光裸方格星蟲纖溶活性蛋白的提取及抗氧化活性研究

李映新,李肖肖,劉金遠,姚佩珊,顏　池,雷丹青

(1.廣西醫(yī)科大學藥學院,廣西南寧 530021;2.廣西桂東人民醫(yī)院藥劑科,廣西梧州 543001;3.廣西醫(yī)科大學全科醫(yī)學院,廣西南寧 530021;4.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,廣西南寧 530021;5.廣西醫(yī)科大學蛇毒研究所,廣西南寧 530021)

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光裸方格星蟲纖溶活性蛋白的提取及抗氧化活性研究

李映新1,李肖肖2,劉金遠3,姚佩珊4,顏池4,雷丹青5,*

(1.廣西醫(yī)科大學藥學院,廣西南寧 530021;2.廣西桂東人民醫(yī)院藥劑科,廣西梧州 543001;3.廣西醫(yī)科大學全科醫(yī)學院,廣西南寧 530021;4.廣西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,廣西南寧 530021;5.廣西醫(yī)科大學蛇毒研究所,廣西南寧 530021)

方格星蟲,提取,纖溶活性,抗氧化

海洋無脊椎動物光裸方格星蟲(SipunculusNudus),俗稱沙蟲、沙腸子,屬星蟲科,在我國沿海地區(qū)均有分布,其中以廣西北部灣資源最為豐富,其肉質鮮美,具有很高的營養(yǎng)和食療價值,被稱為“海洋冬蟲夏草”[1]。雖然有研究表明,光裸方格星蟲體內富含蛋白質、氨基酸、多糖等多種活性物質,具有抗疲勞、延緩衰老、增強免疫力、滋陰降火以及清肺化痰等功效[2-4],但國內外對方格星蟲的活性成分及其他藥用價值的報道很少。本文采用硫酸銨分級沉淀法從光裸方格星蟲全蟲勻漿液中提取纖溶活性蛋白組份,并采用多個體外氧化體系對該組份的抗氧化還原能力進行研究,為綜合開發(fā)方格星蟲的藥用和保健價值提供一定實驗數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

光裸方格星蟲購于本地海鮮市場;凍干人纖維蛋白原上海萊士血制品有限公司;凝血酶(200U)河南中泰藥業(yè)有限公司;二苯代苦味?；?DPPH)購于Sigma公司;所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

ME204電子天平梅特勒托利多公司;HH-2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋江蘇金壇友聯(lián)儀器研究所;EL20K酸度計梅特勒托利多公司;UV-1240紫外-可見分光光度計日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1方格星蟲纖溶活性蛋白組份的提取參考王佃亮等人方法[5]并加以改進。方格星蟲全蟲用雙蒸水洗凈,勻漿,以3倍體積PBS緩沖液(0.02 mol/L,pH7.5)在4 ℃條件下抽提。6 h后,抽提液在4 ℃下8000 r/min離心30 min,所得上清液取等量于8支離心管,分別加入硫酸銨至 10%～80%的飽和度,4 ℃靜置 6 h后離心30 min(6000 r/min),收集每個飽和度對應的上清液和沉淀,參照文獻[6]制備纖維蛋白平板,分別檢測上清液和沉淀的纖溶活性,并按照透明溶圈的面積與纖溶酶活力成正比,測定并計算各梯度硫酸銨鹽析所得沉淀的平板溶圈面積,以面積最大者為100%,計算各溶圈面積的相對值,繪制硫酸銨分級鹽析曲線。按照確定的提取條件提取方格星蟲纖溶活性組份一批,透析除鹽并冷凍干燥,用于進行抗氧化活性測定。

1.2.2抗氧化活性的研究

1.2.2.1還原能力測定采用普魯士藍法[7]。取不同濃度1 mL纖溶蛋白水溶液于試管中,分別加入1 mL PBS(pH6.6)及1 mL的1%鐵氰化鉀溶液混合后,在50 ℃水浴中反應20 min,迅速冷卻并入1 mL的10%三氯乙酸(w/w),3000 r/min離心10 min,取上清2.5 mL加入0.5 mL的0.1% 三氯化鐵溶液(w/w),混勻并靜置10 min后,測定700 nm處的吸光度。

1.2.2.2DPPH·清除能力的測定參照文獻[8-9]并改進。取不同濃度2 mL纖溶蛋白水溶液于試管中,加入0.04 mg/mL DPPH無水乙醇溶液2 mL,混勻后在室溫下避光反應30 min;對照組以等體積蒸餾水代替樣品溶液,空白組以等體積無水乙醇代替DPPH,各組均以等體積蒸餾水和無水乙醇混合液做空白調零,在517 nm處測定反應產(chǎn)物吸光度,計算清除率。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:A0-對照組吸光度;Ai-樣品組吸光度;Aj-空白組吸光度。

1.2.2.3清除羥基自由基(·OH)活性測定采用鄰二氮菲比色法[10-11]。取不同濃度1 mL纖溶蛋白水溶液于試管中,分別加入7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.5 mL,PBS(pH7.4)5 mL,7.5 mmol/L硫酸亞鐵1.5 mL混勻,最后加入0.01%的過氧化氫溶液2 mL,混勻后于37 ℃孵育60 min,在510 nm波長下測其吸光度。損傷組以等體積蒸餾水代替樣品液;空白組以蒸餾水代替樣品液和過氧化氫。根據(jù)下式求出不同濃度樣品對于羥基自由基(·OH)的清除率。

·OH 清除率(%)=(A樣-A損)/(A0-A損)×100

式中:A損-損傷組吸光度;A樣-樣品組吸光度;A0-空白組吸光度。

抑制率(%)=(V對照-V樣品)/V對照×100

式中:V對照-對照組鄰苯三酚自氧化速率(ΔOD/min);V樣品-樣品組鄰苯三酚自氧化速率(ΔOD/min)。

2　結果與討論

2.1硫酸銨飽和度對提取效果的影響

上清液經(jīng)10%～80%飽和度硫酸銨鹽析,纖維蛋白平板法測定結果見圖1,硫酸銨鹽析曲線見圖2。結果顯示,硫酸銨分級鹽析在梯度30%以前時,沉淀沒有纖溶活性,為雜蛋白;硫酸銨飽和度在30%～50%之間時,目標蛋白沉淀出來,且纖溶活性隨著飽和度的增加而增加;梯度50%以后,目標蛋白活性不再明顯增加,因此確定采用30%飽和度硫酸銨鹽析沉淀雜蛋白,上清液再用50%飽和度硫酸銨鹽析沉淀目標蛋白為提取方格星蟲纖溶活性蛋白組分的條件。

圖1　纖維蛋白平板法測定硫酸銨梯度鹽析后上清液和沉淀的纖溶活性Fig.1　Enzyme activity estimatedby fibrin plate method after ammonium sulfate precipitation

圖2　硫酸銨鹽析曲線Fig.2　Curve of ammonium sulfate salting out

2.2方格星蟲纖溶蛋白的還原能力

從表1可以看出,隨著方格星蟲纖溶蛋白水溶液濃度的增大,其反應產(chǎn)物在700 nm的吸光度值也越大,說明方格星蟲纖溶蛋白具有一定的還原能力,但與陽性對照藥VitC(0.06 mg/mL)比較,其還原能力較弱。一般認為還原能力與抗氧化能力是成正相關的,還原能力越強,其抗氧化能力也越強。

表1　方格星蟲纖溶蛋白的還原能力±s,n=3)

2.3方格星蟲纖溶蛋白清除DPPH·的能力

從圖3可知,方格星蟲纖溶蛋白對DPPH·具有清除作用,清除率隨著纖溶蛋白的濃度增加而增加,濃度為0.14 mg/mL時清除率為20.83%,濃度為2.25 mg/mL時清除率達70.27%。通過濃度對清除率做圖求線性回歸,得到回歸方程Y=23.75X+20.75(r=0.9434),依據(jù)回歸方程求得方格星蟲纖溶蛋白清除DPPH·的EC50為1.23 mg/mL。

圖3　方格星蟲纖溶蛋白清除DPPH·的能力Fig.3　DPPH· radical scavenging activity of the protein fraction with fibrinolytic activityfrom Sipunculus nudus

2.4方格星蟲纖溶蛋白清除羥自由基(·OH)的能力

由圖4可知,方格星蟲纖溶蛋白可以有效清除·OH,且隨著濃度增加,對羥自由基(·OH)的清除率增加,說明方格星蟲纖溶蛋白的抗羥基自由基能力具有濃度依賴性。通過濃度對清除率做圖求線性回歸,得到回歸方程Y=7.35X+5.375(r=0.9999),依據(jù)回歸方程求得方格星蟲纖溶蛋白清除·OH的EC50為6.07 mg/mL。通過EC50的比較,方格星蟲纖溶蛋白對羥基自由基的清除作用弱于對DPPH·的清除作用。

圖4　方格星蟲纖溶蛋白清除羥基自由基(·OH)的能力Fig.4　·OH radical scavenging activity of the protein fraction with fibrinolytic activity from Sipunculus nudus

圖5　方格星蟲纖溶蛋白清除超陰氧離子自由基的能力Fig.· scavenging activity of the protein fraction with fibrinolytic activity from Sipunculus nudus

3　結論

[1]陳細香,林秀雁,盧昌義,等.方格星蟲屬動物的研究進展[J].海洋科學,2008,32(6):66-70.

[2]沈先榮,蔣定文,賈福星,等.方格星蟲延緩衰老作用研究[J].中國海洋藥物,2004,(1):30-32.

[3]沈先榮,蔣定文,賈福星,等.海洋星蟲提取物的抗疲勞作用研究[J].中華航海醫(yī)學與高氣壓醫(yī)學雜志,2003,10(2):112-114.

[4]黃玉良,黃群,黃哲元,等.復方星蟲口服液對小鼠免疫功能的影響[J].福建中醫(yī)學院學報,1998,8(2):32-33.

[5]王佃亮,姜合作,王瑞玲,等.一種新型海洋纖溶酶的分離純化與性質鑒定[J].中國生物工程雜志,2010,30(8):42-51.

[6]Astrup T,Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics. 1952,40(2):346-351.

[7]劉清,李玉,姚惠源,等.大麥提取物的體外抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技,2007,28(2):131.

[8]黃琳,段磊,李榮貴,等.沙蠶提取物的抗氧化活性研究[J].中國海洋藥物雜志,2007,26(2):19.

[9]Parejo I,Codina C,Petrakis C,et al.Evaluation of scavenging activity assessed by Co/EDTA-induced Iuminal chemiluminescence and DPPH(2,2-diphenyl-1-picrydrazyl)free radical assay[J]. J Pharmacol Toxicol Methods,2000,44(3):507-512.

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[13]趙新合.油菜和荷花蜂花粉提取物的抗氧化研究[J].應用化學,2005,(8):500-504.

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Extraction and antioxidant activity of the protein fraction with fibrinolytic activity fromSipunculusnudusLinnaeus

LI Ying-xin1,LI Xiao-xiao2,LIU Jin-yuan3,YAO Pei-shan4,YAN Chi4,LEI Dan-qing5，*

(1.Pharmacutical College of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.Guidong People’s Hospital,Wuzhou 543001,China;3.General Medical School of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;4.School of Preclinical Medicine of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;5.Research Institute of Guangxi Medical University,Nanning 530021,China)

SipunculusnudusLinnaeus;extraction;fibrinolytic enzyme activity;antioxidant activity

2015-11-05

李映新(1980-),女,博士,高級實驗師,研究方向:天然藥物的研究與開發(fā),E-mail:marchimoro@yeah.net。

雷丹青(1964-),女,碩士生導師,研究員,研究方向:生化藥物的研究與開發(fā),E-mail:13877100706 @163.com。

廣西壯族自治區(qū)教育廳專利資助項目(ZL2014008);廣西醫(yī)科大學青年基金(GXMUYSF2014025);廣西高校/廣西再生醫(yī)學重點實驗室開放課題項目(桂再重開15-05)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)11-0085-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.009