水貂抗犬瘟熱病毒中和抗體滴度的測定

刁非非　趙永峰　姜常青　韓鎧懌　謝之景*　（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院　山東 泰安　271018　①山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　山東 泰安）

水貂抗犬瘟熱病毒中和抗體滴度的測定

刁非非①①趙永峰①①姜常青①①韓鎧懌①①謝之景①①*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院山東 泰安271018①山東省動(dòng)物生物工程與疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東 泰安）

為了解當(dāng)前犬瘟熱疫苗及免疫程序的在水貂的免疫效果，該研究在6個(gè)水貂養(yǎng)殖場，隨機(jī)對(duì)CD疫苗免疫接種后55～60d的水貂進(jìn)行心臟采血，共采集、制備84份血清。采用血清微量中和試驗(yàn)，測定84份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度。結(jié)果表明，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度為94，占1.2%，其余83份血清樣品中的抗CDV中和抗體滴度小于10，達(dá)98.8%。

水貂犬瘟熱病毒中和抗體

當(dāng)前水貂CD疫苗免疫程序的免疫效果很差，這是造成在水貂養(yǎng)殖過程中CD流行的重要因素，因此研究制定科學(xué)水貂CD疫苗免疫接種程序成為當(dāng)務(wù)之急。犬瘟熱（Canine Distemper，CD）是由犬瘟熱病毒（Canine Distemper virus，CDV）引起犬科、鼬科、和浣熊科等動(dòng)物的一種急性、高度接觸性傳染性疾病［1］。CDV是副粘病毒科麻疹病毒屬的成員，病毒粒子呈多形性，多數(shù)呈球形，直徑大多數(shù)在150～300nm之間，為負(fù)鏈單股不分節(jié)的RNA病毒，只有一個(gè)血清型。目前CDV自然感染的動(dòng)物范圍在不斷擴(kuò)大，除犬科外，人們又發(fā)現(xiàn)了許多CDV的新宿主，例如鼬科的雪貂、水貂，浣熊科的小熊貓、浣熊，貓科的貓、獅、孟加拉虎、豹，大熊貓科的大熊貓，偶蹄目豬科的豬，日本獼猴和人等。

CD在世界各地均有分布，所有養(yǎng)犬和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的國家均有CD的發(fā)生。CD疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了CDV的流行［2，3］，但是在實(shí)際生產(chǎn)過程中仍有許多疑似CDV感染的病例。CD在我國廣泛存在，我國部分省市的皮毛動(dòng)物特別是水貂飼養(yǎng)場不斷有CD病例的出現(xiàn)，給養(yǎng)殖戶造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。造成免疫失敗的原因較多，但其確切原因尚不清楚，其中疫苗免疫效果不好是造成免疫失敗的一個(gè)重要原因。目前，有關(guān)CD疫苗免疫接種的效果尚不清楚，為此該研究對(duì)水貂血清中抗CDV中和抗體滴度進(jìn)行了測定，為進(jìn)一步研究科學(xué)的水貂CD疫苗接種程序提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本研究具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

1　材料和方法

1.1毒株與細(xì)胞CDV-M1本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存，MDCK細(xì)胞由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局胡傳偉研究員惠贈(zèng)。

1.2血清樣品在諸城、東平、文登三地6個(gè)水貂養(yǎng)殖場，這6個(gè)水貂養(yǎng)殖場均對(duì)水貂進(jìn)行了1次CD疫苗免疫接種，隨機(jī)對(duì)CD疫苗免疫接種后55～60d的水貂進(jìn)行心臟采血，制備血清，共84份，置-20℃凍存，待檢。

1.3中和抗體效價(jià)的測定采用血清微量中和試驗(yàn)測定水貂血清抗CDV中和抗體效價(jià)。采用固定病毒—稀釋血清法［4］，在96孔微量細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行。首先將血清樣品置56℃水浴30min，滅活血清中非特異性病毒抑制成分，隨后將血清樣品中加入終濃度為0.025%恩諾沙星，10000r/min離心10min，去除可能的細(xì)菌污染物。先將血清稀釋成1∶10，再作2倍連續(xù)稀釋（共8個(gè)稀釋度）。隨后分別加入等量含100TCID50的病毒懸液。經(jīng)25℃、2h感作后，分別加入96孔板，每個(gè)稀釋度加4孔，每孔加100ul。然后將分散并稀釋成2.5～3.0×106個(gè)/ml的MDCK細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔加50ul，置5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)（37℃，60%～80%濕度）培養(yǎng)。同時(shí)設(shè)血清毒性對(duì)照，陰陽性血清對(duì)照，病毒對(duì)照及正常細(xì)胞對(duì)照。4d判定結(jié)果，以每孔完全不出現(xiàn)蜘蛛樣的融合性細(xì)胞病變作為中和陽性標(biāo)準(zhǔn)，以出現(xiàn)中和陽性的血清最高稀釋滴度為中和終點(diǎn)，按Reed-Muench法計(jì)算血清的中和抗體效價(jià)，以其倒數(shù)作為水貂血清中抗CDV中和抗體滴度。

2　結(jié)果

在84份水貂血清中，只有1份水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度為94，占1.2%，其余83份血清樣品中的抗CDV中和抗體滴度小于10，達(dá)98.8%，見表1?？笴DV中和抗體滴度大于50，則動(dòng)物對(duì)CDV具有很好的免疫抵抗力，在所檢測的水貂血清樣品中，疫苗免疫合格率僅為1.2%。這表明水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度很低，水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的CD免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很好的抗體水平。

表1　水貂抗CDV中和抗體滴度

3　討論

（1）山東省是水貂養(yǎng)殖大省，盡管CD疫苗的應(yīng)用在一定程度上控制了CDV在水貂的流行，但是近年來，在實(shí)際生產(chǎn)過程中CDV的發(fā)病率越來越高，有時(shí)呈地方流行，給我省水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。造成免疫失敗的原因較多，但其確切原因尚不清楚。但是疫苗免疫效果不確實(shí)是造成免疫失敗的一個(gè)重要原因。（2）中和抗體是當(dāng)病原微生物侵入機(jī)體時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，是B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫應(yīng)答細(xì)胞分泌的一種可溶性蛋白。病原微生物入侵細(xì)胞時(shí)需要依賴病原體自身表達(dá)的特定分子與細(xì)胞上的受體結(jié)合，才能感染細(xì)胞，并進(jìn)一步擴(kuò)增。中和抗體是在病毒進(jìn)入細(xì)胞之前破壞病毒的，能夠與病原微生物表面的抗原結(jié)合，從而阻止該病原微生物黏附靶細(xì)胞受體，破壞病毒顆粒，防止侵入細(xì)胞。中和抗體是抗病毒免疫的主要因素，也是疫苗免疫效果的重要檢測指標(biāo)之一?？笴DV中和抗體對(duì)于水貂抵抗CDV的感染是十分重要的。為了了解水貂CD疫苗的免疫效果，該研究對(duì)水貂血清中的抗CDV中和抗體水平進(jìn)行了檢測。（3）抗CDV中和抗體滴度大于50，則動(dòng)物對(duì)CDV具有很好的免疫抵抗力，但檢測結(jié)果表明，水貂血清中抗CDV的中和抗體滴度很低，98.8%的水貂血清中抗CDV中和抗體滴度小于10，只有僅為1.2%的水貂血清中抗CDV中和抗體滴度大于50。這表明水貂養(yǎng)殖企業(yè)所采用的CD免疫程序不合理，不能夠誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生很好的抗體水平，這是造成CDV流行的重要因素。為此，應(yīng)加強(qiáng)水貂CD疫苗免疫程序的研究，減少因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失。

［1］Gassen U， Collins FM， Duprex WP， et al. Establishment of a rescue system for canine distemper virus. J Virol 2000 Nov； 74（22）∶ 10737-44.

［2］Franke-V； Matern-B； Ackermann-O； et al.The prevention of distemper in zoo animals. Berl-Munch-Tierarztl-Wochenschr. 1989 Feb 1； 102（2）∶56-8.

［3］Tizard-I. Grease， anthraxgate， and kennel cough∶ a revisionist history of early veterinary vaccines. Adv-Vet-Med. 1999； 41∶ 7-24.

［4］楊篤寶， 雷留真， 謝之景等. 幼狐犬瘟熱母源抗體消長規(guī)律的測定［J］. 山東畜牧獸醫(yī). 2009， 8∶ 9-10

S852.65+5

A

1007-1733（2016）08-0012-02

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-21-07）。

2016-05-11）