貫葉連翹提取物對免疫性肝損傷小鼠腸道屏障功能損傷保護作用

李芳群，樊紫青，方海明，王佳佳，程啟閏，章禮久

貫葉連翹提取物對免疫性肝損傷小鼠腸道屏障功能損傷保護作用

李芳群1，樊紫青1，方海明1，王佳佳2，程啟閏1，章禮久1

目的 研究急性免疫性肝損傷對腸道屏障功能影響及貫葉連翹提取物（HPE）的作用。方法 60只ICR小鼠隨機分為正常組、模型組、HPE低劑量組（25 mg/kg）、HPE中劑量組（50 mg/kg）、HPE高劑量組（100 mg/kg）和地塞米松組（2.5 mg/kg）。HPE組小鼠灌胃給予不同劑量HPE，連續(xù)10 d后除正常組外小鼠禁食不禁飲，12 h后采用尾靜脈注射刀豆蛋白A（Con A）20 mg/kg，8～12 h后處死小鼠，取小腸組織，ELISA法測定腸勻漿二胺氧化酶（DAO）含量，免疫組化法測定腸組織閉鎖蛋白（Occludin）、緊密連接相關蛋白-1（ZO-1）蛋白表達情況。結果 與正常組比較，模型組小鼠腸勻漿DAO水平明顯降低，Occludin、ZO-1蛋白表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，HPE各劑量組DAO水平顯著升高，Occludin、ZO-1蛋白表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。HPE高劑量組與HPE低劑量組比較，DAO、Occludin、ZO-1差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論 急性免疫性肝損傷時存在腸道屏障功能損傷，HPE對損傷的腸道屏障功能有保護作用，機制可能與增強Occludin、ZO-1蛋白表達有關。

貫葉連翹提取物；急性免疫性肝損傷；腸道屏障；DAO；ZO-1；Occludin

網(wǎng)絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.026.html

1998年“肝-腸軸”學說提出以來，腸道功能屏障損傷在肝臟病變及相關并發(fā)癥的發(fā)病機制研究中價值更加受到研究者重視［1］。研究［2-3］證實，腸道菌群與肝細胞再生過程中基因表達調控有關，肝硬化等慢性肝臟病變存在腸道屏障功能障礙，腸道菌群失調、易位在肝硬化及并發(fā)癥發(fā)生機制中起到重要作用。急性肝臟損傷臨床多見，但是否同時合并腸道屏障損傷，國內外相關研究較少。貫葉連翹（Hypericum perforatum L.，HPL）為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，HPL提取物（Hypericum perforatum extract，HPE）在美歐等國用于治療抑郁癥已有上百年歷史，有抗抑郁、抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理學作用［4-9］。研究［10］表明HPE對小鼠急性免疫性肝損傷有保護作用，機制可能與抗氧化應激有關。該研究旨在初步探討刀豆蛋白A（Con A）建立急性免疫性肝損傷模型中是否合并存在腸道屏障功能障礙，進一步探討HPE對急性免疫性肝損傷腸道屏障障礙是否存在作用及可能機制，為后續(xù)研究提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1實驗動物 雄性ICR小鼠，SPF級，18～22 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.2藥物與試劑 HPE購自天津馬克生物技術公司（批號：20130225）；地塞米松購自金陵藥業(yè)股份有限公司（批號：20130422）；ConA、二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）購自美國Sigma公司；緊密連接相關蛋白-1（zonula occludens-associated protein-1，ZO-1）、閉鎖蛋白（Occludin）抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3儀器 電熱恒溫水浴箱（北京醫(yī)療設備廠意成公司）；SPectraMax 190全波長酶標儀（美國MD公司）；1.0型高速低溫離心機、分光光度儀（上海精密科學儀器有限公司）；TGL-16H高速離心機（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）；Nikon ECLIPSE 80i光學顯微鏡（尼康映像儀器銷售中國有限公司）；RXL全自動生化儀（西門子有限公司）。

1.4造模及給藥 實驗設：正常組、模型組、HPE各劑量組（25、50、100 mg/kg）和地塞米松組（陽性對照）（2.5 mg/kg），共6組，每組10只。HPE高劑量組、HPE中劑量組、HPE低劑量組及地塞米松組經(jīng)灌胃給予相應劑量藥物，正常組和模型組分別給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d。末次給藥后除正常組，各組均經(jīng)尾靜脈注射20 mg/kg Con A，正常組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.5樣本制備和檢測

1.5.1小腸組織中DAO含量測定 取小鼠小腸組織稱重，洗凈后4℃預冷生理鹽水于勻漿器制備勻漿，按照ELISA試劑盒操作步驟測定DAO含量。

1.5.2腸道組織HE觀察 按照常規(guī)方法制備石蠟切片后HE染色觀察腸組織病理學改變。

1.5.3腸道組織中Occludin、ZO-1蛋白表達測定

采取免疫組化法檢測，取腸組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化、微波法抗原修復，按照操作步驟分別測定腸組織Occludin、ZO-1蛋白表達情況，再采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件對各免疫組化圖片進行平均光密度檢測和分析。以參數(shù)平均光密度代表ZO-1、Occludin蛋白的顆粒密度。

1.6統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以ˉx±s表示。組間比較采用方差分析。

2　結果

2.1小鼠一般情況 正常組小鼠反應靈敏、性情活潑、腸管顏色鮮艷、有光澤。模型組小鼠反應遲鈍、精神萎靡，腸管暗紫色。

2.2HPE對急性免疫性肝損傷小鼠腸道組織中DAO活性的影響 各組方差分析差異有統(tǒng)計學意義（FDAO=1.84，P＜0.01）。地塞米松組、HPE各劑量組腸勻漿中DAO含量較模型組明顯增加（P＜0.01），HPE各劑量組間DAO含量差異有統(tǒng)計學意義，HPE高劑量組腸勻漿中DAO含量較HPE低劑量組明顯增加（P＜0.01），見圖1。

圖1　HPE對急性免疫性肝損傷小鼠腸道組織中　DAO活性的影響1：正常組；2：模型組；3：HPE低劑量組；4：HPE中劑量組；5：HPE高劑量組；6：地塞米松組；與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01；與HPE低劑量組比較：△△P＜0.01

2.3HPE對急性免疫性肝損傷小鼠腸道病理組織學變化的影響 正常組小鼠的腸絨毛結構完整、排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤。模型組可見腸黏膜充血、水腫，絨毛結構紊亂，部分出現(xiàn)斷裂、壞死脫落及炎性細胞浸潤。HPE給藥組組織充血、水腫明顯改善，腸絨毛脫落、倒伏情況好轉，部分完整。見圖2。

圖2　腸道組織變化 HE×200A：正常組；B：模型組；C：地塞米松組；D：HPE低劑量組；E：HPE中劑量組；F：HPE高劑量組

2.4 HPE對急性免疫性肝損傷小鼠腸道組織中Occludin、ZO-1表達的影響 光鏡下可見Occludin、ZO-1蛋白陽性顆粒定位于腸道細胞間，呈棕黃色。各組間方差分析差異有統(tǒng)計學意義（FOccludin= 2.437，F(xiàn)ZO-1=6.637），模型組小鼠腸道Occludin、ZO-1表達顯著減弱，平均光密度顯著低于正常組（P＜0.01）。HPE各劑量組Occludin、ZO-1表達顯著增強，平均光密度顯著高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），HPE各劑量組間隨HPE濃度增加，Occludin、ZO-1表達增強（P＜0.01）。見圖3～4、表1。

圖3　HPE對急性免疫性肝損傷小鼠小腸Occludin表達的影響 SP×200A：正常組；B：地塞米松組；C：模型組；D：HPE高劑量組；E：HPE中劑量組；F：HPE低劑量組

圖4　HPE對急性免疫性肝損傷小鼠　ZO-1表達的影響 SP×200A：正常組；B：地塞米松組；C：模型組；D：HPE高劑量組；E：HPE中劑量組；F：HPE低劑量組

表1　小鼠腸道組織　Occludin、ZO-1表達情況

表1　小鼠腸道組織　Occludin、ZO-1表達情況

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01；與HPE低劑量組比較：△△P＜0.01；與HPE中劑量比較：▽▽P＜0.01

組別　Occludin平均光密度　ZO-1平均光密度正常0.339 1±0.032 3　0.864 8±0.590 9模型　0.225 1±0.015 2**　0.306 6±0.251 0**地塞米松　0.282 4±0.031 7##　0.764 2±0.401 6##HPE低劑量　0.230 3±0.030 3##　0.447 8±0.314 7##HPE中劑量　0.259 2±0.042 9△△　0.572 9±0.372 0△△HPE高劑量　0.271 3±0.024 5▽▽　0.665 6±0.337 9▽▽

3　討論

腸道屏障包括機械屏障、化學屏障、免疫屏障和生物屏障等，機械屏障與腸黏膜通透性關系最密切。腸道黏膜上皮屏障功能的解剖基礎源于腸上皮細胞間的緊密連接（tight junctions，TJs），TJs由多種緊密連接蛋白組合構成，如ZO-1、Occludin和Claudin家族等，對維持上皮細胞極性及調節(jié)腸道通透性起重要作用。這些緊密連接蛋白的表達異?；蛴捎诩毎羌芙Y構改變引起的緊密連接蛋白分布異常皆可導致TJs破壞［11］。腸上皮細胞TJs中，Occludin通過胞膜外部分與相鄰細胞發(fā)生結合而產生細胞旁封閉，ZO-1則在連接Occludin中起橋梁作用，ZO-1僅起著TJ形成的裝配平臺作用，同時又是Occludin與細胞內骨架系統(tǒng)連接及信號傳導機制中的一個重要結構，在維持腸黏膜上皮屏障功能的完整性方面具有重要作用［12-13］。DAO活性與絨毛高度和黏膜細胞的核酸和蛋白合成密切相關，腸黏膜上皮細胞受損或壞死后，引起血液和腸腔內DAO活性升高，腸黏膜DAO活性降低，DAO是反映小腸黏膜結構功能的較為理想的指標［14-15］。本研究結果表明急性免疫性肝損傷小鼠腸組織勻漿中DAO含量較正常組明顯降低，提示急性肝損傷存在腸道通透性增加，存在腸道屏障功能受損。進一步測定腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達情況顯示，模型組Occludin和ZO-1蛋白表達情況較正常組明顯降低，提示急性免疫性肝損傷引起屏障功能障礙可能與改變Occludin在細胞中的位置分布，減少ZO-1的表達有關。腸道通透性增加可能與Occludin和ZO-1蛋白表達減少有關。

作為藤黃科金絲桃屬多年生草本植物，HPE有抗氧化、抗炎等廣泛藥理作用，研究［10］表明，HPE對急性免疫性肝損傷有保護作用。本研究進一步研究顯示，通過預先灌胃給予HPE，能夠升高腸勻漿DAO含量，呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，進一步免疫組化表明，HPE能夠增加腸組織Occludin和ZO-1蛋白表達水平，隨著HPE濃度增加呈現(xiàn)升高趨勢，提示HPE對急性免疫性肝損傷引起的腸道屏障功能有保護作用，其機制可能與增加Occludin和ZO-1蛋白表達有關。

綜上所述，急性肝損傷存在腸道屏障功能障礙，HPE對急性肝損傷引起的腸道屏障功能障礙具有保護作用，其機制可能與增加Occludin和ZO-1蛋白表達有關。

［1］ Marshall J C.The gut as a potential trigger exercise-inducedinflammatory responses［J］.Can J Physiol Pharmacol，1998，76（5）：479-84.

［2］ Liu H X，Rocha C S，Dandekar S，etal.Functionalanalysis of the relationship between intestinalmicrobiota and the expression of hepatic genes and pathways during the course of liver regeneration［J］.JHepatol，2015：［Epub ahead of print］.

［3］ Fukui H.Gut-liver axis in liver cirrhosis：How to manage leaky gutand endotoxemia［J］.World JHepatol，2015，7（3）：425-42.

［4］ Wurglics M，Schubert-Zsilavecz M.Hypericumperforatum：a‘modern'herbal antidepressant：pharmacokinetics of active ingredients［J］.Clin Pharmacokinet，2006，45（5）：449-68.

［5］ Karioti A，Bilia A R.Hypericins as potential leads for new therapeutics［J］.Int JMol Sci，2010，11（2）：562-94.

［6］ Merhi F，Tang R，Piedfer M，et al.Hyperforin inhibits Akt1 kinase activity and promotes caspase-mediated apoptosis involving Bad and Noxa activation in human myeloid tumor cells［J］.PLoS One，2011，6（10）：e25963.

［7］ 蒲秀瑛，梁劍平，王學紅，等.貫葉連翹提取物抗甲1型流感病毒活性的研究［J］.中草藥，2010，41（2）：259-64.

［8］ 朱麗麗，章禮久，方海明.金絲桃素光動力學治療膽管癌的研究進展［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2012，47（7）：856-8.

［9］ 胡小艷，尚若峰，劉宇，等.金絲桃素對免疫抑制小鼠免疫功能和抗氧化能力的影響［J］.西北農業(yè)學報，2012，21（3）：38-41.

［10］程啟閏，方海明，李芳群，等.貫葉連翹提取物對小鼠急性免疫性肝損傷的保護作用［J］.安徽醫(yī)科大學學報，2015，50（4）：477-81.

［11］Edelblum K L，Turner JR.The tight junction in inflammatory disease：communication break down［J］.Curr Opin Pharmacol，2009，9（6）：715-20.

［12］Mankertz J，Schulzke J D.Altered permeability in inflammatory bowel disease：pathophysiology and clinical implications［J］.Curr Opin Gastroenterol，2007，23（4）：379-83.

［13］Yu A S，McCarthy K M，F(xiàn)rancis SA，et al.Knockdown of occludin expression leads to diverse phenotypic alterations in epithelial cells［J］.Am JPhysiol Cell Physiol，2005，288（6）：C1231-41.

［14］Sun T，Gao G Z，Li R F，et al.Bonemarrow-derived mesenchymal stem cell transplantation ameliorates oxidative stress and restores intestinalmucosal permeability in chemically induced colitis in mice［J］.Am JTransl Res，2015，7（5）：891-901.

［15］Li H，Qiu P，Wang J，et al.Effects of compound Ginkgo biloba on intestinal permeability in rats with alcohol-induced liver injury［J］.Food Funct，2015，6（2）：470-8.

◇臨床醫(yī)學研究◇

The protective effect of Hypericum perforatum extract on intestinal barrier injury in acute immunological liver injury m ice

Li Fangqun，F(xiàn)an Ziqing，F(xiàn)ang Haiming，et al
（Dept of Gastroenterology，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the protective effect of Hypericum perforatum extract（HPE）on intestinal barrier function in concanavalin A（Con A）induced acute immunological liver injurymice.Methods Sixty ICRmice were randomly divided into six groups：normal group，model group，HPE（25，50，100 mg/kg）groups and dexamethasone group（2.5 mg/kg）.Different doses of HPE（25，50，100 mg/kg）were given tomice in HPE groups by gavage for 10 days.On day 10 Con A（20 mg/kg）was injected tomice by tail intravenous.After 8 to 12 h，mice were sacrificed.Diamine oxidase（DAO）levels in intestinal tissueswere tested by ELISA assays.Expressions levels of Occludin，Zonula occludens-associated protein-1（ZO-1）were analyzed by immunohistochemicalmethod.Results Compared with the normal group，DAO levels and expressions levels of Occludin，ZO-1 were significantly decreased in themodel group（P＜0.01）.Compared with the model group，DAO levels and expressions levels of Occludin，ZO-1 were significantly increased in HPE group（P＜0.01）.Compared with low dose group，DAO levels and expressions levels of Occludin，ZO-1 were significantly increased（P＜0.01）.Conclusion Intestinal barrier function is damaged in acute immunological liver injurymice.HPE has obviously protective effects on the damaged intestinal barrier function，which may be associated with increasing expression of Occludin and ZO-1.

Hypericum perforatum extract；acute immunological liver injury；intestinal barrier；DAO；Occludin；ZO-1

R 575.1

A

1000-1492（2016）05-0669-04

2016-02-22接收

安徽省自然科學基金（編號：1408085MH178）

1安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院消化內科，合肥 230601

2安徽醫(yī)科大學藥理學教研室，合肥 230032

李芳群，女，碩士研究生；

方海明，男，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：haimingfang@163.com；

王佳佳，女，博士，副教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：ljedu@163.com