響應(yīng)面法優(yōu)化酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的工藝研究

楊賢慶,吳　靜,2,胡　曉,李來(lái)好,吳燕燕,林婉玲,黃　卉,裘超穎,馬海霞

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306)

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響應(yīng)面法優(yōu)化酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的工藝研究

楊賢慶1,吳靜1,2,胡曉1,李來(lái)好1,吳燕燕1,林婉玲1,黃卉1,裘超穎1,馬海霞1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所,農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510300;2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306)

利用響應(yīng)面分析法對(duì)酶法水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)最終確定木瓜蛋白酶為水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的最佳用酶,然后在單因素的基礎(chǔ)上以加酶量、液料比、酶解時(shí)間為自變量,DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,建立二次回歸設(shè)計(jì)模型,經(jīng)修正后得到最佳酶解條件為:加酶量為0.66%(w/w),液料比為10.2(v/w),酶解時(shí)間為380 min,在此條件下DPPH自由基清除率為89.80%,與模型預(yù)測(cè)值相吻合。另外,氨基酸分析表明與鳶烏賊蛋白相比,優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物中必需氨基酸含量提高至原蛋白的2.2倍,蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸分別提高至7.2、25.6倍。

鳶烏賊,酶解,響應(yīng)面法,抗氧化肽,氨基酸

鳶烏賊屬柔魚(yú)科鳶烏賊屬,廣泛分布在印度洋、太平洋的赤道和亞熱帶海域中,其中南海和印度洋西北部海域分布數(shù)量較大[1]。我國(guó)南海鳶烏賊資源豐富,年捕撈量為130～200萬(wàn) t[2]。鳶烏賊作為一種高蛋白低脂肪的海產(chǎn)品,由于肉質(zhì)較硬,不合大眾口味,導(dǎo)致其鮮銷(xiāo)量較少[3-4]。近年來(lái)捕獲的鳶烏賊主要制成魷魚(yú)絲外銷(xiāo),資源利用率較低,經(jīng)濟(jì)價(jià)值未被充分挖掘[5]。因此,將鳶烏賊水解,并將其制備成抗氧化活性肽應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域,可提高鳶烏賊的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,開(kāi)辟鳶烏賊蛋白新的利用途徑。

目前在功能性肽的制備方法上,酶解法與溶劑提取法、合成法等相比,酶解法因具有反應(yīng)條件溫和、不產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物、無(wú)消旋與氨基酸破壞現(xiàn)象、無(wú)污染、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)而備受人們青睞[6-7]。本研究以鳶烏賊為原料,探討了不同蛋白酶、加酶量、液料比和酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響,應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解制備鳶烏賊抗氧化肽的工藝,并分析了鳶烏賊蛋白和優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物中氨基酸組成及比例,旨在為酶解鳶烏賊蛋白制備功能性肽提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鳶烏賊中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所漁船捕撈;胰蛋白酶(≥250 U/mg)、木瓜蛋白酶(≥800 U/mg)、中性蛋白酶(≥100 U/mg)、復(fù)合蛋白酶(≥120 U/mg)廣州市齊云生物科技公司;Alcalase 2.4L蛋白酶(21萬(wàn)AU/g)丹麥諾維信公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國(guó)sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

榨汁機(jī)德國(guó)博朗公司;電子天平德國(guó)Sartorius公司;DS-1高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;Delta320精密pH計(jì)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-S24型恒溫水浴鍋上海森信實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;THZ-82水浴恒溫振蕩器精達(dá)儀器制造有限公司;Kjeltel2300凱氏定氮儀丹麥FOSS儀器有限公司;3K30型高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Sigma公司;ALPHA1-4冷凍干燥機(jī)德國(guó)Christ公司;Akku-drive電位滴定儀德國(guó)赫施曼公司;日立L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀日本;Synergy H1型酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品前處理將鳶烏賊去頭、內(nèi)臟、裙邊和皮,洗凈、瀝干后絞碎,于-20 ℃冰箱中貯存待用。

1.2.2單酶的篩選分別采用胰蛋白酶、Alcalase 2.4 L蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶在其最適pH和溫度下,以液料比為8(v/w),加酶量為0.5%(w/w)的條件下酶解4 h,酶解完成后將酶解液置于100 ℃沸水浴中滅酶10 min,冷卻、離心后過(guò)濾,收集濾液冷凍干燥后,測(cè)定其抗氧化活性、水解度以及其氨基酸組成分析。酶解條件見(jiàn)表1。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選的酶類(lèi)主要考察加酶量、液料比、酶解時(shí)間對(duì)鳶烏賊蛋白酶解工藝的影響。

表1　不同蛋白酶酶解實(shí)驗(yàn)條件

1.2.3.1液料比對(duì)酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以液料比(v/w)分別為6、8、10、12、14,加酶量為0.5%的條件下酶解4 h,然后將酶解液置于100 ℃沸水浴中滅酶10 min,冷卻、離心后過(guò)濾,收集濾液冷凍干燥后,測(cè)定其DPPH自由基清除率。

1.2.3.2加酶量對(duì)酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以加酶量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%,液料比(v/w)為8的條件下酶解4 h,其他處理?xiàng)l件同1.2.3.1,測(cè)定其DPPH自由基清除率。

1.2.3.3酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響在蛋白酶的最適pH和溫度下,以酶解時(shí)間分別為2、4、6、8、10 h,液料比(v/w)為8,加酶量為0.5%的條件下進(jìn)行酶解,其他處理?xiàng)l件同1.2.3.1,測(cè)定其DPPH自由基清除率。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇液料比、加酶量、酶解時(shí)間3個(gè)因素作為響應(yīng)變量,分別記為A、B、C,以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,應(yīng)用Box-Behnken中心組合進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面分析因素水平表

1.2.5氨基酸組成分析參照國(guó)標(biāo)GB/T 5009.124-2003。

1.2.6抗氧化活性的測(cè)定

1.2.6.1DPPH自由基清除率的測(cè)定參照Aewsiri[8]等人方法稍做修改,將樣品濃度配成10 mg/mL,實(shí)驗(yàn)組取0.5 mL樣液,加入0.5 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液(用95%的乙醇溶解),對(duì)照組為0.5 mL 95%的乙醇溶液代替DPPH溶液,空白組為0.5 mL DPPH溶液加上0.5 mL 95%的乙醇溶液,混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min,于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,按公式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率。

表3　不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性及水解度

注：同列標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示同一指標(biāo)下不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物間有顯著性差異(p<0.05),標(biāo)有相同字母表示同一指標(biāo)下不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物間無(wú)顯著性差異(p>0.05)。>

式(1)

式中:A0為空白組吸光度;Ai為樣品組吸光度;Aj為對(duì)照組吸光度。

1.2.6.2·OH清除率的測(cè)定參照馬賽蕊、王晶[9-10]等人的方法并稍做修改,取0.3mL5mmol/L鄰二氮菲乙醇溶液加0.2mLpH6.6的磷酸鹽緩沖液和0.3mL0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液,樣品管Ai加入1mL濃度為10mg/mL樣液和0.2mL0.1%H2O2,損傷管Aj加入1mL蒸餾水和0.2mL0.1%H2O2,未損傷管Ao加入1.2mL蒸餾水,在37 ℃條件下水浴60min,然后在536nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品管、損傷管、未損傷管的吸光度Ai、Aj、Ao。按公式(2)計(jì)算·OH清除率。

式(2)

1.2.6.3還原力的測(cè)定參照Naourez Ktari[11]等人的方法稍做修改,取1 mL濃度10 mg/mL樣液加入1 mL pH7.4磷酸緩沖鹽溶液和1 mL 1%鐵氰化鉀混勻后50 ℃水浴20 min,再加1 mL 10%三氯乙酸后離心(10000 r/min,10 min,4 ℃),取1 mL上清液,加入1 mL蒸餾水和0.2 mL 0.1%氯化鐵后50 ℃水浴10 min,在波長(zhǎng)為700 nm處測(cè)定其吸光度,記錄吸光值。

1.2.7水解度測(cè)定原料中總氮含量采用半微量凱氏定氮法,酶解液中氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法測(cè)定[12]。

2　結(jié)果與分析

2.1單酶的篩選

2.1.1不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物的抗氧化活性及水解度由表3可知,不同蛋白酶對(duì)鳶烏賊蛋白酶解的效果存在顯著性的差異(p<0.05),就水解度而言,復(fù)合蛋白酶的酶解效果最好,水解度達(dá)到21.35%±0.46%。其次是Alcaese2.4L蛋白酶和中性蛋白酶,水解效果較差的是胰蛋白酶和木瓜蛋白酶,分別為10.84%±0.49%和7.88%±0.35%。就抗氧化活性活性而言,木瓜蛋白酶的DPPH自由基清除率、·OH清除率、還原力都是最高的,其次是中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶,酶解液抗氧化活性較低的是胰蛋白酶和Alcaese2.4L蛋白酶。復(fù)合蛋白酶和Alcaese2.4L蛋白酶屬微生物蛋白酶,前者具有內(nèi)切和外切蛋白酶的特性,后者是一種非特異性蛋白質(zhì)肽鍵內(nèi)切酶;而胰蛋白酶是一種動(dòng)物來(lái)源的蛋白酶,對(duì)變性蛋白的水解效果較好;木瓜蛋白酶是一種含巰基肽鏈的植物蛋白酶,水解特異性較低[13-14]。不同酶的酶切位點(diǎn)的專(zhuān)一性和酶自身的特異性會(huì)導(dǎo)致酶解產(chǎn)物中肽段分子量的大小以及氨基酸的組成和序列,最終導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化活性大小不同。

2.1.2不同蛋白酶酶解液氨基酸組成分析由表4可知酶解產(chǎn)物中含有17種氨基酸,五種不同蛋白酶酶解產(chǎn)物中苯丙氨酸、賴(lài)氨酸含量都較高,與其他氨基酸含量存在極顯著的差異性(p<0.01),除木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解產(chǎn)物外,亮氨酸含量也較高,都占總氨基酸的10%以上。酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量最高的是木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物,達(dá)到73.66%,其次是中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,含量最低的是胰蛋白酶酶解產(chǎn)物,其含量?jī)H為 46.65%。多肽的抗氧化活性的強(qiáng)弱與氨基酸的種類(lèi)、組成、疏水性以及其在肽鏈中的位置有關(guān)[15]。芳香性氨基酸能作為質(zhì)子供體而清除自由基,組氨酸上的咪唑環(huán)具有螯合金屬離子、捕獲自由基的能力,含疏水性氨基酸的多肽能抑制脂質(zhì)中氫的釋放或與氧結(jié)合,起到抗氧化作用,其含量與抗氧化能力呈正相關(guān)性[16]。此外,必需氨基酸含量比較高的是木瓜蛋白酶和中性蛋白酶酶解產(chǎn)物,因此其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值比較高。在制備抗氧化肽時(shí),應(yīng)選擇水解度高,抗氧化活性強(qiáng)的蛋白酶進(jìn)行酶解,結(jié)合表3、表4可知中性蛋白酶水解度較高,且必需氨基酸含量較高,木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物抗氧化活性最高,因此選擇中性蛋白酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的單因素實(shí)驗(yàn)。

表4　不同蛋白酶酶解液氨基酸的組成及比例

2.2酶解制備抗氧化肽的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1液料比對(duì)酶解工藝的影響由圖1可知,木瓜蛋白酶的DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),而中性蛋白酶在液料比為6時(shí)DPPH自由基清除率就達(dá)到了最大,這說(shuō)明了不同的酶對(duì)底物濃度的要求不一樣。液料比越大,底物濃度越小,底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)越少,反應(yīng)速度越慢;但液料比太小時(shí),反應(yīng)速度也會(huì)較慢,這是因?yàn)橐毫媳忍r(shí),溶液較為粘稠,流動(dòng)性較差,影響酶與底物的結(jié)合[17]。

圖1　不同液料比的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.1　Effect of liquid-material ratio on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.2加酶量對(duì)酶解工藝的影響由圖2可知,兩種酶的DPPH自由基清除率隨加酶量的增加都呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢(shì),且在加酶量0.7%時(shí)達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí),不同的加酶量會(huì)影響體系反應(yīng)速率,當(dāng)加酶量較少時(shí),與底物結(jié)合的酶分子較少,反應(yīng)速度較慢,當(dāng)加酶量逐漸增加時(shí),與底物結(jié)合的酶分子也越來(lái)越多,反應(yīng)速度會(huì)加快,當(dāng)加酶量達(dá)到一定值時(shí),酶與底物基本飽和,過(guò)多的酶反而會(huì)影響體系反應(yīng)速度[18]。

圖2　不同加酶量的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.2　Effect of enzyme amount on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

2.2.3酶解時(shí)間對(duì)酶解工藝的影響由圖3可知,隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),DPPH自由基清除率先升高后降低,在6 h左右達(dá)到最大。酶解時(shí)間太短,酶與底物作用不夠充分,所得到的產(chǎn)物中大分子的肽較多,具有抗氧化活性的殘基未能暴露出來(lái),抗氧化活性較弱;酶解時(shí)間太長(zhǎng),會(huì)導(dǎo)致水解過(guò)度,產(chǎn)物多為游離氨基酸,抗氧化活性也較弱[19]。

圖3　不同酶解時(shí)間的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.3　Effect of enzymolysis time on DPPH radical scavenging activity of hydrolysates

由圖1、圖3可知木瓜蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率在同一液料比和酶解時(shí)間下都比中性蛋白酶要高,且最大值也高于中性蛋白酶。雖然加酶量在0.1%～0.5%之間時(shí),中性蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率要高于木瓜蛋白酶,但隨著加酶量的增加,木瓜蛋白酶酶解物的DPPH自由基清除率又高于中性蛋白酶。在制備抗氧化肽的過(guò)程中主要選擇酶解物抗氧化活性較高的酶,因此綜合考慮來(lái)看選擇木瓜蛋白酶來(lái)酶解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表6　回歸方程的方差分析

注:表中*代表顯著,p<0.05;**代表極顯著,p<0.01。

2.3酶解制備抗氧化肽響應(yīng)面的優(yōu)化工藝

2.3.1響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果在單因素的基礎(chǔ)上,以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值,運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件編碼單位對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三因素三水平的響應(yīng)設(shè)計(jì)見(jiàn)表5,實(shí)驗(yàn)共有17組,其中包含12個(gè)析因點(diǎn)和五個(gè)零點(diǎn),這五個(gè)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)做為誤差估計(jì)。

表5　響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.3.2回歸方程的建立與方差分析根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值利用軟件對(duì)表5進(jìn)行分析,得到的二次多元回歸擬合方程如下:

DPPH自由基清除率(%)=90.56+0.85A-1.46B+0.75C+1.65AB-0.9AC+0.75BC-1.91A2-3.27B2-1.39C2

由表6可見(jiàn),一次項(xiàng)B、二次項(xiàng)A2、B2對(duì)DPPH自由基清除率影響極顯著(p<0.01),A、AB、C2項(xiàng)對(duì)DPPH自由基清除率也有顯著影響(p<0.05),其余項(xiàng)不顯著,這表明實(shí)驗(yàn)因素對(duì)DPPH自由基清除率的影響不是線(xiàn)性關(guān)系,而是存在一定的交互作用。從各因子、二次、交互作用綜合來(lái)看,三個(gè)因素對(duì)DPPH清除率的影響依次為B>A>C。

2.3.3響應(yīng)曲面結(jié)果分析從圖中等高線(xiàn)可以看出,圖4等高線(xiàn)基本呈現(xiàn)為橢圓,表明AB的交互作用影響較大,另外三維曲面圖也可以很直觀地反映兩個(gè)因素之間的交互作用。由圖4可以看出固定加酶量,改變液料比,呈現(xiàn)平滑的弧線(xiàn),而固定液料比,改變加酶量,曲線(xiàn)較為陡峭。曲線(xiàn)越陡,表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大,曲線(xiàn)越平滑,表明該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越小,因此加酶量對(duì)DPPH自由基清除率的影響比料液比大,這與模型分析結(jié)果相吻合。由圖5可以看出固定酶解時(shí)間,改變加酶量時(shí),DPPH自由基清除率在加酶量較低時(shí)變化較為平緩,當(dāng)逐漸增大加酶量0.7%～0.9%時(shí)呈現(xiàn)出滑低現(xiàn)象,可能是酶和底物已經(jīng)達(dá)到了相對(duì)飽和的狀態(tài),過(guò)多的蛋白酶可能會(huì)影響酶解反應(yīng)速度,而時(shí)間的變化對(duì)響應(yīng)值的影響并不大。由圖6可以看出,與圖4、圖5相比,液料比和時(shí)間對(duì)DPPH自由基清除率的影響要小于加酶量對(duì)其的影響,該結(jié)論與表6回歸方程的方差分析結(jié)果相一致。

圖4　加酶量和液料比對(duì)響應(yīng)值的影響Fig.4　Effect of enzyme amountand liquid-material ratio on response value

圖5　加酶量和酶解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響Fig.5　Effect of enzyme amountand enzymolysis time on response value

圖6　液料比和酶解時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響Fig.6　Effect of liquid-material ratioand enzymolysis time on response value

2.3.4模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到的木瓜蛋白酶水解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的最優(yōu)水解條件為液料比10.21(v/w),加酶量0.66%,時(shí)間382.8 min,此時(shí)預(yù)測(cè)的響應(yīng)值為90.81%。將酶解條件修正為液料比10.2(v/w),加酶量0.66%,酶解時(shí)間380 min,在此條件下所得實(shí)際DPPH自由基清除率為89.80%,與理論值相比相對(duì)誤差在0.71%,說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解鳶烏賊蛋白制備抗氧化肽的工藝是準(zhǔn)確可靠的。

2.4氨基酸組成分析

鳶烏賊蛋白和優(yōu)化后酶解產(chǎn)物中氨基酸組成及比例如表7所示,鳶烏賊蛋白中谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、天冬氨酸所占比例較高,但經(jīng)木瓜蛋白酶酶解的產(chǎn)物中這幾種氨基酸的含量發(fā)生了顯著性變化,且苯丙氨酸、賴(lài)氨酸、蛋氨酸所占比例較高。優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物中必需氨基酸含量高于鳶烏賊蛋白,這說(shuō)明了酶解產(chǎn)物也具有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,該結(jié)論與劉賀[20]等人對(duì)扁杏仁水解蛋白的抗氧化活性及分子組成特性研究相一致。另外,優(yōu)化后酶解產(chǎn)物中疏水性氨基酸含量是鳶烏賊蛋白的1.8倍左右,必需氨基酸是原來(lái)的2.2倍，蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸所占比例大幅度提高，分別提高至原來(lái)的7.2、25.6倍。

表7　氨基酸的組成及比例

3　結(jié)論

本研究比較了五種不同蛋白酶在同一條件下的酶解,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中性蛋白酶水解度最高,木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物抗氧化活性最高。單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)木瓜蛋白酶水解后的產(chǎn)物在不同的液料比、酶解時(shí)間條件下抗氧化活性都高于中性蛋白酶。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到木瓜蛋白酶酶解鳶烏賊制備抗氧化肽的最佳工藝條件是液料比10.20(v/w),加酶量0.66%,酶解時(shí)間380 min,驗(yàn)證結(jié)果表明該模型與實(shí)際擬合程度較好,具有很好的預(yù)測(cè)能力。同時(shí)氨基酸分析結(jié)果表明在此條件下酶解產(chǎn)物具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,與鳶烏賊蛋白相比,優(yōu)化后的酶解產(chǎn)物中必需氨基酸含量提高至原來(lái)的2.2倍,蛋氨酸、色氨酸等抗氧化性氨基酸含量分別提高至原來(lái)的7.2、25.6倍。

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Optimization of enzymatic preparation of antioxidant peptides from purpleback flying squid(sthenoeuthisoualaniensis)protein by response surface methodology

YANG Xian-qing1,WU Jing1,2,HU Xiao1,LI Lai-hao1,WU Yan-yan1,LIN Wan-ling1,HUANG Hui1,QIU Chao-ying1,MA Hai-xia1

(1.Key Lab of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture;National R&D Center for Aquatic Product Processing;South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences;Guangzhou 510300,China;2. College of Food Science and Engineering,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

Response surface methods were used to optimize the hydrolysis conditions of purpleback flying squid(Sthenoeuthisoualaniensis)for production of antioxidant peptides. Papain was the optimum enzyme selected by the single-factor tests. Based on the single-factor tests,enzyme amount,liquid-material ratio and hydrolysis time were determined by single-factor tests as independent variables,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging activity as the response value. The model of quadratic regression design was established. The hydrolysis conditions were adjusted to that enzyme amount was 0.66%(w/w),liquid-material ratio was 10.2(v/w),hydrolysis time was 380 min. Under such conditions,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)radical scavenging activity was 89.80%. The result was consistent with the model prediction. In addition,amino acid analysis showed that compared with purpleback flying squid protein,the content of essential amino acids of enzymatic hydrolysis product was increased to 2.2 times,antioxidative amino acids such as methionine and tryptophan was increased to 7.2,25.6 times,respectively.

purpleback flying squid;enzymatic hydrolysis;response surface methodology;antioxidant peptides;amino acid

2015-11-16

楊賢慶(1963-),男,本科,研究員,從事水產(chǎn)品加工及貯藏研究,E-mail:yxqgd@163.com。

農(nóng)業(yè)部財(cái)政重大專(zhuān)項(xiàng)(NFZX2013);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-49);“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD28B06);國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(31301454);廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)(A201401C02);廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021100013);中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2012TS03)。

TS254.9

B

1002-0306(2016)11-0242-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.041