山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的超濾分離及其體外抗氧化活性

楊光明,李　萌,張玉玲,李偉東,潘　揚(yáng),*,蔡寶昌,*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室,國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心,江蘇南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所,江蘇南京 210023)

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山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的超濾分離及其體外抗氧化活性

楊光明1,李萌2,張玉玲2,李偉東1,潘揚(yáng)2,*,蔡寶昌1,*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué),江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室,國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心,江蘇南京 210023;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所,江蘇南京 210023)

目的:通過(guò)超濾分離中藥山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的最佳有效部位,并比較各截留產(chǎn)物的理化性質(zhì)和體外抗氧化作用。方法:以山茱萸為美拉德反應(yīng)底物,經(jīng)高溫反應(yīng)后獲得反應(yīng)產(chǎn)物。采用中空纖維膜對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)過(guò)濾,過(guò)膜級(jí)數(shù)為0.45、0.22 μm、100、50、10、4 ku,對(duì)各分級(jí)截留產(chǎn)物分別進(jìn)行冷凍干燥并測(cè)定它們的理化特性(紫外吸收和褐變程度);同時(shí)觀察它們對(duì)DPPH自由基的清除能力和對(duì)鐵氰化鉀的還原能力。結(jié)果:不同截留產(chǎn)物的紫外吸收曲線基本類同,且在284 nm處均有最大吸收。相比之下,0.45～0.22 μm截留產(chǎn)物的褐變程度最大,同時(shí)其自由基清除率和還原能力也最高。結(jié)論:提示山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中抗氧化的最佳活性部位為0.45～0.22 μm的超大分子類物質(zhì)。

山茱萸,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,超濾,類黑精,抗氧化

美拉德反應(yīng)[1]的中間體和終產(chǎn)物統(tǒng)稱為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(MRPs)。中間階段產(chǎn)物包括5-羥甲基糠醛、丙烯酰胺等還原酮、醛及雜環(huán)化合物,終產(chǎn)物為大分子物質(zhì)類黑精[2]。人們對(duì)MRPs影響食品風(fēng)味、顏色、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的研究較多,近年來(lái)MRPs的抗氧化、抗菌等活性也引起學(xué)者重視[3-4]。

美拉德反應(yīng)廣泛存在于中藥炮制過(guò)程中[5],因此其對(duì)于飲片生產(chǎn)具有特殊的意義。山茱萸為CornusofficinalsSieb. et Zucc.的成熟果肉,作為滋補(bǔ)中藥被衛(wèi)生部列入“可用于保健食品的物品名單”。山茱萸中主要含有還原糖、多糖、有機(jī)酸、環(huán)烯醚萜類、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)、氨基酸、黃酮、三萜、內(nèi)酯、揮發(fā)油、維生素、脂肪酸及微量元素等[6]。臨床山茱萸酒制入藥,具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效[7]。山茱萸炮制后美拉德反應(yīng)底物如糖、氨基酸和活性成分如環(huán)烯醚萜的含量有所下降,但藥效卻明顯增加[8];山茱萸炮制使得顏色加深并賦予其特殊的氣味,表明炮制中發(fā)生了美拉德反應(yīng),其褐變程度及MRPs是影響制山茱萸藥效的重要因素。有學(xué)者利用還原糖與氨基酸進(jìn)行模式美拉德反應(yīng),并對(duì)其MRPs進(jìn)行研究[9-11],特別是中間階段的小分子產(chǎn)物,證明丙烯酰胺[12]和5-羥甲基糠醛[13]與抗氧化活性成正比;對(duì)懷地黃炮制中的美拉德反應(yīng)與藥效變化的探索也是基于中段反應(yīng)產(chǎn)物[14]。而對(duì)于終產(chǎn)物的類黑精,因其結(jié)構(gòu)復(fù)雜[15],至今研究甚少,僅見超濾分離模式美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[16]。

本實(shí)驗(yàn)以山茱萸為美拉德反應(yīng)底物,經(jīng)高溫反應(yīng)后獲得MRPs;采用超濾技術(shù)對(duì)MRPs進(jìn)行分級(jí)過(guò)濾,對(duì)各分級(jí)截留產(chǎn)物進(jìn)行冷凍干燥,測(cè)定其理化特性,觀察其對(duì)DPPH自由基的清除能力和對(duì)鐵氰化鉀的還原能力,以期探索山茱萸MRPs抗氧化作用的有效部位,為山茱萸的炮制生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

葡萄糖、氯化鐵國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甘氨酸Amresco公司；氫氧化鈉購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司;三氯乙酸上?；瘜W(xué)試劑有限公司;磷酸二氫鈉汕頭金砂化工廠;磷酸氫二鈉汕頭西隴化工廠;鐵氰化鉀上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;蘆丁對(duì)照品中國(guó)藥品生物制品檢定所;DPPH(1,1-二苯-2-苦基肼,aladdin)、甲醇(分析純)南京化學(xué)試劑有限公司;山茱萸(原藥材)由安徽豐原銅陵中藥飲片有限公司提供,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所潘揚(yáng)教授鑒定為山茱萸科植物山茱萸CornusofficinalsSieb. et Zucc.的干燥成熟果肉。

多功能提取罐上海順儀科技公司;冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司;中空纖維膜天津愛生膜技術(shù)有限公司;中空纖維膜設(shè)備上海朗極化工科技有限公司;JA1103N型電子天平上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;電熱恒溫干燥箱上海索譜儀器有限公司;UV-2401PC紫外檢測(cè)器日本島津制作所;純水機(jī)南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀瑞士BUCHI公司;循環(huán)水式多用真空泵南京科爾儀器設(shè)備有限公司;RJ-TGL-16臺(tái)式高速離心機(jī)無(wú)錫瑞江分析儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品處理山茱萸原藥材采用酒蒸方式進(jìn)行炮制處理,前期實(shí)驗(yàn)表明,山茱萸酒蒸24 h后其產(chǎn)物的含水量、pH以及系統(tǒng)組分基本趨于穩(wěn)定,因此以下實(shí)驗(yàn)全部采用酒蒸24 h的方式處理。

1.2.1.1藥材炮制取凈山萸肉1.5 kg,按照2015版中國(guó)藥典中酒蒸方法炮制,按比例加入20%輔料黃酒,拌勻,置密閉容器中悶潤(rùn),待黃酒被吸盡,于蒸鍋內(nèi)密閉隔水加熱,于24 h取出,置減壓干燥箱中50 ℃干燥,作為山茱萸炮制品。

1.2.1.2超濾前樣品處理取山茱萸炮制品,置于多功能提取罐中水煎煮提取兩次,每次1 h,第一次加10倍量水,第二次加8倍量水,合并兩次濾液,六層紗布過(guò)濾。取濾液,5000 r·min-1離心15 min,取上清液減壓抽濾,以除去濾液中的固體顆粒及膠體物質(zhì),提高中空纖維膜的壽命。

1.2.1.3超濾采用中空纖維膜分級(jí)過(guò)濾,過(guò)膜級(jí)數(shù)分別為0.45、0.22 μm,100、50、10、4 ku。將中空纖維膜連接到中空纖維膜設(shè)備上,設(shè)置操作壓力為0.1～1.0 MPa,溫度:室溫,電壓:50 V。當(dāng)藥液經(jīng)由水泵進(jìn)入中空纖維膜時(shí),小分子物質(zhì)和溶劑可以進(jìn)入中空纖維膜內(nèi),大分子物質(zhì)被截留在膜表面。經(jīng)中空纖維膜的作用,將藥液分離得成<4 ku、10～4 ku、50～10 ku、100～50 ku、0.22 μm～100 ku和0.45～0.22 μm等六個(gè)級(jí)別截留分子量的流份。每個(gè)超濾完畢,用0.15%NaOH溶液進(jìn)行膜清洗,使超濾膜恢復(fù)通量,并用0.015% NaOH水溶液浸泡膜系統(tǒng),防止超濾膜被藥液殘留腐壞,有利于恢復(fù)膜通量[17]。根據(jù)山茱萸炮制品的投藥量和得到的各分級(jí)流份固體的重量,計(jì)算得率。

1.2.1.4超濾后樣品處理使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對(duì)各截留分子量的濾液進(jìn)行濃縮,再經(jīng)冷凍干燥制得各分級(jí)流份的固體。將各分級(jí)流份配制成20 mg·mL-1的溶液,作為母液備用。

1.2.2理化特性測(cè)定

1.2.2.1全波長(zhǎng)掃描配制含有0.04 mol·L-1的葡萄糖和0.02 mol·L-1的甘氨酸的混合溶液,在100 ℃水浴中回流加熱24 h,作為模式MRPs溶液;另取山茱萸炮制品0.5 g,用水煮沸30 min,制成5%的水溶液;各分級(jí)流份母液均用水稀釋至0.2 mg·mL-1,所有樣品溶液在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.2.2.2褐變程度的測(cè)定取分級(jí)流份母液,用水稀釋至6 mg·mL-1,置420 nm處測(cè)定吸光度;另取分級(jí)流份母液,用水稀釋至0.1 mg·mL-1,置284 nm處測(cè)定吸光度,每個(gè)樣品均平行測(cè)定3次。

1.2.2.3DPPH自由基清除能力的測(cè)定DPPH自由基清除能力的測(cè)定采用改進(jìn)的文獻(xiàn)方法[18]。將各分級(jí)流份母液分別用水稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的溶液。取樣品溶液2 mL,加入2 mL 0.25 mmol·L-1的DPPH甲醇溶液中,輕微振蕩混勻,將反應(yīng)體系置于暗處反應(yīng)30 min,測(cè)定反應(yīng)液在517 nm處的吸光值,記為Asample。以2 mL純水(空白)代替樣品溶液,同法操作,吸光值記為Ablank。此外,以甲醇(調(diào)零)代替DPPH溶液,同法操作,記為Acontrol。每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定3次。DPPH自由基清除率(%)計(jì)算公式如下:

DPPH自由基清除率(%)=[Ablank-(Asample-Acontrol)]/Ablank×100

1.2.2.4鐵氰化鉀還原能力的測(cè)定鐵氰化鉀還原能力的測(cè)定采用改進(jìn)后的Oyaizu法[19]。將各分級(jí)流份母液分別配制成2、4、6、8、10 mg·mL-1的溶液,取樣品溶液1 mL,加入1 mL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol·L-1,pH6.6,以62.5%磷酸二氫鈉、37.5%磷酸氫二鈉配制而成)和1 mL 1%的鐵氰化鉀溶液,振蕩混勻。50 ℃水浴保溫20 min,加入1 mL 10%的三氯乙酸,振蕩搖勻后5000 r·min-1離心10 min,取上清液1 mL,加入1 mL純水和200μL 0.1%的三氯化鐵溶液,振蕩數(shù)秒后靜置15 min,測(cè)定其在700 nm處的吸光值A(chǔ)sample。以1 mL純水代替樣品,相同操作,記為Ablank。此外,以純水代替所加入的三種試劑,相同操作,記為Acontrol。每個(gè)濃度樣品平行測(cè)定3次。鐵氰化鉀還原能力計(jì)算公式如下:

鐵氰化鉀還原能力=Asample-Ablank-Acontrol

2　結(jié)果與分析

2.1超濾后各截留分子量MRPs得率

超濾后各截留分子量MRPs得率見表1。

表1　山茱萸MRPs超濾后不同分級(jí)截留產(chǎn)物得率

由表1可知,不同分級(jí)截留產(chǎn)物得率由大到小依次為:小于4 ku>10～4 ku>100～50 ku>0.22 μm～100 ku>0.45～0.22 μm>50～10 ku。其中,小于4 ku分子截留產(chǎn)物得率最高。

2.2全波長(zhǎng)掃描結(jié)果

美拉德反應(yīng)為氨基和羰基的反應(yīng),以葡萄糖-甘氨酸體系進(jìn)行簡(jiǎn)單的模式美拉德反應(yīng)[20-21],作為山茱萸美拉德反應(yīng)的對(duì)照。在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi),測(cè)定葡萄糖-甘氨酸體系反應(yīng)0 h和24 h,以及山茱萸原藥材與炮制品的紫外吸收,結(jié)果見圖1,超濾后不同分級(jí)截留流份的紫外吸收光譜見圖2。

圖1　山茱萸原藥材及MRPs的全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1　A full wavelength scan of Fructus corni and its MRPs

圖2　山茱萸MRPs各分級(jí)截留流份的全波長(zhǎng)掃描Fig.2　A full wavelength scan of each molecular weight cutoff of Fructus corni MRPs

由圖1可以看出山茱萸原藥材和葡萄糖-甘氨酸反應(yīng)0 h時(shí),在284 nm處均無(wú)明顯吸收;而反應(yīng)24 h后,炮制品與模式反應(yīng)體系在284 nm處均有最大吸收。由此推斷,在284 nm處產(chǎn)生吸收的物質(zhì)為新產(chǎn)生的山茱萸MRPs。一般認(rèn)為,引起284 nm光吸收的MRPs是反應(yīng)中間階段的無(wú)色小分子,主要為呋喃類、吡喃類、吡啶類、糠醛類及其衍生物,此類物質(zhì)已被證實(shí)為香味物質(zhì)做貢獻(xiàn)。

由圖2可知,山茱萸各分級(jí)截留流份的紫外吸收曲線趨勢(shì)相近,且均在284 nm處均有最大吸收,但吸收強(qiáng)度略有不同,說(shuō)明MRPs超濾后不同分級(jí)截留流份中的化學(xué)組成不同。

2.3褐變程度

284 nm光吸收強(qiáng)度可以代表無(wú)色小分子物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中的含量變化;而美拉德反應(yīng)的最終深色物質(zhì)為類黑精,測(cè)定420 nm吸光度可以表征類黑精的產(chǎn)生情況。取山茱萸MRPs各分級(jí)截留流份溶液。在284 nm和420 nm處分別測(cè)定它們的吸光度,結(jié)果如圖3所示。

圖3　山茱萸MRPs各分級(jí)截留產(chǎn)物在284 nm和420 nm處的吸光度Fig.3　UV absorbance of molecular weight cutoffs of Fructus corni MRPs at 284 nm and 420 nm注:A.<4 ku,B. 10～4 ku,C. 50～10 ku,D. 100～50 ku, E. 0.22 μm～100 ku,F. 0.45～0.22 μm。

在284 nm處,山茱萸MRPs不同分級(jí)段截留產(chǎn)物的吸光度隨分子量的增大呈緩慢增加的趨勢(shì),0.22 μm～100 ku截留產(chǎn)物的吸光度達(dá)到最高,說(shuō)明此截留部位富集了反應(yīng)的中間階段產(chǎn)物;而在420 nm處,不同分級(jí)段截留產(chǎn)物的色值呈明顯的上升趨勢(shì),0.45～0.22 μm截留產(chǎn)物的褐變程度達(dá)到最高,提示此截留部位超大分子的類黑精含量最高。

2.4DPPH自由基清除能力

山茱萸MRPs超濾后各截留分子量段產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,山茱萸MRPs具有顯著的DPPH自由基清除能力,不同分子量段截留產(chǎn)物清除DPPH自由基能力明顯不同,并且隨著MRPs濃度的升高,清除DPPH自由基的能力也相應(yīng)增強(qiáng)。DPPH自由基清除率與樣品濃度呈對(duì)數(shù)關(guān)系,r均大于0.997,對(duì)數(shù)關(guān)系良好。根據(jù)對(duì)數(shù)方程計(jì)算IC50,結(jié)果見表2。

表2　山茱萸MRPs不同分子量截留產(chǎn)物DPPH自由基清除率回歸方程及IC50值

由表2可知,通過(guò)計(jì)算各分級(jí)截留產(chǎn)物的IC50值,得出清除DPPH自由基的能力由大到小依次為:0.45～0.22 μm>0.22 μm～100 ku>50～10 ku>未超濾樣品>100～50 ku>10～4 ku>小于4 ku。但要達(dá)到50%的DPPH自由基清除率,分子量在大于0.45～0.22 μm截留產(chǎn)物所需的濃度最低,說(shuō)明該段截留產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)。

2.5鐵氰化鉀還原能力

以蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定山茱萸MRPs不同分級(jí)截留產(chǎn)物的鐵氰化鉀還原能力,結(jié)果見表3和圖4。

由表3可見,不同分級(jí)截留產(chǎn)物和蘆丁對(duì)鐵氰化鉀均具有一定的還原能力,濃度越高,還原能力越強(qiáng);且均呈現(xiàn)濃度依賴性,r在0.9970～0.9994之間,線性關(guān)系良好。

由圖4可以看出,截留分級(jí)0.45～0.22 μm流份的還原鐵氰化鉀的能力明顯大于其他截留流份;當(dāng)0.45～0.22 μm截留流份的濃度大于6 mg·mL-1時(shí),其還原能力甚至大于陽(yáng)性對(duì)照蘆丁。

表3　山茱萸MRPs不同分子量截留產(chǎn)物鐵氰化鉀還原能力回歸方程

圖4　山茱萸MRPs不同分級(jí)截留產(chǎn)物和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的鐵氰化鉀還原能力Fig.4　Ferricyanide reducing capacity of rutin and different molecular weight cutoff of Fructus corni MRPs注:A.<4 ku,B. 10～4 ku,C. 50～10 ku,D. 100～50 ku,E. 0.22 μm～100 ku,F. 0.45～0.22 μm,G. 蘆丁。

3　結(jié)論

通過(guò)超濾技術(shù)將組成繁雜的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物按分子量分開,有利于有效部位的純化及藥效學(xué)的研究,對(duì)中藥炮制過(guò)程中的美拉德反應(yīng)研究具有一定的參考價(jià)值。山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)超濾得到不同分子截留產(chǎn)物,通過(guò)紫外吸收波長(zhǎng)掃描可知,山茱萸美拉德反應(yīng)不同截留產(chǎn)物在284 nm具有共同的紫外特征吸收峰,其褐變程度與分子量相關(guān),分子量越大,褐變程度越高,其中0.45～0.22 μm截留產(chǎn)物的褐變程度最大;各級(jí)截留產(chǎn)物均具有抗氧化活性,且呈現(xiàn)濃度依賴性;綜合各因素可見,截留產(chǎn)物分子大小為0.45～0.22 μm時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率及對(duì)鐵氰化鉀的還原能力最強(qiáng),提示山茱萸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中抗氧化的最佳活性部位為超大分子類物質(zhì),為山茱萸的抗氧化活性提供了物質(zhì)基礎(chǔ)的科學(xué)依據(jù)。

中藥材大多含有還原糖、醛基化合物和氨基酸,美拉德反應(yīng)可以清楚地闡明這些中藥的炮制和制劑的機(jī)制,深入研究美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用必將完善此類中藥炮制和制劑的理論和實(shí)踐。

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Ultrafiltration separation of Maillard reaction products ofFructuscorniand their antioxidant activity

YANG Guang-ming1,LI Meng2,ZHANG Yu-ling2,LI Wei-dong1,PAN Yang2,*,CAI Bao-chang1,*

(1.Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Standardization of Chinese Medicine Processing & Jiangsu Key Laboratory of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China; 2.Laboratory of Medical Fungi and Phyto-Biotech,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China)

Objective:To separate the best active fraction of Maillard reaction products(MRPs)ofFructuscorniby ultrafiltration and compare the properties and antioxidant activities of different molecular weight cutoffs ofFructuscorniMRPs. Methods:Fructuscorniwas adopted as substrate for Maillard reaction and MRPs were obtained after reactions at high temperature. The MRPs were ultrafiltered by hollow fiber membrane of 0.45 μm,0.22 μm,100 ku,50 ku,10 ku,4 ku,and then lyophilized to get different molecular weight cutoffs ofFructuscorniMRPs. Physical and chemical properties of different molecular weight cutoffs were determined,and the radical scavenging ability on DPPH radical and the reducing ability of potassium ferricyanide were also observed. Results:The UV absorption curves of different molecular weight cutoffs were similar and the maximum absorption was all at 284 nm. Among different molecular weight cutoffs ofFructuscorniMRPs,cutoffs of 0.45～0.22 μm had the highest browning degree and strongest scavenging ability on DPPH radical and reducing ability of potassium ferricyanide. Conclusion:It suggests that the best antioxidant active fraction ofFructuscorniMRPs are super-macromolecules with size of 0.45～0.22 μm.

Fructuscorni;Maillard reaction product(MRPs);ultrafiltration;melanoidins;antioxidant activity

2015-10-08

楊光明(1974-)，女，博士，副研究員，主要從事中藥炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究，E-mail:ygmm0901@hotmail.com。

潘揚(yáng)(1964-)，男，博士，研究員，研究方向：中藥化學(xué)與生物技術(shù)，E-mail:y.pan2006@163.com；

蔡寶昌(1952-)，男，博士，教授，研究方向：中藥炮制及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，E-mail:bccai@126.com。

江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(12KJA360001);江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD);江蘇高校品牌專業(yè)建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PPZY2015A070)。

TS284.1

A

1002-0306(2016)10-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.10.021