板栗花黃酮的提取工藝及其抑菌活性研究

李月嬌,王雪青,*,陳亞藍(lán),宋文軍,王素英,趙國強(qiáng),付慶偉

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134; 2.唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心,河北唐山 064300)

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板栗花黃酮的提取工藝及其抑菌活性研究

李月嬌1,王雪青1,*,陳亞藍(lán)1,宋文軍1,王素英1,趙國強(qiáng)2,付慶偉2

(1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院,天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134; 2.唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心,河北唐山 064300)

優(yōu)化半仿生提取(SBE)板栗花黃酮提取工藝,并研究板栗花黃酮的抑菌活性。利用單因素和正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù),以抑菌圈及最小抑制濃度(MIC)為指標(biāo)來評價(jià)板栗花黃酮的抑菌效果。結(jié)果表明:SBE板栗花黃酮最佳提取工藝為提取時(shí)間10 min,提取溫度80 ℃,料液比為1∶20(m∶V);在最佳工藝參數(shù)條件下,SBE板栗花黃酮的得率為6.76%±0.11%。三種供試菌株對提取的板栗花黃酮的敏感性從大到小依次為枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和啤酒酵母菌,最小抑制濃度分別為2、5、6 mg/mL。

板栗花,黃酮,乙醇回流提取,半仿生提取,抑菌活性

板栗是雌雄異花同株植物,板栗花一般指其雄花。板栗雌雄花數(shù)量差異大,雌雄花比值可達(dá)1∶2349[1],因此,需要人為疏除大量雄花序,特別是近年來,隨著板栗種植面積的增加,板栗花的產(chǎn)量十分可觀有待開發(fā)利用。據(jù)報(bào)道[2],板栗花有多種生物學(xué)功能,民間通過食用治療喉炎腫痛,搗碎取汁外用治療漆瘡癥,用其水煎劑治療頑固的細(xì)菌性痢疾,且具有潤腸止瀉的功效。研究發(fā)現(xiàn),板栗花中含有黃酮、揮發(fā)油、酚酸類、三萜類等多種化合物,其中黃酮類物質(zhì)含量較高,主要以槲皮素、山奈酚、異鼠李素、楊梅黃酮等游離黃酮與糖基結(jié)合形成糖苷的形式存在[3]。黃酮類物質(zhì)是植物中廣泛存在的次生代謝產(chǎn)物,由兩個(gè)具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接構(gòu)成一系列物質(zhì),苯環(huán)取代基的差異,位置的變化以及氧化程度和酚羥基數(shù)量等多樣性,使其種類多達(dá)9000種,極具保健功能和開發(fā)潛力[4-5]。據(jù)報(bào)道[6],黃酮類物質(zhì)具有降血脂、降血糖等功能,并對高血壓、冠心病、中風(fēng)等疾病有輔助療效,可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。

提取黃酮類化合物的方法有多種。傳統(tǒng)的水提法由于提取產(chǎn)物中含有較多的糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì),難以獲得高純度的目的產(chǎn)物;有機(jī)溶劑提取法存在有機(jī)溶劑殘留量大,成本高,提取得率低等問題;超臨界流體萃取耗能高,不適合大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。根據(jù)“相似相容”的提取原理,不同的提取工藝(溶劑種類、提取溫度等),不僅會影響總黃酮的含量,而且影響其種類和豐度,進(jìn)而影響其生物活性。目的產(chǎn)物總黃酮含量一直作為提取工藝評判的重要參數(shù),卻很少關(guān)注提取工藝對黃酮生物活性的影響。半仿生提取[7](semi-bionic extraction,SBE)法是近年來發(fā)展起來的一種分離技術(shù),其原理是通過模擬口服藥物經(jīng)胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)吸收的環(huán)境條件而設(shè)計(jì)的一種依次經(jīng)過酸、堿處理的提取工藝,這樣使體外提取的黃酮類化合物的種類與體內(nèi)經(jīng)胃腸道消化吸收后的黃酮類物質(zhì)更為相近,能更好地闡述黃酮類物質(zhì)對機(jī)體的生物活性及功能,而且節(jié)約成本,安全環(huán)保,近年來逐漸取得人們的重視。SBE法已成功應(yīng)用于蜂膠[8]、杜仲葉[9]、葛根[10]等黃酮的提取。中國已有采用SBE法提取香椿葉[11]、苦參[12]中黃酮的相關(guān)報(bào)道,但SBE法對板栗花黃酮的提取效果尚未見報(bào)道。

本研究先采用單因素和正交實(shí)驗(yàn),研究SBE法提取板栗花總黃酮的工藝;另外,通過對比乙醇回流法(alcohol-reflux extraction,ARE)和SBE法制備的板栗花總黃酮的抑菌活性,得到以抑菌活性為指標(biāo)的板栗花黃酮合適的提取工藝,為板栗花的綜合應(yīng)用與開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

板栗花河北省唐山市遷西縣板栗研究發(fā)展中心,干燥、粉碎、過篩(80目)備用;大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)天津商業(yè)大學(xué)微生物保藏中心;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(98%)上海永葉生物科技有限公司;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、石油醚分析純,天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司。

DS-1型高速組織搗碎機(jī)上海標(biāo)本模型廠;ZDHW型調(diào)溫電熱套河北省黃驊市中興儀器有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器廠;FD-1A-50型真空冷凍干燥機(jī)上海汗諾儀器有限公司;3-18K型離心機(jī)德國Sigma-Aldrich公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SBE法提取板栗花黃酮稱取一定質(zhì)量的板栗花粉末以1∶10(m∶V)的比例加入石油醚脫脂2 h后,分別用pH為2.2、7.6、8.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液作為浸提劑提取板栗花黃酮,合并濾液以5000 r/min離心10 min,取上清用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50 ℃條件下旋蒸30 min得到黃酮粗提液。

1.2.2板栗花黃酮的測定采用文獻(xiàn)[13]的方法,得到黃酮與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=10.169x+0.0158,其中R2=0.9971。

移取板栗花提取液1 mL于50 mL容量瓶中,加入5%(m/V)的NaNO3溶液2 mL,搖勻,靜置6 min;加入10%(m/V)的Al(NO3)3溶液2 mL,搖勻,靜置6 min;加入4%(m/V)的NaOH溶液20 mL搖勻,靜置6 min,加蒸餾水定容,搖勻,5000 r/min離心10 min,取上清在510 nm處測定其OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到板栗花黃酮的濃度C,根據(jù)公式(1)求得板栗花黃酮的提取得率R。

式(1)

式中:R-板栗花黃酮提取得率,%;C-提取液黃酮的濃度,mg/mL;V-提取液定容體積,L;m-板栗花粉末的質(zhì)量,g。

1.2.3SBE法提取板栗花黃酮的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提取時(shí)間對提取得率的影響:固定提取溫度為70 ℃,料液比為1∶20(m∶V),考察不同提取時(shí)間(10、20、30、40和50 min)對提取得率的影響。

提取溫度對提取得率的影響:固定料液比為1∶20(m∶V),提取20 min,考察不同提取溫度(50、60、70、80、90 ℃)對提取得率的影響。

料液比對提取得率的影響:固定提取溫度為70 ℃,提取時(shí)間為20 min,考察不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 m∶V)對提取得率的影響。

1.2.3.2正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)SBE法以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料液比(C)為實(shí)驗(yàn)因素,按照L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),優(yōu)化SBE法的提取工藝。

表1　SBE法的正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.4板栗花黃酮的抑菌圈實(shí)驗(yàn)將烘干的濾紙片(直徑9 mm)均勻浸泡于分別以優(yōu)化ARE和SBE兩種工藝提取的板栗花黃酮提取液(總黃酮含量為100 mg/mL)中,并置于含菌平板。含真菌平板28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,含細(xì)菌平板37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,之后測定抑菌圈直徑。當(dāng)抑菌圈直徑范圍在9 mm<抑菌圈直徑<10 mm時(shí),為低度敏感;在10 mm<抑菌圈直徑<20 mm時(shí),為中度敏感;而抑菌圈直徑>20 mm為高度敏感,并以無菌水為對照組[13]。

1.2.5板栗花黃酮的最低抑菌濃度(MIC)的確定分別制備濃度為0、1、2、3、4、5、6、7 mg/mL的含藥平板,吸取100 μL濃度為106cfu/mL的菌懸液加入含藥平板中,用無菌涂布棒涂抹均勻,分別置于相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2　結(jié)果與分析

2.1SBE法中不同提取工藝參數(shù)對黃酮提取得率的影響

2.1.1提取時(shí)間對提取得率的影響提取時(shí)間對提取得率的影響見圖1。

圖1　提取時(shí)間對總黃酮提取得率的影響Fig.1　Effects of extracting time on extraction yield of total flavones

由圖1可知,在10～20 min時(shí)間范圍內(nèi),提取得率從5.05%±0.07%增加至5.83%±0.12%,之后提取得率隨時(shí)間增加而降低。黃酮類化合物在酸性條件下比較穩(wěn)定,但在堿性環(huán)境下,一些黃酮的穩(wěn)定性變差,如花色苷在弱堿性條件下長時(shí)間受熱,花色素苷母核結(jié)構(gòu)首先轉(zhuǎn)化為查爾酮式結(jié)構(gòu),隨后查爾酮式結(jié)構(gòu)降解,黃酮結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致提取得率降低[14-20];也可能是由于提取時(shí)間過長,雜質(zhì)溶出增多導(dǎo)致提取得率降低,因此,最佳的提取時(shí)間為20 min。

2.1.2提取溫度對提取得率的影響提取溫度對提取得率的影響見圖2。

圖2　提取溫度對總黃酮提取得率的影響Fig.2　Effects of extracting temperature on extraction yield of total flavones

由圖2可知,在一定范圍內(nèi),板栗花黃酮提取得率隨提取溫度的升高呈先增大繼而減小的趨勢,當(dāng)溫度在60～70 ℃之間,提取率隨著溫度的升高而顯著增加(p<0.01),當(dāng)溫度高于70 ℃,提取得率升高趨勢開始平緩(p<0.05),至80 ℃時(shí),提取得率達(dá)到最大(6.30%±0.10%)之后,迅速下降。

溫度是能夠顯著改變?nèi)芤褐形镔|(zhì)溶解度的一個(gè)因素,提高溶劑溫度,分子運(yùn)動速度加快,滲透、擴(kuò)散、溶解速度均加快而且可引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的變化,使黃酮類化合物由板栗花外層細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中,因此,能夠有效的提高黃酮類物質(zhì)的浸出量。但溫度過高,會引起分解反應(yīng)的加劇,導(dǎo)致總黃酮提取得率下降。諸愛士[21]在研究葛根黃酮提取時(shí)發(fā)現(xiàn),溫度的影響具有雙重性,升高溫度可以降低液體黏度,使傳質(zhì)阻力減小,同時(shí)可以促進(jìn)分子熱運(yùn)動,提高擴(kuò)散系數(shù),并增加溶質(zhì)的溶解度,有利于提取得率的提高,但溫度過高又會使物質(zhì)分解變性,降低提取得率。因此,合理的控制提取溫度在70～80 ℃,在黃酮提取工藝中是十分重要的。

2.1.3料液比對提取得率的影響由圖3可知,隨料液比的增大,板栗花黃酮的提取得率升高。料液比為1∶20(m∶V)時(shí),提取得率達(dá)到6.27%±0.12%,而后提取得率增加緩慢,逐漸趨于穩(wěn)定。分析原因可能是料液比過低,提取液與板栗花粉接觸不夠充分,黃酮的溶解度太小;隨料液比的增大,黃酮的溶解度增大,提取得率增大,料液比過高,造成能源的浪費(fèi)。綜合考慮,1∶20(m∶V)為板栗花黃酮提取的最佳料液比。

圖3　料液比對總黃酮提取得率的影響Fig.3　Effects of ratio of material to extractant on extraction yield of total flavones

2.2SBE法的提取工藝優(yōu)化

2.2.1SBE法的提取工藝優(yōu)化由表2極差分析可知,因素影響主次為A>C>B,最佳配比為A3B1C2,即提取溫度80 ℃，提取時(shí)間為10 min,料液比為1∶20(m∶V)。由表3可知,溫度對板栗花黃酮提取得率的影響顯著,各因素影響主次為A>C>B。

表2　SBE法的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表4　板栗花黃酮的最低抑菌濃度(MIC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注:“++”代表有較多菌生長,“+”代表有少量菌生長,“-”代表無菌生長。

表5　板栗花黃酮的抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3　方差分析表

2.2.2驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選SBE工藝的可靠性,分別取3份板栗花粉,每份20.00 g,按上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所得黃酮平均提取得率為6.76%±0.11%。

按照文獻(xiàn)報(bào)道的ARE工藝,考察了乙醇濃度、提取時(shí)間和料液比對提取得率的影響,并進(jìn)行了正交實(shí)驗(yàn),得到的工藝參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道的相一致[22]，即:乙醇濃度80%、提取時(shí)間1.5 h、料液比1∶20。在此工藝參數(shù)下,分別取3份板栗花粉,每份20.00 g,所得黃酮平均提取得率為6.62%±0.07%。

2.3板栗花黃酮的抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知,三種菌對板栗花黃酮的敏感程度順序依次為:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),大腸桿菌(E.coli),釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae);SBE法提取的黃酮的抑菌效果優(yōu)于ARE法。

由表5可知,采用SBE法提取的板栗花黃酮的抑菌圈直徑大于ARE法(p<0.05),三種菌對板栗花黃酮的敏感程度順序依次為:枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(E.coli)、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)。

黃酮類化合物具有抗菌活性,其抗菌活性的大小與其來源和黃酮的精細(xì)結(jié)構(gòu)有關(guān),如羥基的數(shù)目及取代位點(diǎn)的差異對黃酮類化合物的抑菌活性產(chǎn)生影響[23]。而提取方法的不同,有可能會改變物質(zhì)的組成。本研究通過采用ARE法和SBE法得到的黃酮來比較對大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)的抑制作用,其抑菌程度從大到小依次為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)>大腸桿菌(E.coli)>釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae),而且采用SBE法得到的黃酮的抑菌活性大于ARE法,這可能正是由于SBE的酸堿環(huán)境使板栗花黃酮中的一些基團(tuán)發(fā)生改變,從而改變了其抑菌活性。王瑞[24]等對苗藥八爪金龍半仿生提取物進(jìn)行抑菌活性研究時(shí)發(fā)現(xiàn),SBE法提取物對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的抑菌活性高于ARE,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。因此SBE法提取黃酮時(shí)間短,效率高而且活性好,是一種行之有效的提取方法,因而有著廣闊的應(yīng)用前景。

3　結(jié)論

優(yōu)化的SBE提取工藝參數(shù)為:提取溫度80 ℃、提取時(shí)間10 min和料液比1∶20(m∶V),在優(yōu)化的工藝條件下提取板栗花黃酮,提取得率達(dá)到6.76%±0.11%,同時(shí)顯示板栗花黃酮具有一定的抑菌效果,三種供試菌株對提取的板栗花黃酮的敏感性從大到小依次為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(E.coli)和釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae),最小抑制濃度分別為2、5、6 mg/mL。與ARE法比較,SBE法最大的優(yōu)勢在于處理時(shí)間短。本實(shí)驗(yàn)顯示,板栗花處理時(shí)間僅為10 min,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于ARE法所經(jīng)歷的1.5 h加熱時(shí)間;而且提取劑以水取代了有機(jī)溶劑乙醇,因此SBE法提取黃酮物質(zhì)不僅提高了產(chǎn)量,更重要的是提高了抗菌活性,而且也降低了生產(chǎn)能耗和對環(huán)境友好。

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Optimization of technologies for extracting flavones from chestnut flower and its antibacterial activity

LI Yue-jiao1,WANG Xue-qing1,*,CHEN Ya-lan1,SONG Wen-jun1, WANG Su-ying1,ZHAO Guo-qiang2,FU Qing-wei2

(1.Institute of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China; 2.Qianxi Chestnut Industry Research and Development Center,Tangshan 064300,China)

Technological parameters of semi-bionic extraction(SBE)flavones from chestnut flower were optimized using single factor and orthogonal experiment,and the antibacterial activity of the flavones was investigated by measuring the inhibition zone and the minimum inhibitory concentration(MIC). The results showed that the optimum extracting conditions were extracting time 10 min,the temperature 80 ℃ and material-to-liquid ratio 1∶20(m∶V). Under these optimal conditions,the extraction yield of(6.76%±0.11%)were obtained. The flavones from chestnut flower exhibited the antibacterial activity againstE.coli,BacillussubtilisandSaccharomycescerevisiae. The orders from strong to weak wereBacillussubtilis,E.coliandSaccharomycescerevisiae. The minimum inhibition concentration of the flavonoids was respectively 2 mg/mL,5 mg/mL and 6 mg/mL.

chestnut flower;flavones;alcohol-reflux extraction;semi-bionic extraction;antibacterial activity

2015-10-26

王雪青(1964-)，女，博士，教授，主要從事天然活性物質(zhì)方面的研究與開發(fā)，E-mail:wxqing@tjcu.edu.cn。

李月嬌(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：天然活性物質(zhì)的研究與開發(fā)，E-mail:270696347@qq.com。

天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)規(guī)劃資助項(xiàng)目(TD12-5049)；天津市高?？萍及l(fā)展基金資助項(xiàng)目(20120603)；唐山遷西縣板栗產(chǎn)業(yè)研究發(fā)展中心資助項(xiàng)目(G11034)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)10-0298-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.052