橙皮苷衍生物Y-12抑制CYP2E1對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

曹雪艷，李　俊，黃　成，潘蘇巖，孟祥波，張樂天

橙皮苷衍生物Y-12抑制CYP2E1對CCl4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

曹雪艷1，2，3，李俊1，2，3，黃成1，2，3，潘蘇巖1，2，3，孟祥波1，2，3，張樂天1，2，3

目的 探討橙皮苷（HDN）衍生物Y-12（HY-12）抑制CYP2E1對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法 將70只昆明小鼠隨機均分為正常組、模型組、HY-12高、中、低劑量組和陽性對照藥（甘草酸二銨組和HDN組）。將小鼠分別以0.5%羧甲基纖維素鈉和相應(yīng)的藥物連續(xù)灌胃7 d，第7天給藥結(jié)束后除正常組外，分別向小鼠腹腔注射0.2%CCl4（0.1 ml/10 g）誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型，觀察HY-12對小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）水平的影響以及對肝勻漿中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）水平的影響；肝組織HE染色；免疫組化SP法觀察肝組織中CYP2E1的表達(dá)；Western blot法檢測小鼠肝臟CYP2E1的蛋白表達(dá)水平；qRT-PCR法檢測小鼠肝臟CYP2E1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 HY-12各劑量組可降低急性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活性，降低肝勻漿MDA的水平，升高SOD、GSH-Px的水平，抑制了肝細(xì)胞中的CYP2E1的表達(dá)，明顯減輕了小鼠肝組織病變程度。結(jié)論 HY-12對小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，其機制與抗機體脂質(zhì)過氧化、抑制CYP2E1表達(dá)有關(guān)。

5′-硝基乙?；绕ぼ眨患毙愿螕p傷；四氯化碳；CYP2E1

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.024.html

橙皮苷（hesperidin，HDN）屬二氫黃酮衍生物，由橙皮素與蕓香糖合成的糖苷，多存在于柑桔屬植物中。HDN在抗氧化、抗炎癥和疼痛［1］、抑制腫瘤生長［2］和免疫調(diào)節(jié)等方面起著重要作用。對DGalN、刀豆蛋白A誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用［3-4］。但是，HDN因水溶性和生物利用度低的缺點限制其在醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。為此，課題組前期通過化學(xué)修飾的方法改變HDN的水溶性和生物利用度［5-7］，為HDN的應(yīng)用打開瓶頸。本課題組前期嘗試各種基因修飾方式來提高由陳皮純化出的HDN的水溶性和生物利用度，得到了系列HDN衍生物，將其作用于 RAW164.7細(xì)胞后，篩選出現(xiàn)具有較強抗炎活性的HDN衍生物Y-12（HY-12）［8］。由于CYP2E1的過度活化可以誘導(dǎo)脂質(zhì)氧化物的堆積，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟的損傷。該實驗擬通過研究HY-12對急性肝損傷模型小鼠的保護(hù)作用，初步探討其機制可能與抑制CYP2E1過度表達(dá)有關(guān)。

1　材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠70只，20～24 g，均由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2藥物與試劑 HY-12與HDN均由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院石靜波合成，經(jīng)測定，其含量均＞99%，臨用前需用0.5%羧甲基纖維素鈉將其配成混懸液。甘草酸二銨注射液（10 ml∶50 mg）購于江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；CCl4購于汕頭西隴化工廠，臨用前用魯花花生油1∶1稀釋；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，編號：p0012s；CYP2E1抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Actin、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒、PCR試劑盒購于美國 Thermo公司；PCR引物、TRIzol購于美國Invitrogen公司；DL2000 DNA Marker購于日本TaKaRa公司；QuantiFast SyBr Green PCR kit購于德國QIAGEN公司。

1.3方法

1.3.1急性肝損傷小鼠模型的建立、分組及給藥昆明雄性小鼠70只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組、模型組、HY-12高劑量組（400 mg/kg）、HY-12中劑量組（200 mg/kg）、HY-12低劑量組（100 mg/kg）和陽性對照［甘草酸二銨組（45 mg/kg）和HDN組（120 mg/kg）］，灌胃，每日1次，每組10只。正常組和模型組小鼠以等體積的羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，HY-12高、中、低劑量組、甘草酸二銨組和HDN組小鼠均以相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)7 d。第7天給藥1 h之后，除正常組小鼠外，其余小鼠一次性腹腔注射0.2%CCl4，0.1 ml/10 g，致急性肝損傷模型。禁食不禁水16 h內(nèi)，小鼠眼球取血，處死小鼠，剖取肝臟。

1.3.2病理檢測 取大鼠右葉相同位置肝組織，用4℃生理鹽水沖盡殘血，濾紙拭干，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織切片的病理形態(tài)學(xué)變化，肝組織損傷程度分為4級，0級：無壞死；1級：0＜壞死區(qū)域＜2.5%；2級：2.5%＜壞死區(qū)域＜5%；3級：壞死區(qū)域＞5%。

1.3.3肝指數(shù) 小鼠眼球取血后處死各組小鼠，迅速解剖肝臟，冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重，計算肝指數(shù)。肝指數(shù)（%）=肝質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）× 100%。

1.3.4生化指標(biāo)檢測 小鼠眼球取血得到血樣4℃、3 500 r/min離心15 min，取血清，按試劑盒說明測定ALT、AST水平。準(zhǔn)確稱取0.2 g不同組肝臟的相同部位后，用1.8 ml冷生理鹽水制備成10%肝勻漿，3 500 r/min離心15 min，取上清液。按試劑盒說明測定MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.3.5免疫組織化學(xué)染色觀察CYP2E1蛋白表達(dá)的影響 小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。按照二步法免疫組化步驟進(jìn)行檢測。

1.3.6Western blot檢測CYP2E1蛋白表達(dá)水平的變化 剪取肝組織100 mg，加入RIPA細(xì)胞裂解液1 ml進(jìn)行裂解，裂解的蛋白于105℃水浴10 min后，上樣于10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濃縮膠（80 V、30 min），分離膠（120 V、60 min）后，經(jīng)200 mA、120 min將蛋白從膠上轉(zhuǎn)膜到孔徑0.2μmol/L的PVDF膜上。取出PVDF膜，TBST洗2次，每次5 min后，加入5%脫脂奶粉室溫封閉3 h。取出PVDF膜，TBST洗3次，每次10 min。加入一抗（CYP2E1兔抗血清，1∶300；β-actin鼠抗血清為內(nèi)參照，1∶1 000）4℃緩慢搖動孵育過夜，移去一抗，TBST洗3次，每次10 min。加入二抗辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔和抗鼠 IgG（1∶10 000）在室溫下封閉12 h，移去二抗，TBST浸洗3次，每次10 min。按美國Thermo公司手冊使用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。

1.3.7qRT-PCR測定肝組織CYP2E1 mRNA的表達(dá) 參照TRIzol說明書，提取肝組織總的RNA，用分光光度計測定RNA樣本的濃度和純度。采用兩步法逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Two-step RT-PCR）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。CYP2E1上游引物5′-AGGCTGTCAAGGAGGTGCTA-3′，下游引物5′-ATGTGGGCCCATTATTGAAA-3′，PCR產(chǎn)物片段114 bp；β-action上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，PCR產(chǎn)物片段150 bp。取出cDNA制作熒光定量的模板，引物反應(yīng)條件：（CYP2E1、β-action）預(yù)變性95℃5 min，95℃10 s，6℃ 30 s，40個循環(huán)。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，用PikoReal Software軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗。

2　結(jié)果

2.1HY-12對小鼠CCl4急性肝損傷肝臟病理的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，無炎癥和壞死。模型組小鼠肝內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、彌漫性點狀壞死、匯管區(qū)炎癥明顯、肝小葉結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞。HY-12（100、200、400 mg/kg）組、HDN組、甘草酸二銨組均可減輕組織病變范圍與程度，使炎細(xì)胞浸潤減少。見圖1。

2.2免疫組織化學(xué)染色觀察CYP2E1蛋白表達(dá)的影響 疫組化染色結(jié)果顯示，相比正常組小鼠肝組織，模型組小鼠肝組織中CYP2E1的蛋白表達(dá)水平顯著增強。細(xì)胞胞質(zhì)、細(xì)胞核中出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒；與模型組相比，各用藥組CYP2E1表達(dá)均減弱，其中，甘草酸二銨組與HY-12高劑量組表現(xiàn)相似，且HY-12的高、中、低劑量組呈CYP2E1表達(dá)逐漸減弱趨勢。見圖2。

2.3各組肝指數(shù)及血清ALT、AST水平比較 與正常組比較，模型組的肝指數(shù)顯著下降（P＜0.01），且血清中AST及ALT均明顯增高；甘草酸二銨組、HDN組和HY-12低、中、高劑量組較模型組小鼠血清中的ALT、AST水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。7組的肝指數(shù)、ALT、AST方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.390、562.684、288.698，P＜0.01）。見表1。

表1　各組肝指數(shù)及血清　ALT、AST水平比較

表1　各組肝指數(shù)及血清　ALT、AST水平比較

與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量（mg/kg）肝指數(shù)（%）　ALT（U/L）　AST（U/L）6.32±0.35　32.51±4.31　56.78±2.86模型　-　5.32±0.44##　90.28±1.61##　122.59±6.68##HY-12　100　5.89±0.86　78.72±1.70*　110.01±3.88*200　5.33±0.43　68.75±3.46**　93.72±4.50**400　5.56±0.33　59.70±2.56**　74.40±1.89**HDN　120　5.34±0.43　69.20±2.03**　94.87±5.17**甘草酸二銨　45　5.33±0.31　58.34±1.50**　73.24±2.57正常-**

圖1　HY-12對急性肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)改變的影響 HE×200A：正常組；B：模型組；C：甘草酸二銨組；D：HDN組；E：HY-12（400 mg/kg）；F：HY-12（200 mg/ kg）；G：HY-12（100 mg/kg）

2.4HY-12對CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷大鼠肝勻漿SOD、MDA、GSH-Px的影響 脂質(zhì)過氧化是急、慢性肝損傷發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)。肝臟組織中SOD、MDA和GSH-Px的水平能夠準(zhǔn)確反映組織內(nèi)部脂質(zhì)過氧化的程度。由表2可見，7組肝組織中的SOD、MDA、GSH-Px方差分析比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F =95.390、636.342、136.870，P＜0.01）。與正常組比較，模型組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px顯著下降（P＜0.01），MDA的含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，HY-12治療組小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px的水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），而MDA的水平則明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），呈明顯的劑量依賴關(guān)系。說明HY-12對于化學(xué)性脂質(zhì)過氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用。見表2。

圖2　免疫組織化學(xué)染色觀察CYP2E1蛋白表達(dá)的影響HE×400A：正常組；B：模型組；C：甘草酸二銨組；D：HDN組；E：HY-12（400 mg/kg）；F：HY-12（200 mg/ kg）；G：HY-12（100 mg/kg）

2.5W estern blot檢測CYP2E1蛋白表達(dá)水平的變化 模型組與正常組相比CYP2E1蛋白表達(dá)量明顯增強（P＜0.01）。各用藥組（甘草酸二銨組、HDN組、HY-12不同劑量組）與模型組相比均可降低CYP2E1蛋白的表達(dá)（P＜0.01），且HY-12低、中、高劑量組的CYP2E1表達(dá)呈逐漸遞減趨勢。見圖3。

2.6qRT-PCR測定肝組織CYP2E1 m RNA的表達(dá)變化 qRT-PCR法檢測肝組織CYP2E1的 mRNA表達(dá)變化，模型組肝組織CYP2E1 mRNA表達(dá)顯著升高，與正常組相比有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；HY-12高、中、低劑量組及對照組CYP2E1 mRNA均下降，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖4。

表2　HY-12對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響

表2　HY-12對急性肝損傷小鼠肝勻漿MDA、SOD、GSH-Px的影響　

與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

組別劑量（mg/kg）　SOD（U/mg prot）　MDA（nmol/mg prot）　GSH-px（U/mg prot）151.59±2.23　2.45±0.07　191.75±7.04模型　-　91.98±1.54##　4.69±0.03##　70.30±4.37##HY-12　100　105.08±3.61*　3.79±0.04*　97.28±2.98*200　118.80±3.55**　3.30±0.05**　126.46±3.38**400　129.80±1.51**　3.05±0.03**　158.29±2.39**HDN　120　122.01±3.48**　3.38±0.03**　120.65±4.03**甘草酸二銨　45　128.99±4.08**　3.13±0.04**　137.25±6.81正常-**

圖3　Western blot檢測　HY-12對急性肝損傷大鼠肝組織中　CYP2E1蛋白表達(dá)的影響1：正常組；2：模型組；3：HDN組；4：甘草酸二銨組；5：HY-12（400 mg/kg）；6：HY-12（200 mg/kg）；7：HY-12（100 mg/kg）；與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

圖4　HY-12對急性肝損傷大鼠肝組織中CYP2E1 mRNA表達(dá)的影響1：正常組；2：模型組；3：HY-12（400 mg/kg）；4：HY-12（200 mg/ kg）；5：HY-12（100 mg/kg）；6：甘草酸二銨組；7：HDN組；與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

3　討論

CCl4是經(jīng)典的誘發(fā)急性肝損傷的一種選擇性肝毒性藥物，CCl4能夠引發(fā)肝微粒體CYP450酶系激活，自由基釋放增加，使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化后通透性增加并向血液中大量釋入轉(zhuǎn)氨酶。系最為常用的急性肝炎模型，成功率高，實驗方法簡便、重復(fù)性好［9］。本實驗顯示與正常組相比，CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型中ALT、AST的含量明顯上升。病理檢測顯示，模型組小鼠肝內(nèi)細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性、彌漫性點狀壞匯管區(qū)炎癥明顯等，表明本實驗成功復(fù)制了小鼠急性肝損傷模型。本實驗結(jié)果提示，CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型建立成功。應(yīng)用HY-12灌胃給藥，結(jié)果顯示，HY-12不同劑量組均能降低小鼠血清ALT、AST水平，中、高劑量組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。肝組織病理學(xué)檢測結(jié)果提示給藥組小鼠肝臟組織的損傷程度有所改善，炎性細(xì)胞在組織浸潤明顯減少。

CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷，主要引起細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而引起肝細(xì)胞損傷壞死。MDA是一種脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的次產(chǎn)物，可使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹甚至壞死。SOD是一種對抗氧化應(yīng)激，保護(hù)機體免受活性氧的損傷。通常來講，SOD通過其歧化作用，將一個分子的氧自由基轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2，而將另外一個氧自由基轉(zhuǎn)換成O2，因此SOD的活性強弱，在一定程度上說明了機體對抗氧化應(yīng)激的能力。同SOD生理作用相似，GSH主要由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸結(jié)合而成，在機體內(nèi)能夠與重金屬或氧自由基相互結(jié)合，從而起到抵抗氧化應(yīng)激造成的損傷［9］。本研究顯示CCl4能夠誘導(dǎo)的肝損傷組織MDA明顯升高，SOD、GSH-Px含量明顯降低，表示脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，抗氧化酶降低，參與了急性肝損傷的發(fā)生。給予HY-12可明顯增加SOD、GSH-Px，降低了MDA的產(chǎn)生，提示HY-12對肝臟的保護(hù)作用可能與其抗自由基反應(yīng)和抑制脂質(zhì)過氧化的能力有關(guān)。

CYP2E1是肝微粒體 CYP450酶系的主要成分之一，主要在肝臟中表達(dá)，故被稱為肝臟重要的代謝酶，早期研究［10］表明CYP2E1過度活化可誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化物的大量產(chǎn)生和蓄積，也可誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡。在肝臟方面，一方面CCl4雖然顯著降低肝組織CYP450酶的含量，但卻不僅提高 CYP2E1和 CYP3A1 mRNA的水平，還提高CYP2E1的活性，提示CYP2E1功能異常是CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷的病理機制之一［11］。另一方面，研究［12-13］顯示CCl4誘導(dǎo)的肝損傷模型CYP2E1的含量水平和活性大小與CCl4的劑量呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，此外血清AST的活性大小也與CYP2E1活性存在明顯的相關(guān)性?，F(xiàn)在普遍認(rèn)為CYP2E1功能亢進(jìn)會造成肝臟損傷，氧自由基過度堆積，損傷生物膜功能，協(xié)同細(xì)胞因子和肝細(xì)胞凋亡等誘發(fā)和加重肝細(xì)胞的炎癥、壞死、參與纖維化甚至癌變的過程［14］。本實驗研究結(jié)果表明CCl4能顯著誘導(dǎo)肝組織CYP2E1的蛋白表達(dá)水平和mRNA表達(dá)水平的上調(diào)。而HY-12治療給藥能顯著降低CYP2E1的表達(dá)水平，提示HY-12對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型的保護(hù)作用與其降低CYP2E1的過度活化有關(guān)。

綜上所述，HY-12可以減輕CCl4所致肝損傷程度，有抗脂質(zhì)過氧化的作用，能夠抑制CYP2E1的過度表達(dá)。

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Protective research of HY-12 inhibiting CYP2E1 on acute liver injury in m ice induced by carbon tetrachloride

Cao Xueyan1，2，3，Li Jun1，2，3，Huang Cheng1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，Anhui Medical University，2Anhui Provincial Laboratory on Bioactivity of Natural Products，3Anhui Provincial Engineering Research Center on Active Components of Natural Products，Hefei 230032）

Objective To study the protective effects of the inhibiting of HY-12 to CYP2E1 on CCl4induced acute liver injury in mice.Methods All 70 kunmingmice were randomly divided into control group，model group，HY-12 high，medium and low dose group and positive controldrug（glycyrrhizic acid group and hesperidin group）.Mice were given 0.5%sodium carboxymethycellulose and the corresponding drug for 7 days.At the end of the seventhday，themicewere injected with 0.2%CCl4（0.1ml/10 g）to inducemousemodel of acute liver injury except thenormal group.To observe the level of liver homogenate about serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），and the influence of themalondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-px）level；liver tissue has been stained by HE.The expression of CYP2E1 in liver tissue wasmeasured by immunohistochemistry and Western blot.The expression level of CYP2E1 mRNA in themice liver was detected by qRT-PCR.Results HY-12 could decrease ALT，AST activity inmice serum of the acute liver injury，reducethe level of MDA in liver homogenate，increase SOD and GSH-px levels，inhibit the CYP2E1 level in liver cells，and significantly reduce the degree of liver tissue lesions inmice.Conclusion HY-12 has certain protective effect on acute liver injury in mice and itsmechanism may be related to the body lipid peroxidated and inhibited CYP2E1 expression.

HY-12；acute liver injury；carbon tetrachloride；lipid peroxidation

R 966；R 282.71

A

1000-1492（2016）05-0664-06

2016-02-22接收

安徽省自然科學(xué)基金（編號：1408085MKL31）；國家自然科學(xué)基金（編號：81473268）

1安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2安徽省天然藥物活性研究重點實驗室，3安徽省天然藥物活性成分工程技術(shù)研究中心，合肥 230032

曹雪艷，女，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lijun@ ahmu.edu.cn