酶法制備黑莓果膠寡糖及其抗氧化活性研究

丁　鵬,沈照鵬,張京良,李國(guó)霞,萬(wàn)國(guó)韶,江曉路,3,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,山東青島 266071;4.青島金鳳凰莊園果品有限公司,山東青島 266213)

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酶法制備黑莓果膠寡糖及其抗氧化活性研究

丁鵬1,沈照鵬2,3,張京良2,3,李國(guó)霞1,萬(wàn)國(guó)韶4,江曉路1,3,*

(1.中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003;2.中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,山東青島 266003;3.青島海洋生物醫(yī)藥研究院,山東青島 266071;4.青島金鳳凰莊園果品有限公司,山東青島 266213)

對(duì)黑莓果膠寡糖進(jìn)行抗氧化活性研究,探究其自由基清除能力。對(duì)黑莓果膠進(jìn)行提取,并利用果膠酶對(duì)其進(jìn)行酶解,通過(guò)分級(jí)醇沉制得黑莓果膠寡糖。以DPPH、ABTS、羥自由基清除能力驗(yàn)證不同黑莓果膠寡糖體外抗氧化活性。結(jié)果表明,4倍醇沉寡糖對(duì)DPPH、ABTS自由基的IC50分別為0.59、4.75 mg/mL。10倍醇沉果膠寡糖對(duì)這兩種自由基的清除作用更強(qiáng),IC50分別為0.40、2.79 mg/mL。黑莓果膠寡糖具有顯著的抗氧化活性,對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基有很強(qiáng)的清除作用,且具有明顯的量效關(guān)系。

寡糖,果膠,黑莓,抗氧化活性

黑莓屬于薔薇科懸鉤子屬,是歐美地區(qū)廣泛種植的小果類(lèi)果樹(shù),1994年起開(kāi)始在國(guó)內(nèi)推廣種植。黑莓含有豐富的氨基酸、維生素、微量元素,尤其硒的含量高達(dá)2.07 μg/g,是蘋(píng)果的6～8倍,柑橘的12倍[1]。并含有大量的花色苷、黃酮、果膠、SOD等活性成分。

果膠是一類(lèi)富含半乳糖醛酸的天然高分子化合物,存在于所有的陸生植物中[2]。水果是果膠提取的重要原料,具有工業(yè)價(jià)值的主要是柑橘皮[3],此外,學(xué)者還對(duì)蘋(píng)果[4]、荔枝[5]、西番蓮[6]等作為果膠提取原料進(jìn)行了研究。通過(guò)酸法或酶法將果膠不完全降解可以得到果膠寡糖。果膠寡糖已被報(bào)道具有多種生理活性,如抗氧化活性[7]、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8],改善腸道菌群[9]等。黑莓是一種新興水果,果膠占干重的5.23%[10],目前未見(jiàn)對(duì)其果膠寡糖制備及活性研究的報(bào)道。本文以黑莓果膠寡糖為研究對(duì)象,初步探究了其在體外的抗氧化活性,以期發(fā)現(xiàn)一種功能性食品資源。

表1　不同方法提取黑莓果膠的性質(zhì)比較

1　材料與方法

1.1材料與儀器

黑莓青島金鳳凰莊園果品有限公司,-18 ℃下保存;果膠酶產(chǎn)果膠酶菌株Aspergillus niger M-8經(jīng)發(fā)酵制得果膠酶制劑[11],酶活力為298 U/mL;DPPH、ABTS sigma公司;無(wú)水乙醇、水楊酸等試劑均為分析純。

冷凍干燥機(jī)北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;L530離心機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋上海一恒科學(xué)儀器有限公司;J722S分光光度計(jì)上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2黑莓果膠的提取

果膠的提取采用酸提醇沉法,但由于黑莓本身含有較多的還原糖,所以對(duì)酸提法[12]略作改進(jìn)。取300 g黑莓,解凍后加入600 mL乙醇進(jìn)行勻漿,勻漿后4000 r/min離心10 min,取沉淀加入到750 mL的0.01 mol/L的鹽酸溶液中,90 ℃振蕩提取100 min,提取完成后,4000 r/min離心10 min,向上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇并放置4 h,離心得到沉淀,將沉淀用無(wú)水乙醇漂洗兩次,凍干得到黑莓果膠。測(cè)定得到果膠得率及其總糖和還原糖含量[13]、糖醛酸含量[14],并與酸提法進(jìn)行比較。

1.3黑莓果膠寡糖的分級(jí)制備

取12 g黑莓果膠溶解到200 mL水中,加熱使果膠完全溶解,冷卻至室溫后,加入果膠酶1.49×104U,35 ℃震蕩酶解12 h。酶解完成后,離心將不溶部分除掉,上清液分別加入2倍、4倍、10倍體積的乙醇進(jìn)行分級(jí)醇沉,將得到的果膠寡糖凍干,分別標(biāo)記為2倍、4倍、10倍醇沉果膠寡糖,計(jì)算得率,測(cè)定其總糖、還原糖、糖醛酸含量,采用folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[15]。

1.4黑莓果膠寡糖抗氧化能力的測(cè)定

通過(guò)分級(jí)醇沉得到的果膠寡糖,凍干后計(jì)算得率,將醇沉得率較高的糖配制成一定的濃度梯度,進(jìn)行抗氧化活性研究。

1.4.1清除DPPH自由基的能力參考文獻(xiàn)[13]，向2 mL DPPH溶液(0.2 mmol/L,甲醇配制)中加入2 mL不同醇沉倍數(shù)的樣品,混勻,室溫避光條件下反應(yīng)30 min,測(cè)定517 nm下的吸光值。計(jì)算不同濃度果膠寡糖對(duì)DPPH自由基的清除作用。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

式中,Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品的吸光值,Ai0為2 mL甲醇溶液+2 mL樣品的本底吸光值,A0為2 mL DPPH溶液+2 mL蒸餾水的吸光值。

1.4.2清除ABTS自由基的能力參考文獻(xiàn)[16]的方法,配制7 mmol/L的ABTS溶液10 mL(用0.2 mol pH7.4的PBS配制),向其中加入過(guò)硫酸銨使過(guò)硫酸銨的終濃度為2.45 mmol/L,室溫黑暗環(huán)境下放置16小時(shí),使用前,用pH7.4的PBS緩沖液將其稀釋,使稀釋后的ABTS自由基在734 nm下的吸光值為0.7±0.02。

取5 mL ABTS溶液于試管中,加入100 μL的寡糖溶液,混勻,室溫黑暗環(huán)境下放置5 min,測(cè)定734 nm下的吸光值。

清除率(%)=(1-Ai/A0)×100

式中,Ai為5 mL ABTS溶液+100 μL寡糖溶液的吸光值,A0為5 mL ABTS溶液+100 μL蒸餾水的吸光值。

1.4.3清除羥自由基的能力向試管中分別加入9 mmol/L的FeSO4溶液1 mL,9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL,樣品1 mL,最后加入8 mmol的H2O2溶液1 mL,渦旋混勻后,37 ℃水浴30 min,測(cè)定510 nm下的吸光值。

清除率(%)=[1-(Ai-Ai0)/A0]×100

式中,Ai為各樣品吸光值,Ai0為用蒸餾水代替H2O2溶液測(cè)得的各樣品的本底吸收,A0為以蒸餾水代替樣品測(cè)得的吸光值。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所得數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS Statistics進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1黑莓果膠的提取

黑莓中還原糖的含量非常高,以黑莓為原料提取果膠,需要一種得率高,提得粗果膠還原糖含量少的提取方法。通過(guò)醇輔助酸提得到粗果膠,得率為5.61%(以黑莓干重計(jì))。對(duì)粗果膠進(jìn)行成分分析,測(cè)得粗果膠中總糖含量為67.70%,糖醛酸含量為47.44%,還原糖含量為22.89%。這種提取方法相較于酸提法得率略有降低,但是得到的粗果膠中總糖含量、糖醛酸含量都有明顯提升,尤其糖醛酸含量提高了10.07%。半乳糖醛酸是果膠的主要組成部分,糖醛酸含量的提高也能在一定程度上表征果膠在粗果膠中含量的提高。提得果膠的品質(zhì)提高可能是醇輔助勻漿過(guò)程中還原糖溶出且兩倍體積的乙醇不足以使其沉淀,所以存在于上清中,離心后去除,使得最終得到的粗果膠中還原糖含量較少,而果膠含量相對(duì)提高。

2.2黑莓果膠寡糖的分級(jí)制備

計(jì)算分級(jí)醇沉果膠寡糖得率,2倍醇沉果膠寡糖得率為3.17%,4倍醇沉寡糖得率最高,達(dá)到30.67%,10倍醇沉的得率為8.50%。通過(guò)比較,發(fā)現(xiàn)4倍、10倍醇沉的果膠寡糖中總糖含量較高,糖醛酸含量高達(dá)85.34%和83.20%。并且隨著醇沉倍數(shù)的增加,還原糖的含量也大大增加。2倍醇沉寡糖中蛋白質(zhì)雜質(zhì)最多,這可能是加入的果膠酶被沉淀出來(lái)導(dǎo)致的。

相較于黑莓粗果膠,分級(jí)醇沉得到的果膠寡糖溶解性能大大提高。果膠溶解時(shí),果膠粉末會(huì)與水接觸迅速水合形成塊狀,并在塊狀表面形成高度水化的外殼,溶解極慢。而果膠寡糖極易溶于水,在冷水中稍加攪拌即可溶解。這種溶解性能的提高有利于對(duì)果膠寡糖進(jìn)行進(jìn)一步的加工利用。

表2　黑莓果膠寡糖性質(zhì)比較

2.3黑莓果膠寡糖體外抗氧化活性

2.3.1清除DPPH自由基的能力黑莓果膠寡糖對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖1所示,隨著濃度的增加,對(duì)DPPH自由基的清除作用也越來(lái)越強(qiáng)。兩種寡糖對(duì)DPPH自由基都有十分明顯的清除作用,在較低的濃度下就有較好的清除效果,且10倍醇沉得到的果膠寡糖對(duì)DPPH自由基的清除作用強(qiáng)于4倍醇沉果膠寡糖。杜麗娟報(bào)道的4種山楂果膠酶解片段在濃度為1 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除均低于40%[17]。而兩種黑莓果膠寡糖在相同濃度下,DPPH自由基的清除率均在60%以上,這可能是不同來(lái)源的果膠,結(jié)構(gòu)和活性基團(tuán)的差異導(dǎo)致的。

圖1　黑莓果膠寡糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1　DPPH scavenging activity of pectic oligosaccharides from blackberry

利用SPSS軟件,進(jìn)行probit分析計(jì)算得到4倍醇沉果膠寡糖的IC50為0.59 mg/mL,而10倍醇沉寡糖的IC50為0.40 mg/mL。IC50的值越低,說(shuō)明樣品的清除效果越顯著,10倍寡糖具有較低的IC50,即10倍醇沉果膠寡糖對(duì)DPPH自由基的清除效果較好。

2.3.2清除ABTS自由基的能力黑莓果膠寡糖對(duì)ABTS自由基的清除作用如圖2所示,兩種寡糖都有十分明顯的清除作用,10倍醇沉果膠寡糖的清除效果尤為突出,濃度為8 mg/mL時(shí),對(duì)ABTS自由基的清除率就已經(jīng)達(dá)到了99.59%。probit分析計(jì)算得到4倍醇沉果膠寡糖的IC50為4.75 mg/mL,10倍醇沉寡糖的IC50為2.79 mg/mL。

圖2　黑莓果膠寡糖對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2　ABTS scavenging activity of pectic oligosaccharides from black berry

分析發(fā)現(xiàn),在一定范圍內(nèi),黑莓果膠寡糖對(duì)ABTS自由基的清除作用呈現(xiàn)出顯著的量效關(guān)系,4倍、10倍醇沉的寡糖濃度與自由基清除率均呈現(xiàn)正比關(guān)系?；谶@種正比關(guān)系,可以在一定濃度范圍內(nèi),在已知寡糖濃度的情況下,對(duì)清除率進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2.3.3清除羥自由基的能力果膠寡糖對(duì)羥自由基的清除作用如圖3所示,清除效果隨寡糖濃度的增大而增強(qiáng),但寡糖濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí),對(duì)羥自由基的清除率仍不到50%,所以黑莓果膠寡糖對(duì)羥自由基的清除效果不佳。

圖3　果膠寡糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig.3　Hydroxy free radical scavenging activity of pectic oligosaccharides from black berry

黑莓果膠寡糖具有顯著的抗氧化作用,是一種有效且天然的抗氧化劑,是一種潛在的功能食品資源。隨著黑莓種植的推廣和消費(fèi)者對(duì)黑莓認(rèn)可度的提高,對(duì)黑莓利用開(kāi)發(fā)提出了新的要求,開(kāi)發(fā)黑莓果汁無(wú)疑為一條很好的出路。通常果汁加工中添加果膠酶的作用是提高出汁率和澄清度,卻忽略了添加果膠酶后,生成的果膠寡糖對(duì)功能性的提高作用,本研究為這一觀點(diǎn)提供了有力的支持。

3　結(jié)論

經(jīng)體外自由基清除實(shí)驗(yàn)證實(shí)果膠寡糖具有顯著的抗氧化作用。4倍醇沉寡糖對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的IC50分別為0.59、4.75 mg/mL。10倍醇沉果膠寡糖對(duì)這兩種自由基的IC50分別為0.40、2.79 mg/mL。兩種果膠寡糖對(duì)自由基都有顯著的清除作用,且10倍醇沉寡糖表現(xiàn)更為突出。目前尚未見(jiàn)對(duì)黑莓果膠寡糖制備及其活性的報(bào)道,本文對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了初步探究,為黑莓研究開(kāi)發(fā)提供了理論支持。

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Study on preparation of pectic oligosaccharides from blackberry by enzymatic hydrolysis and its antioxidant activities

DING Peng1,SHEN Zhao-peng2,3,ZHANG Jing-liang2,3,LI Guo-xia1,WAN Guo-shao4,JIANG Xiao-lu1,3,*

(1.College of Food Science and Engineering of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;2.School of Medicine and Pharmacy of Ocean University of China,Qingdao 266003,China;3.Marine Biomedical Research Institute of Qingdao,Qingdao 266071,China;4. Qingdao Golden Phoenix Manor Fruit Co. Ltd,Qingdao 266213,China)

In order to study the antioxidant activity of the oligosaccharide of BlackBerry pectin,their radical scavenging activities were evaluated. After the enzymolysis of the extracted BlackBerry pectin,different oligosaccharide fragments were obtained with graded ethanol precipitation.Invitroantioxidant activities of that oligosaccharide were evaluated by the DPPH radicals,ABTS radicals,and hydroxyl radical scavenging activity. The results indicated that the oligosaccharide obtained with 4 times of ethanol could scavenge DPPH radicals with ABTS radicals with IC50values of 0.59 mg/mL and 4.75 mg/mL,respectively. By contrast,the oligosaccharide obtained with 10 times of ethanol showed relatively high scavenging activity on DPPH radicals and ABTS radicals with IC50value of 0.40 mg/mL and 2.79 mg/mL,respectively. The oligosaccharide of BlackBerry pectin exhibited significant antioxidant activity,and the scavenging activity on DPPH radicals and ABTS radicals presented a quantity-effect relation with the concentration of oligosaccharide.

oligosaccharides;pectin;blackberry;antioxidant activity

2015-12-02

丁鵬(1990-)，男，碩士，研究方向：應(yīng)用微生物工程，E-mail：dpsunshine@126.com。

江曉路(1959-)，女，本科，教授，研究方向：應(yīng)用微生物工程，E-mail：jiangxl@ouc.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金(U1406402-5)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)11-0076-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.007