鮑魚殼煅燒物抗菌活性初步研究

顏瑩芬,章超樺,盧虹玉,鄭惠娜,曹文紅,秦小明

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),廣東湛江 524088)

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鮑魚殼煅燒物抗菌活性初步研究

顏瑩芬,章超樺*,盧虹玉,鄭惠娜,曹文紅,秦小明

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室,水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室,國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江),廣東湛江 524088)

研究鮑魚殼煅燒物對幾種常見致病菌的體外抗菌活性。采用濾紙片法和牛津杯雙層瓊脂擴散法測試不同溫度段鮑魚殼煅燒物對受試菌的抑制作用,并用瓊脂梯度稀釋法確定最小抑菌濃度(MIC)。結(jié)果表明:當(dāng)煅燒溫度段≥800 ℃,鮑魚殼煅燒物對幾種常見致病菌均有較強的抑制作用,尤其對金黃色葡萄球菌和銅綠假單鮑菌具有顯著的抑制作用(p<0.05),MIC分別為1 mg/mL和0.5 mg/mL;并且在一定溫度范圍內(nèi),其對受試菌的抑制能力均隨煅燒溫度的升高而顯著增加,在1100 ℃煅燒溫度上抗菌效果最好。

鮑魚殼,抗菌活性,最小抑菌濃度(MIC),煅燒溫度

我國是鮑魚養(yǎng)殖大國,南起海南省,北到遼寧省沿海均有鮑魚分布,其中皺紋盤鮑(HaliotisdiscushannaiIno)產(chǎn)量已占我國鮑魚總產(chǎn)量70%以上,每年產(chǎn)生近千噸鮑魚殼,資源豐富[1]。

關(guān)于鮑魚殼綜合利用研究方面,目前較多的集中在醫(yī)學(xué)和生物色素制備方面。在醫(yī)學(xué)應(yīng)用上的研究,馬愛翠等研究發(fā)現(xiàn)鮑魚殼水提物能抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)活性[2];劉爽等從鮑魚殼中提取水溶性生物堿,具有強而持久的降壓作用[3];同時在治療白內(nèi)障、角膜炎、葡萄膜炎等方面都有一定的療效[3-8];居明喬通過研究表明鮑魚殼粉在用于治療胃潰瘍、胃炎等胃酸過多的患者,具有較好的效果[9]。在制備生物色素方面,陳忻等優(yōu)化了鮑魚殼中甲殼素的提取條件[10];其后梁紅寶等陸續(xù)開展了鮑魚殼水溶性基質(zhì)的體外抗氧化活性和鮑魚殼中水溶性色素研究報道[11-12];Cai等研究了鮑魚殼中藍(lán)色素提取及理化性質(zhì)[13]。目前關(guān)于鮑魚殼不同溫度煅燒物抗菌活性尚未見報道。

系統(tǒng)地研究鮑魚殼的抑菌活性,進(jìn)一步開發(fā)研究新的抗菌藥物,成為越來越多學(xué)者關(guān)注的目標(biāo),對開發(fā)和利用我國寶貴海洋資源也具有十分重要的意義。本文旨在通過對鮑魚殼體外抗菌活性的初步研究,為其在食品和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域綜合利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

皺紋盤鮑產(chǎn)自福建寧德,洗凈,用超微粉碎機粉碎后封裝;標(biāo)準(zhǔn)菌株金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、銅綠假單鮑菌(ATCC27853)、糞腸球菌(CMCC32219)和大腸埃希氏菌(ATCC25922)來源于北京微生物研究所;營養(yǎng)瓊脂和瓊脂粉杭州天和微生物研究所;CaO分析純，天津津匯太亞化學(xué)試劑有限公司;0.9%生理鹽水福州海王福藥制藥有限公司;自制蒸鎦水。

KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山舒美超聲有限公司;YSC701型超微粉碎機北京燕山正德機械有限公司;BHC-1500B2型生物安全柜蘇州長留凈化科技有限公司;SX-2.5-12型高溫馬弗爐上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;DHP-260型電熱恒溫箱常州光和電子科技有限公司;牛津杯(內(nèi)徑Φ6 mm×8 mm×10 mm)上海陸斯精密儀器有限公司;LMQ.C-80E型高壓滅菌器山東新華醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1鮑魚殼煅燒物制備用超微粉碎機將鮑魚殼粉碎,過100目篩。稱取適量粉碎好的鮑魚殼于坩堝中,分別設(shè)置溫度為0、400、600、800、900、1000、1100 ℃,煅燒1 h。然后將其封袋放置于干燥器中。精確稱量樣品,用紫外線輻射30 min,確保滅菌。再分別用無菌水配制濃度為0.25 g/mL不同煅燒溫度的鮑魚殼混懸液備用。

1.2.2菌液的制備將實驗菌種金黃色葡萄球菌、銅綠假單鮑菌、糞腸球菌和大腸埃希氏菌分別接種于營養(yǎng)瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h活化,實驗前配制濃度為1×108cfu/mL細(xì)菌稀釋液備用[14]。

1.2.3濾紙片法采用濾紙片法測定抑菌作用[15]。在無菌培養(yǎng)皿倒入15 mL滅菌后的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,冷卻凝固,分別吸取0.1 mL菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面,放置直徑為6 mm滅菌的圓形濾紙片,吸取10 μL鮑魚殼混懸液,依次加到濾紙片上。每個試樣做三個重復(fù),并以無菌水做陰性對照。最后將培養(yǎng)基置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,用游標(biāo)卡尺采用十字交叉法測量抑菌圈直徑,來比較抑菌效果。

1.2.4牛津杯雙層平板擴散法采用牛津杯法[16],在滅菌平皿中倒入10 mL的2%瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,均勻放入已滅菌的牛津杯數(shù)個,將15 mL經(jīng)過高壓滅菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基冷卻至50 ℃,加入預(yù)先配制好的菌液1 mL,混勻后倒入平皿中。用移液器吸取配制好的不同煅燒溫度的鮑魚殼混懸液100 μL,加入到檢測平板圓孔內(nèi),每個試樣做三個重復(fù),并以無菌水做陰性對照。然后將平皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24 h后觀察結(jié)果。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑,來比較抑菌效果。

1.2.5瓊脂梯度稀釋法采用瓊脂梯度稀釋法[17],測定鮑魚殼粉對受試菌的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度。稱取不同質(zhì)量(0、1.88、3.75、7.5、15、30、60 mg)的干燥樣品在紫外線輻射30 min,然后分別加入15 mL冷卻至50 ℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,混勻傾注于培養(yǎng)皿中,直至凝固成膠。吸取配制好的菌液100 μL至培養(yǎng)基表面,用無菌涂布器均勻涂布。重復(fù)三個平板,以不加鮑魚殼粉只加菌懸液為對照。將培養(yǎng)基置于37 ℃下進(jìn)行培養(yǎng),24 h進(jìn)行觀察。將平板置于暗色無反光物體表面上觀察,以菌落計數(shù)少于5個的最低樣品濃度為MIC。

1.2.6數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,組間比較采用方差檢驗。

2　結(jié)果與分析

2.1濾紙片法

通過濾紙片實驗得到鮑魚殼煅燒物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和大腸桿菌的抑菌效果如圖1所示。其對4種常見致病菌的抑菌圈直徑如表1所示。其結(jié)果顯示,鮑魚殼未煅燒和在800 ℃以下較低煅燒溫度下對4種常見致病菌的抑菌效果不明顯,而高溫煅燒的鮑魚殼則抑菌效果明顯,其中對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有較強的抑菌效果。

圖1　鮑魚殼煅燒物對幾種常見致病菌的抑制作用(紙片法)Fig.1　Inhibitory activity of abalone shell to common pathogenic bacteria

表1　鮑魚殼煅燒物對常見致病菌的抑菌活性濾紙片法結(jié)果(mm,n=3,x±s)

注:抑菌圈直徑在20 mm以上為極敏,15～20 mm為高敏,10～14 mm為中敏,10 mm 以下為低敏；“-”表示無抑菌圈。

表2　鮑魚殼煅燒物對常見致病菌的抑菌活性牛津杯法結(jié)果(mm,n=3,x±s)

注:“-”表示無抑菌圈,不同字母表示煅燒物溫度間差異p<0.05。

2.2牛津杯雙層平板擴散法

依據(jù)濾紙片法的結(jié)果,選擇煅燒溫度分別為600、800、900、1000、1100 ℃的鮑魚殼進(jìn)行牛津杯雙層平板擴散實驗,結(jié)果如表2所示。當(dāng)煅燒溫度高于800 ℃時,高溫煅燒鮑魚殼具有較強的抑菌效果,且對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌具有顯著的抑制作用(p<0.05),這與濾紙片法的結(jié)果相符合。同時結(jié)果表明,隨著鮑魚殼煅燒溫度的增加,抑菌圈直徑也不斷擴大,顯示抑菌效果的增強。抑菌圈的大小一方面受到抑菌成分的影響,另一方面還受到溶劑擴散速度的影響。因此,牛津杯雙層平板擴散實驗只能定性判斷鮑魚殼煅燒物有無抑菌效果[18]。

2.3不同煅燒溫度鮑魚殼粉對常見致病菌的MIC的測定

鮑魚殼煅燒物的最低抑菌濃度結(jié)果見表3,高溫煅燒鮑魚殼成分主要為CaO,因此選擇化學(xué)試劑CaO為陽性對照。鮑魚殼在1100 ℃溫度的煅燒物對金黃色葡萄球菌的MIC為1.0 mg/mL;對銅綠假單胞菌的MIC為0.5 mg/mL;對糞腸球菌的MIC為2 mg/mL;對大腸桿菌的MIC為2 mg/mL。其MIC均小于CaO陽性對照,鮑魚殼煅燒物的抗菌有效性進(jìn)一步被MIC值所證實。同時,隨著煅燒溫度的增強,MIC濃度逐漸降低,在1100 ℃煅燒溫度上抑菌效果最佳。

表3　鮑魚殼煅燒物對常見致病菌的最小抑菌濃度(MIC)

注:ND為未檢測出。

3　討論與結(jié)論

鮑魚殼煅燒物對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌和大腸桿菌均有明顯的抑制作用,其中其對金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌為高度敏感,抑菌圈直徑達(dá)22.50～23.49 mm。最低抑制濃度實驗表明鮑魚殼煅燒物對銅綠假單胞菌的抑制作用最強,MIC為0.5 mg/mL,進(jìn)一步驗證了濾紙片法和牛津杯法的實驗結(jié)果;三種實驗方法也均顯示:隨著煅燒溫度增加,鮑魚殼的抑菌效果增強。分析其抑菌機制:一是,高溫煅燒使鮑魚殼粉在分子結(jié)構(gòu)上發(fā)生了特殊的變化,煅燒越完全,其越具有更好的穩(wěn)定性和抑菌效果[19-20]。二是,鮑魚殼粉煅燒物通過一定鈣離子濃度,改變細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的電荷狀態(tài),引起細(xì)菌細(xì)胞膜電荷的變化,來破壞其正常的生理功能[19];同時,鈣對呼吸作用有關(guān)的酶有直接調(diào)控作用,從而使呼吸強度下降[21],最終達(dá)到抑菌作用。三是,鮑魚殼粉煅燒物含有銅、鋅等具有抑菌作用的微量元素[22],對蛋白質(zhì)、核酸合成、腸道蛋白的吸收和消化發(fā)揮重要生理功能,從而促進(jìn)生長發(fā)育,增強吞噬細(xì)胞吞噬能力、趨化活力及殺菌作用[23]。四是,鮑魚殼粉煅燒物的吸附作用,形成一層分子膜,阻止了營養(yǎng)物質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)運輸,從而起到殺菌和抑菌作用[24]。

研究表明鮑魚殼煅燒物對幾種常見致病菌具有顯著抑菌效果,這為鮑魚殼傳統(tǒng)用途提供了數(shù)據(jù)支持,顯示了其在抗菌藥物研發(fā)中的潛力。但是本研究僅僅檢驗了鮑魚殼煅燒物的抑菌活性,表明其具有廣譜的抗菌性能,對鮑魚殼煅燒物抗菌的機制還有待進(jìn)一步深入研究。

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The preliminary study on antibacterial activity of abalone shell calcinate

YAN Ying-fen,ZHANG Chao-hua*,LU Hong-yu,ZHENG Hui-na,CAO Wen-hong,QIN Xiao-ming

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Products Processing and Safety,Key Laboratory of Advanced Processing of Aquatic Products of Guangdong Higher Education Institution,National Research and Development Branch Center for Shellfish Processing(Zhanjiang),Zhanjiang 524088,China)

The antibacterial activities of abalone shell calcinate against the common pathogenic bacteria were studied. Both of filter paper and Oxford cup double agar diffusion methods were used to detect the constrain on the specific bacteria of different temperature rangesbalone shell calcinate,while the minimal inhibitory concentration(MIC)was determined by agar gradient dilution method. The results showed that abalone shell calcinate inhibited strongly against those common pathogenic bacteria in the calcining temperature ranges≥ 800 ℃,especially significantly forStaphylococcusaureusandPseudomonasaeruginosa(p<0.05). MIC was 1 mg/mL and 0.5 mg/mL. And within a certain temperature range,the inhibition ability increased with the calcining temperatures,with the optimal antimicrobial calcining temperature at 1100 ℃.

abalone shell;antibacterial activity;minimal inhibitory concentration(MIC);calcining temperature

2015-12-22

顏瑩芬(1979-),女,碩士研究生,研究方向:海洋生物資源利用,E-mail:yc3873795@126.com。

章超樺(1956-),男,博士,教授,研究方向:海洋生物資源綜合利用研究,E-mail:zhangch2@139.com。

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CAR-48-07B)。

TS254.9

A

1002-0306(2016)10-0158-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.023