度。

2.3病理組織學(xué)檢查取肺組織于10%福爾馬林溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

2.4分子生物學(xué)檢測(cè)按照病毒 RNA提取試劑盒說明書，從肺組織和喉頭黏液中提取病毒總RNA，用全式金一步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外照膠儀下觀察結(jié)果，分別檢測(cè)牛流行熱病毒、牛副流感Ⅲ型病毒。

3　結(jié)果

3.1剖檢病變剖檢其中的三頭病死牛后發(fā)現(xiàn)胸腔內(nèi)有大量淡黃色澄清積液，其中兩頭病牛胸腔內(nèi)有大量纖維素性滲出物，肺和胸腔粘連，肺暗紅色實(shí)變，并見嚴(yán)重的間質(zhì)性肺氣腫、水腫，肺間質(zhì)增寬，有大量膠凍樣滲出物（圖1A）；因喉頭黏膜顯著腫脹擠壓氣管導(dǎo)致氣管腔極度狹窄（圖1B左側(cè)為正常喉頭，右側(cè)喉頭黏膜顯著腫脹），形成典型的巴氏桿菌引起的“鎖喉風(fēng)”癥狀。

3.2細(xì)菌學(xué)及藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果從喉頭黏膜處分離到紅色的兩端鈍圓著色較深的的革蘭氏陰性菌（疑似巴氏桿菌）和藍(lán)紫色球形堆積成葡萄串狀的革蘭氏染色陽性菌（疑似葡萄球菌）如圖2。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離到的這些細(xì)菌對(duì)左氧氟沙星、乳酸恩諾沙星高敏，鹽酸環(huán)丙沙星、羅紅霉素中敏，頭孢噻呋鈉、慶大霉素、林可霉素不敏感。

圖2 油鏡下細(xì)菌形態(tài)

圖1　剖檢病變（A∶肺臟水腫，充滿膠凍樣滲出物；B∶喉頭黏膜腫脹）

3.3病理組織學(xué)病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺組織結(jié)構(gòu)破壞，肺組織中散在許多化膿灶，肺泡腔內(nèi)有大量纖維素性滲出物和中性粒細(xì)胞（圖3A）；細(xì)支氣管腔中充滿中性粒細(xì)胞、脫落的黏膜上皮細(xì)胞（圖3B）；肺化膿灶部位可見組織壞死崩解和大量浸潤(rùn)的嗜中性粒細(xì)胞，周圍被結(jié)締組織包繞形成包囊（圖3C）；有的化膿灶以細(xì)支氣管腔為中心，細(xì)支氣管腔內(nèi)有大量均質(zhì)紅染膿汁（圖3D）；大部分肺組織呈漿液性肺炎病變，肺泡腔內(nèi)充滿漿液性滲出物和淋巴細(xì)胞，并見肺泡性氣腫（圖3E）；小葉間淋巴管和支氣管高度擴(kuò)張（圖3F）；有的肺泡腔內(nèi)有漿液纖維素性滲出物，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3G）；肺間質(zhì)增寬、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3H）；支氣管周圍有大量漿液性滲出物和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔受擠壓皺縮（圖3I）。

圖3　病理組織學(xué)切片（A.肺泡腔內(nèi)纖維素滲出物和中性粒細(xì)胞200×；B.細(xì)支氣管腔內(nèi)充滿中性粒細(xì)胞、脫落的黏膜上皮細(xì)胞200×；C.化膿灶100×；D.以細(xì)支氣管腔為中心的化膿灶40×；E、F.漿液性肺炎及肺泡氣腫200×；G.肺泡腔內(nèi)漿液纖維素性滲出物，淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)200×；H.肺間質(zhì)水腫增寬100×；I.支氣管周圍大量漿液和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，支氣管腔受擠壓皺縮40×）

3.4分子生物學(xué)結(jié)果M為2000bp Marker，+、—分別為牛流行熱病毒陽、陰性對(duì)照，1、2是牛副流感Ⅲ型病毒，3、4是牛流行熱病毒，牛流行熱病毒的片段大小是524bp（圖4），從瓊脂糖凝膠電泳圖中可以看出牛副流感Ⅲ型病毒陰性，牛流性熱病毒陽性。

圖4　瓊脂糖凝膠電泳圖

3.5結(jié)論結(jié)合細(xì)菌學(xué)、病理組織學(xué)、分子生物學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果綜合判定，該病例的原發(fā)病為牛流行熱并繼發(fā)巴氏桿菌等細(xì)菌感染。

4　防控措施

（1）及時(shí)對(duì)病死牛進(jìn)行無害化銷毀處理，每天兩次對(duì)牛舍、水槽、料槽進(jìn)行全面徹底消毒，不留死角；密切關(guān)注牛群狀況，每天對(duì)全群牛進(jìn)行體溫測(cè)量，發(fā)現(xiàn)有咳嗽氣喘以及體溫升高的牛及時(shí)隔離觀察。（2）對(duì)疑似發(fā)病牛采取積極的治療措施，對(duì)咳嗽氣喘的牛用左旋氧氟沙星靜脈注射，肌肉注射慶大霉素或大觀霉素-林可霉素合劑，并配合應(yīng)用氨基比林，飲水中添加維生素C。另外，對(duì)未發(fā)病的牛尤其是周圍受到威脅的牛群緊急免疫流行熱滅活疫苗［5］。（3）該病確診后，及時(shí)向當(dāng)?shù)匦竽莲F醫(yī)局上報(bào)了疫情，業(yè)務(wù)部門對(duì)牛群疫情進(jìn)行了密切監(jiān)控，封鎖牛場(chǎng)，嚴(yán)禁流通，并對(duì)牛場(chǎng)內(nèi)外進(jìn)行全面嚴(yán)格的消毒，從而使該病得到了很好的控制，在周邊地區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)流行熱病例。此次在山東省菏澤地區(qū)發(fā)生的流行熱是繼2013年流行以來的再次發(fā)生［6］，引起了菏澤畜牧部門的足夠重視，對(duì)菏澤及周邊地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)及時(shí)通報(bào)了疫情，建議牛場(chǎng)密切關(guān)注牛群有無高熱等異常表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)異常情況，及時(shí)采取防控措施，從而防止了本病的傳播，減少了不必要的損失。（4）本次發(fā)生的流行熱疫情很顯然是因異地調(diào)牛而發(fā)生的輸入性病例，發(fā)病原因可能是該牛群本身攜帶流行熱病毒處在穩(wěn)定期或者潛伏期，經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸、環(huán)境改變等應(yīng)激因素誘發(fā)了本病的發(fā)生［7］。從未發(fā)病牛群中檢出該病是很困難的，何況異地調(diào)牛時(shí)一般都不進(jìn)行相關(guān)疫病的嚴(yán)格檢疫，這就為山東地區(qū)主要依賴從外地調(diào)牛育肥模式敲響了警鐘，應(yīng)盡量從本地繁育牛場(chǎng)調(diào)?；蛘甙l(fā)展自繁自養(yǎng)模式，避免“引狼入室”或因長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激而誘發(fā)牛的呼吸系統(tǒng)疫?。?］。

［1］Walker P J. Bovine ephemeral fever in Australia and the world［M］//The World of Rhabdoviruses. Springer Berlin Heidelberg， 2005∶57-80.

［2］Yeruham I， Van Ham M， Bar D， et al. Economic aspects of the 1999 outbreak of bovine ephemeral fever in dairy S cattle herds in the Jordan Valley in Israel［J］. Veterinary record， 2003， 153（6）∶ 180-182.

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［5］谷根林， 楊宗照， 蔣建一等. 牛流行熱疫苗對(duì)奶牛的免疫保護(hù)試驗(yàn)［J］. 杭州農(nóng)業(yè)科技， 2002， Z1∶ 88-89.

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［7］岳瑞超， 程子龍， 劉思當(dāng). 架子牛選購與運(yùn)輸技術(shù)［J］. 山東畜牧獸醫(yī)， 2014， 11∶ 14-15.

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S858.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

1007-1733（2016）08-0026-03

山東省牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（SDAIT-12-011-04）

2016-07-18）