鳳凰單叢茶內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

蔡　麗,歐燕清,侯小楨,王金良,傅　力,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.潮州市茶葉科學(xué)研究中心,廣東潮州 521041; 3.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院,廣東潮州 521041; 4.廣東饒平金利香生態(tài)茶業(yè)有限公司,廣東潮州 515725)

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鳳凰單叢茶內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選與鑒定

蔡麗1,歐燕清2,侯小楨3,王金良4,傅力3,*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052; 2.潮州市茶葉科學(xué)研究中心,廣東潮州 521041; 3.韓山師范學(xué)院生命科學(xué)與食品科技學(xué)院,廣東潮州 521041; 4.廣東饒平金利香生態(tài)茶業(yè)有限公司,廣東潮州 515725)

從潮州鳳凰單叢茶樹中分離篩選具有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌,為新型生物抗菌劑的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。對鳳凰單叢茶樹的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離純化,采用雙層平板法篩選對供試指示細(xì)菌具有抑制作用的菌株,平板對峙法篩選對供試植物病原菌具有抑制作用的菌株,并對拮抗細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征觀察、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA鑒定。結(jié)果表明:鳳凰單叢茶樹中共分離出內(nèi)生細(xì)菌9株,其中FH01菌株抑菌效果最好,且對供試菌的抑菌譜廣,對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為14.92 mm和12.36 mm,對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌的菌絲抑制率分別為82.10%、81.52%、75.06%、67.10%。經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA鑒定,內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicusstrain)。

鳳凰單叢茶,內(nèi)生細(xì)菌,抑菌,分離,鑒定

植物內(nèi)生菌(Endophyte)是指一類在其部分或全部生活史中存活于健康植物各種組織內(nèi)部或細(xì)胞間隙,而不使宿主產(chǎn)生明顯病理癥狀的微生物[1]。拮抗內(nèi)生菌是指能夠產(chǎn)生拮抗作用的微生物。研究表明拮抗內(nèi)生菌的生物學(xué)功能包括產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)[2]、增強(qiáng)宿主的抗病性[3]、提高植物的生產(chǎn)力[4]、抗逆抗蟲[5]、具有除草劑活性[6]等。目前從植物中分離的內(nèi)生細(xì)菌大多為假單胞菌屬(Pseudomonas)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、腸桿菌屬(Enterobacter)以及土壤桿菌屬(Agrobacterium)等[7]。

朱育菁對福建寧德地區(qū)的大白毫和福云六號茶樹葉片進(jìn)行內(nèi)生菌的分離和脂肪酸鑒定。結(jié)果分離出的內(nèi)生菌株Eb659為放射根瘤菌,對番茄青枯雷爾氏菌、西瓜細(xì)菌性果斑病、棉花黃萎病大麗輪枝菌具有抑菌作用[8]。徐亞軍從野生艾蒿分離出對棉花枯萎病原菌抑菌效果最明顯的3株內(nèi)生菌,結(jié)合生理生化特性、菌落特征、細(xì)胞形態(tài)特征和16S rDNA鑒定,菌株L8、S11和R6分別為Bacillussubtilis,Bacilluscereus,Paenibacilluspolymyxa[9]。

鳳凰單叢茶產(chǎn)于潮州市鳳凰山,以滋味濃醇鮮爽,香氣似天然花果香著稱[10],種植歷史悠久,種質(zhì)資源豐富,已達(dá)80多個品系[11-12]。目前對鳳凰單叢茶的研究主要集中在品種鑒定、遺產(chǎn)多樣性分析[13-14]、品質(zhì)化學(xué)特性[15-16]、生理活性[17]、質(zhì)量安全[18]和做青工藝[19]的研究,對于鳳凰單叢茶樹內(nèi)生菌的研究未見報(bào)道。因此對鳳凰單叢茶樹內(nèi)生菌進(jìn)行分離,從中篩選出具有抑菌活性的拮抗菌株,為新型生物抗菌劑的研究開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品為茶樹的根莖葉,采集于廣東省潮州市饒平縣浮濱鎮(zhèn),樹齡25年,海拔為750 m,品種為鳳凰單叢茶水仙,有機(jī)種植;試驗(yàn)指示細(xì)菌A大腸桿菌(Escherichiacoli)、B枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、C金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、P白色念珠球菌(Moniliaalbican)韓山師范學(xué)院微生物試驗(yàn)室;植物病原菌D梨果黑斑病菌(Alternariaalternate)、E核桃葉枯病菌(Sphaerulinajuglandis)、F梨腐爛病菌(ValsaambiensPers)、G紅棗黑斑病菌(Alternariasp)、茄H腐鐮刀病菌(Fusarium)、X瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、Y立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani),新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒生物生工(上海)有限責(zé)任公司。

LD2X-30KA型立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋、DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱武漢諾貝思機(jī)械制造有限公司;TGRADIENT型PCR儀、PowerPac型電泳儀、Fluorchem Xplor型熒光-可見光凝膠成像分析系統(tǒng)北京弘圖科技有限公司。

1.2培養(yǎng)基

水瓊脂培養(yǎng)基:瓊脂25 g、蒸餾水1000 mL,121 ℃,滅菌15 min;營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1000 mL,121 ℃,滅菌15 min。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基:牛肉膏5 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉 5 g、蒸餾水 1000 mL、pH7.0～7.2、121 ℃,滅菌15 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯浸出粉6 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g、蒸餾水1000 mL,121 ℃,滅菌15 min。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1內(nèi)生細(xì)菌分離與純化消毒方法參考劉杰鳳[20]改進(jìn)如下:先將根與莖剪成5 cm長,用75%乙醇浸泡根、莖和整葉4 min,無菌水沖洗7次,用3.0%的雙氧水浸泡3 min,再用無菌水沖洗10次。

表面消毒后的根和莖,剪成0.5 cm×0.5 cm的組織塊,每三個組織塊為一組置于100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃下培養(yǎng)20 h;表面消毒后整葉剪切成0.5 cm×0.5 cm小片,移入無菌研缽,加入少許滅菌的石英砂和無菌水,研磨。以上處理的樣品分別做10-1、10-2、10-3梯度稀釋后,分別取80 μL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板,37 ℃培養(yǎng)20 h。

挑取單個菌落在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線,37 ℃下培養(yǎng)20 h,觀察細(xì)菌菌落、形態(tài)及個體形態(tài),重復(fù)以上操作,直至得到純化菌落。

1.3.2內(nèi)生拮抗菌株的篩選

1.3.2.1試驗(yàn)指示細(xì)菌與植物病原菌的培養(yǎng)挑取一環(huán)1.1中的試驗(yàn)指示細(xì)菌劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上,37 ℃下培養(yǎng)20 h。挑取一環(huán)1.1中的植物病原菌劃線于PDA培養(yǎng)基上,28 ℃下培養(yǎng)5 d。

1.3.2.2內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液的制備挑取1.3.1中得到的內(nèi)生細(xì)菌純菌落三環(huán)接種于50 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min培養(yǎng)72 h,將發(fā)酵后的菌液經(jīng)5000 r/min離心10 min,取上清液,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,去除菌體,制成內(nèi)生菌無菌發(fā)酵濾液。

1.3.2.3雙層平板法篩選抑制試驗(yàn)指示細(xì)菌的內(nèi)生細(xì)菌參考楊明琰[21]的方法略作改動,滅菌后的水瓊脂15 mL倒在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi),待其凝固,將滅菌的100 mL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右,加入1.25 mL含有1×104～1×105cfu/mL試驗(yàn)指示細(xì)菌的菌液,搖均,取5 mL加到水瓊脂平板上。凝固后用打孔器(外徑8 mm)打孔,孔中加入內(nèi)生細(xì)菌無菌發(fā)酵濾液240 μL,同時在孔中加入無菌水作對照,在4 ℃冰箱放置2 h使無菌發(fā)酵濾液擴(kuò)散,37 ℃培養(yǎng)18 h,測量抑菌圈直徑,作3次重復(fù)。

1.3.2.4平板對峙法篩選抑制植物病原菌的內(nèi)生細(xì)菌參考吳紅玉[22]的方法略作改動,將內(nèi)生細(xì)菌無菌發(fā)酵濾液200 μL涂布于PDA平板上,對照為涂布200 μL無菌水,取直徑為1 cm×1 cm的植物病原菌菌塊放于PDA平板正中央,28 ℃培養(yǎng)5 d,測量菌落直徑,計(jì)算菌絲生長抑制率,作3次重復(fù)。菌絲生長抑制率的計(jì)算公式如下:

式中,B為對照植物病原菌菌落生長直徑(mm);T為涂內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液后植物病原菌菌落生長直徑(mm)。

表1　內(nèi)生拮抗細(xì)菌的種類及抑菌結(jié)果

注:B:枯草芽孢桿菌,C:金黃色葡萄球菌,D:梨果黑斑病菌,E:核桃葉枯病菌,G:紅棗黑斑病菌,H:茄腐鐮刀病菌,X:瓜果腐霉,Y:立枯絲核菌,-:無抑制性。

1.3.3內(nèi)生細(xì)菌形態(tài)特征觀察觀察菌落特征,挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色,觀察個體形態(tài)。

1.3.4生理生化試驗(yàn)根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版[23]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[24]選擇V-P試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、運(yùn)動性試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、4 ℃生長試驗(yàn)、酪素水解試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、脲酶水解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、15%鹽度生長試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、產(chǎn)酸試驗(yàn)對拮抗細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.3.5內(nèi)生拮抗細(xì)菌的16S rDNA鑒定

1.3.5.1內(nèi)生細(xì)菌DNA的提取按照細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒的步驟提取內(nèi)生細(xì)菌的DNA。

1.3.5.2PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系程序的設(shè)計(jì)參考Zhao[25]的方法,引物選用細(xì)菌通用引物,引物27F序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,引物1492R序列為5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。20 μL PCR擴(kuò)增體系:引物27F和引物1492R各1.0 μL、2×Tap PCR Master mix 7.0 μL、內(nèi)生細(xì)菌的DNA混合液1.0 μL、雙蒸水10.0 μL。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s,從變性到延伸30個循環(huán),72 ℃延伸7 min,保溫4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖電泳,EB染色后由熒光—可見光凝膠成像分析系統(tǒng)檢測。

1.3.5.3擴(kuò)增產(chǎn)物測序及序列分析將16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工基因測序研究中心進(jìn)行測序。把測得的序列輸入NCBI,與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對。采用MEGA5.0軟件對序列進(jìn)行ClustalW對比、采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離純化結(jié)果

從鳳凰單叢茶樹根莖葉中分離出內(nèi)生細(xì)菌共9株,分別命名為FH01～FH09。

2.2內(nèi)生拮抗菌株的篩選結(jié)果

抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示FH02、FH03、FH04、FH06、FH07對試驗(yàn)細(xì)菌指示菌和植物病原菌均無抑菌性,分離出的所有內(nèi)生細(xì)菌對白色念珠球菌、大腸桿菌和梨腐爛病菌均無抑制作用。

如表1、圖1和圖2所示,從莖中分離出的FH01對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、瓜果腐霉、立枯絲核菌均有抑菌活性。對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到14.92 mm和12.36 mm,對梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、立枯絲核菌的菌絲抑制率分別為82.10%、81.52%、75.06%和67.10%,對瓜果腐霉的菌絲抑制率很低。

從根中分離出的FH05對枯草芽孢桿菌、梨果黑斑病菌、紅棗黑斑病菌、瓜果腐霉、立枯絲核菌有抑菌活性。從葉中分離出的FH08對核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、茄腐鐮刀病菌、瓜果腐霉有抑菌活性,對核桃葉枯病菌、茄腐鐮刀病菌的菌絲抑制率達(dá)到了80%以上。從葉中分離出的FH09對梨果黑斑病菌有抑菌活性。

內(nèi)生細(xì)菌FH01的抑菌效果最好,且對供試菌的抑菌譜最廣,故對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定。

圖1　內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01對試驗(yàn)指示菌的抑菌效果Fig.1 The bacteriostatic effect of endophytic antagonistic bacterium FH01注:B枯草芽孢桿菌,C金黃色葡萄球菌。

圖2　內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01對植物致病菌的抑菌效果Fig.2　The bacteriostatic effect of endophytic antagonistic bacterium FH01注:D梨果黑斑病菌,E核桃葉枯病菌,G紅棗黑斑病菌,Y立枯絲核菌。

2.3內(nèi)生拮抗菌株FH01的形態(tài)特征觀察

FH01菌落形態(tài)和個體形態(tài)如圖3和圖4所示,菌落為白色,干燥,不透明,中間褶皺凸起,周邊放射狀。短桿狀,成對或單個,革蘭氏染色為陽性菌。

圖3　FH01的菌落形態(tài)Fig.3　Colony form of FH01

圖4　FH01個體形態(tài)Fig.4　Individual form of FH01

2.4內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的生理生化試驗(yàn)

結(jié)果見表2,根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》,內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.5內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的16S rDNA鑒定結(jié)果

如圖5所示,內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳約在1500 bp處出現(xiàn)熒光條帶。

經(jīng)測定,內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的16S rDNA基因片段為1453 bp,序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,用 Blast軟件在 GenBank 網(wǎng)站上進(jìn)行相似性搜索,獲取相近典型菌株的16S rDNA基因序列,采用MEGA5.0軟件對序列進(jìn)行ClustalW對比、采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果及進(jìn)化樹如圖6：

表2　內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的生理生化結(jié)果

圖5　內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01瓊脂糖凝膠電泳Fig.5　The agarose gel electrophoresis of endophytic antagonistic bacterium FH01

圖6　內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6　Phylogenetic trees of endophytic antagonistic bacterium FH01

注:+表示陽性反應(yīng),-表示陰性反應(yīng)。

由圖6可以看出,FH01與Bacillusmethylotrophicusstrain HB24的親緣關(guān)系最近,相似度為99%,可判斷FH01菌株為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicusstrain)。

3　結(jié)論

從鳳凰單叢茶樹中篩選出內(nèi)生細(xì)菌9株,FH01、FH05、FH08和FH09至少對一種供試菌具有抑菌效果,內(nèi)生拮抗細(xì)菌FH01對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、梨果黑斑病菌、核桃葉枯病菌、紅棗黑斑病菌、瓜果腐霉、立枯絲核菌具有較好的抑菌作用,經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)及16S rDNA鑒定,FH01為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicusstrain)。

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Isolation and identification of endophytic bacteria from Fenghuang dancong tea

CAI Li1,OU Yan-qing2,HOU Xiao-zhen3,WANG Jin-liang4,FU Li3,*

(1.College of Food Science and Pharmaceutical Science,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China; 2.The Science Research Center of Chaozhou Tea,Chaozhou 521041,China; 3.School of Life Science and Food Technology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China; 4. Guangdong Raoping Jin Lixiang Ecological Tea Industry Co.,Ltd.,Chaozhou 515725,China)

The aim of this study was to isolate endophytic bacteria and screen endophytic antagonistic bacteria from Fenghuang dangcong tea tree.The study could provide theoretical basis for research and development of new biological antibacterial agent. The endophytic bacteria were isolated and purified from Fenghuang dangcong tea tree. The experiments of inhibition activity of endophytic bacteria against tested bacteria by double-plate method and against tested plant pathogenic fungi by flat-stand method were conducted. The endophytic bacteria were identified by morphology,physiological-biochemical experiments and the sequence of 16S rDNA. The results showed that the total of 9 endophytic bacteria were isolated. The endophytic antagonistic bacterium FH01 showed obvious inhibition activity and had a wide antimicrobial spectrum to the tested germs,and the diameters of inhibition zones of FH01 strain againstBacillussubtilisandStaphylococcusaureuswere 14.92 mm and 12.36 mm respectively. The hyphae inhibition rate of FH01 strain againstAlternariaalternate,Sphaerulinajuglandis,Alternariasp andRhizoctoniasolaniwere 82.10%,81.52%,75.06%,67.10% respectively. The antagonistic bacterium FH01 was identified asBacillusmethylotrophicusstrain by physiological-biochemical experiments and the sequence of 16S rDNA.

Fenghuang dancong tea;endophytic bacteria;inhibition activity;isolation;identification

2016-04-25

蔡麗(1989-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：1056203254@qq.com。

傅力(1964-)，女，教授，研究方向：食品生物技術(shù)，E-mail：fl1990@163.com。

廣東省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020419011)；潮州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015N05)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)10-0246-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.041