Kv1.3在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中表達(dá)變化

周　群，吳寶明，孟曉明，黃　成，李　俊

Kv1.3在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中表達(dá)變化

周群1，2，3，吳寶明1，2，3，孟曉明1，2，3，黃成1，2，3，李俊1，2，3

目的 探討脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中鉀離子通道蛋白Kv1.3的表達(dá)水平。方法 選取C57BL/6小鼠，建立LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，采用組織病理學(xué)檢查，觀察肝損傷病變，相關(guān)試劑盒檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平，免疫組化、熒光實時定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）及Western blot檢測Kv1.3表達(dá)變化；選取原位灌流的方法分離原代肝臟枯否細(xì)胞（KCs），檢測Kv1.3的表達(dá)變化。體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，使用LPS刺激，進(jìn)一步檢測Kv1.3的表達(dá)變化；使用Kv1.3特異性阻斷劑瑪格毒素（MgTx）預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞，再加LPS刺激，采用 qRT-PCR和 Western blot檢測細(xì)胞因子的表達(dá)變化。結(jié)果 組織病理學(xué)檢查證實急性肝損傷模型建立成功，模型組的ALT和AST含量均高于正常組（P＜0.01），模型組組織和原代肝臟KCs中Kv1.3表達(dá)均低于正常組（P＜0.01），體外實驗LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，Kv1.3表達(dá)降低（P＜0.05）；Kv1.3特異性阻斷劑MgTx減少LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的分泌。結(jié)論

Kv1.3在急性肝損傷模型中的表達(dá)降低，阻斷Kv1.3能減少LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌，Kv1.3可能在治療肝臟疾病過程中發(fā)揮著重要的作用。

離子通道；急性肝損傷；細(xì)胞因子；枯否細(xì)胞；T淋巴細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.018.html

急性肝損傷是多種病因（病毒、化學(xué)藥品、乙醇、免疫反應(yīng)等）引起的急性肝臟損害的一種疾病，也可繼發(fā)于某些全身性疾病，其發(fā)病率較高，目前尚無特效的防治方法。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的免疫性急性肝損傷模型，是目前常用的研究肝臟損傷機(jī)制模型。在免疫性肝損傷中，免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞在機(jī)體的發(fā)病過程中起著重要作用。鉀離子通道蛋白Kv1.3在T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活化過程中發(fā)揮重要作用，參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展。該研究通過建立LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷模型，觀察急性肝損傷模型Kv1.3的表達(dá)變化，體外采用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，檢測 Kv1.3的表達(dá)變化，同時采用特異性阻斷劑阻斷Kv1.3，檢測對LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子分泌的影響，探討Kv1.3通道在免疫性急性肝損傷進(jìn)程中的潛在作用。

1　材料與方法

1.1實驗動物 40只健康雄性C57BL/6小鼠，18～22 g，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院動物房。

1.2細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng)小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自美國ATCC細(xì)胞庫。用DMEM高糖混合培養(yǎng)基（含10%FBS及100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素）于37℃5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞為貼壁生長，當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)到80%時，用0.25%胰酶消化液消化傳代或按濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板，實驗細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

1.3主要藥品與試劑 LPS購自美國Sigma公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alamine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartateaminotransferase，AST）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA裂解液（強(qiáng)）、非變性PAGE蛋白上樣緩沖液（5X）、HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗小鼠IgG、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；ECL發(fā)光試劑盒購自美國Thermo公司；腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、Kv1.3、誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）一抗購自美國Abcam公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、β-actin、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）一抗購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol Reagent RNA提取試劑購自美國Invitrogen公司；β-actin、IL-6、Kv1.3、iNOS、IL-1β、TNF-α引物由Invitrogen（上海）公司合成；FBS購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培養(yǎng)液購自美國HyClone公司；熒光定量染料SYBR Green購自德國QIAGEN公司。

1.4方法

1.4.1動物模型的建立與處理 C57BL/6小鼠40只，隨機(jī)分為正常組（n=20）和急性肝損傷模型組（n=20）。所有小鼠處理前禁食12 h，參照文獻(xiàn)［1-2］，模型組小鼠腹腔注射10 mg/kg的LPS，正常組注射等體積的0.9%NaCl溶液。處理過24 h后，所有小鼠眼球采血，分離血清，測定 ALT、AST活性。取部分肝左葉組織，用10%甲醛溶液固定，剩余肝組織放入液氮速凍，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱進(jìn)行長期保存。

1.4.2KCs提取 參考實驗室提取KCs方法［3］，提取正常組、模型組KCs，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4.3LPS刺激RAW264.7建立炎癥模型 用1 000 ng/ml LPS溶液刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，建立炎癥模型。Kv1.3特異性阻斷劑瑪格毒素（MgTx，10 nmol/L）于LPS處理前2 h加入。

1.5檢測指標(biāo)和方法

1.5.1肝組織形態(tài)學(xué)HE染色 取10%甲醛溶液固定的肝左葉組織，常規(guī)石蠟包埋，切片后脫蠟于蘇木精和伊紅染料中依次染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)學(xué)的變化。

1.5.2ALT、AST活性檢測 小鼠眼球采血，4℃靜置過夜后，2 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，根據(jù)試劑盒說明書，檢測血清血清ALT、AST活性。

1.5.3免疫組化方法檢測Kv1.3蛋白表達(dá) 小鼠肝組織經(jīng)甲醛溶液固定及石蠟包埋后制成2μm厚度的切片，并經(jīng)多聚賴氨酸處理，將石蠟切片常規(guī)脫蠟，滴加3%過氧化氫溶液以抑制內(nèi)源性過氧化物酶，放置于室溫下孵育15 min。沖洗甩干后浸泡于檸檬酸鹽緩沖液中，并使用微波爐高火加熱10～15 min，以修復(fù)表面抗原，PBS沖洗后加入山羊血清封閉，37℃孵育30 min，再滴加山羊抗大鼠Kv1.3多克隆抗體（1∶500），使用PBS作為陰性對照組，后放置于4℃冰箱中過夜，第2天，將切片放入37℃溫箱中孵育30 min復(fù)溫，PBS沖洗甩干后滴加聚合物增強(qiáng)劑，37℃孵育20 min，PBS沖洗后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG多聚體，30℃孵育30 min，PBS沖洗甩干后應(yīng)用DAB顯色。

(2) 深入開展CFRP基礎(chǔ)性研究。軌道車輛對材料的力學(xué)性能、環(huán)保性能、防火性能、抗沖擊性能、耐極端環(huán)境性能、耐老化性能、隔音隔熱性能、減振阻尼性能、電磁兼容性、生命周期環(huán)境友好性以及安全可靠性等都有特殊要求，開展?jié)M足軌道車輛應(yīng)用的材料性能研究，解決目前復(fù)合材料存在的防火、隔聲隔熱、抗沖擊性能局限性，可大大提高復(fù)合材料的應(yīng)用廣度。

1.5.4實時定量RT-PCR 檢測Kv1.3及細(xì)胞因子的表達(dá)應(yīng)用TRIzol試劑盒提取肝組織、原代提取KCs、細(xì)胞株RAW264.7中總RNA，并測定其濃度和純度，并要求吸光度（absorbance，A）值A(chǔ)260/A280為1.8～2.0，并調(diào)整RNA濃度至1 mg/L，采用一步法RT-PCR試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。

表1　基因引物序列

1.5.5Western blot檢測Kv1.3及細(xì)胞因子蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取肝組織、原代KCs和RAW264.7細(xì)胞，裂解充分后，用移液管將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中，4℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液；使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量檢測，各組上清液用裂解液調(diào)至相同蛋白濃度，加入5 ×SDS蛋白上樣緩沖液，100℃沸水煮10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜于PVDF膜上，PVDF膜用含5%脫脂牛奶室溫置于水平搖床封閉3 h。然后依次滴加1：500的鼠抗Kv1.3、兔抗TNF-α、抗IL-6和βactin抗體，4℃孵育過夜后TBST洗滌3次，每次15 min，使用1∶10 000山羊抗鼠/兔二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，Bio-Rad照相系統(tǒng)拍照，并用Image-J軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析，計量資料以ˉx±s表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗，多組均數(shù)比較采用One-Way ANOVA法。

2　結(jié)果

2.1鼠肝組織及血清相關(guān)檢測結(jié)果

2.1.1 兩組小鼠的肝組織病理學(xué)檢查比較 光鏡下觀察，正常組肝臟組織形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚；模型組可見大量肝細(xì)胞壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)模糊，組織匯管區(qū)充血，周邊出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤及大小不等的空泡樣變，肝細(xì)胞混濁腫脹、邊界不清、胞質(zhì)疏松淡染。見圖1。

2.1.2兩組小鼠血清ALT、AST活性結(jié)果 檢測血清中酶的活性的改變可以反映肝臟的功能情況，當(dāng)肝細(xì)胞受損時，肝細(xì)胞內(nèi)的ALT、AST釋放入血，血清ALT、AST活性會升高。因此，這兩種酶的活性升高成為肝功能受損的特異性指標(biāo)。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清ALT、AST活性顯著升高，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.020、5.033，P＜0.01）。見圖2。

圖1　鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)染色 HE×200A：正常組；B：模型組

圖2　正常組與模型組ALT、AST結(jié)果與正常組比較：**P＜0.01

2.1.3免疫組化法檢測肝組織Kv1.3蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肝組織Kv1.3蛋白表達(dá)明顯減少，見圖3。

圖3　免疫組化法標(biāo)記肝組織　Kv1.3的表達(dá) SP×200A：正常組；B：模型組

2.1.4實時熒光定量RT-PCR的相對定量結(jié)果采用qRT-PCR檢測正常組和模型組肝組織中Kv1.3及各細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，模型組肝組織中TNF-α、IL-6、IL-1βmRNA水平顯著升高（t=10.03、9.811、14.88，P＜0.01），Kv1.3 mRNA水平降低（t=3.353，P＜0.05）。見圖4。

2.1.5兩組間Kv1.3、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)量的比較 Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肝組織細(xì)胞因子TNF-α（t=9.532，P＜0.01）、IL-6（t=3.663，P＜0.05）蛋白表達(dá)水平升高，Kv1.3蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=5.941，P＜0.01）。見圖5。

2.2原代KCs中 Kv1.3、TNF-αm RNA的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，模型組提取的KCs中TNF-α mRNA表達(dá)顯著高于正常組（t=4.886，P＜0.01）。模型組Kv1.3 mRNA表達(dá)顯著低于正常組（t= 14.35，P＜0.01）。見圖6。

2.3體外LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞Kv1.3的表達(dá)模型組為采用1 000ng/ml LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h，qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組Kv1.3mRNA的表達(dá)降低，與正常組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.583，P＜0.05）。見圖7。

2.4M gTx抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞因子的分泌

2.4.1實時熒光定量RT-PCR的相對定量結(jié)果qRT-PCR結(jié)果顯示，MgTx預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-αmRNA表達(dá)水平降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=168.2、862.9、596.7、61.11，P＜0.05，P＜0.01）。見圖8。

2.4.2MgTx抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞因子分泌的蛋白 Western blot結(jié)果顯示，MgTx預(yù)處理后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌與LPS模型組相比，iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=377.3、109.5、115.0、20.44，P＜0.05，P＜0.01）。見圖9。

圖4　肝組織各細(xì)胞因子及　Kv1.3 mRNA表達(dá)水平與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖5　肝組織各細(xì)胞因子及　Kv1.3蛋白表達(dá)與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

圖6　原代KCs中Kv1.3、TNF-αmRNA表達(dá)水平與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

3　討論

急性肝損傷是易發(fā)和常見的肝臟疾病，而內(nèi)毒素血癥是引起肝損傷的主要病因，因此內(nèi)毒素誘發(fā)急性肝損傷模型的建立對基礎(chǔ)科研和臨床用藥研究有重要意義。嚙齒類動物腹腔內(nèi)單獨應(yīng)用LPS或與肝毒素共同作用建立肝臟急性炎癥損傷模型，已被廣泛應(yīng)用［4］。本實驗采用腹腔注射10 mg/kg LPS作用24 h后，收集血清和肝臟組織。組織病理學(xué)HE染色驗證模型建造成功，血清ALT/AST活性的測定反映了肝細(xì)胞損害和壞死的程度。

圖7　Kv1.3 mRNA表達(dá)水平與正常組比較：*P＜0.05

文獻(xiàn)［5］報道，CD4+T淋巴細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子如TNF、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）有促肝臟損傷作用，同時在自身免疫性肝臟疾病中，T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫炎癥顯著促進(jìn)此類肝臟疾病中肝臟損傷的發(fā)生和進(jìn)展［6］。在參與炎性反應(yīng)的細(xì)胞中，T淋巴細(xì)胞活化為CD8+和CD4+T細(xì)胞，通過分泌IL-1β、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活肝臟KCs，在這些細(xì)胞因子及相關(guān)黏附分子的介導(dǎo)下引起免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞及組織損傷［7］。KCs是肝內(nèi)定居的巨噬細(xì)胞，在炎癥和防御的過程中起重要作用。LPS可通過受體激活NF-κB，使肝臟KCs釋放內(nèi)源性致炎細(xì)胞因子，在免疫性肝損傷中發(fā)揮著重要作用。

細(xì)胞膜上離子通道電生理活性，對于細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞的增殖等起著重要作用。正常大鼠腹腔巨噬細(xì)胞鉀離子通道電生理特性證實了巨噬細(xì)胞表達(dá)不同的功能性鉀離子通道蛋白亞型［8］。文獻(xiàn)［9-10］報道，Kv1.3對巨噬細(xì)胞生理功能調(diào)節(jié)起著重要作用，影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。Kv1.3通道屬于電壓門控鉀通道Shaker家族，是由約500個氨基酸的亞單位非共價結(jié)合形成的同源四聚體，是巨噬細(xì)胞主要表達(dá)的鉀離子通道亞型。Kv1.3在動脈粥樣硬化［11］、胰腺癌［12］、乳腺癌［13］等疾病中異常表達(dá)，已成為疾病治療的重要靶點。

圖8　MgTx抑制　LPS誘導(dǎo)的　RAW264.7細(xì)胞因子分泌的　mRNA表達(dá)與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

鑒于Kv1.3在巨噬細(xì)胞及許多疾病中都起著重要作用，而Kv1.3在肝臟損傷方面暫無研究，為此本課題組設(shè)計探討Kv1.3在免疫性肝損傷中的作用。結(jié)果顯示，Kv1.3在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型中表達(dá)降低，提示Kv1.3的異常表達(dá)可能參與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程。體外實驗證實Kv1.3特異性阻斷劑MgTx能減少LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的釋放，同時發(fā)現(xiàn)，MgTx能減少 iNOS生成，抑制 NO釋放減少［14］。進(jìn)一步提示Kv1.3參與急性肝損傷過程，可能與調(diào)節(jié)KCs細(xì)胞因子的分泌有關(guān)。在肝損傷過程中，TNF-α、IL-6、IL-1β等細(xì)胞因子可造成炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞損傷壞死，最終導(dǎo)致肝臟病變，阻斷Kv1.3能減少KCs細(xì)胞因子分泌，表明Kv1.3在急性肝損傷過程中發(fā)揮著重要作用。

圖9　M gTx抑制　LPS誘導(dǎo)的　RAW 264.7細(xì)胞因子分泌蛋白表達(dá)與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01

鑒于Kv1.3在肝臟KCs活化過程中所扮演的角色，而KCs正是免疫性急性肝損傷重要的免疫細(xì)胞，Kv1.3將有可能成為免疫性肝損傷防治的重要靶點。

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Expression profile of voltage-gated potassium channel Kv1.3 in LPS-induced acute liver injury

Zhou Qun1，2，3，Wu Baoming1，2，3，Meng Xiaoming1，2，3，et al
（1School of Pharmacy，AnhuiMedical University，2Institute for Liver Diseases of Anhui Medical University，3Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032）

Objective To investigate the expression profile of voltage-gated potassium channel Kv1.3 in lipopo-lysaccharide（LPS）-induced acute liver injury.Methods C57BL/6 mice were injected with LPS intraperitoneally for 24 h，to establish themodel of acute liver injury.Themorphological changes of liver tissueswere observed by HE staining.Alanine aminotransferase（ALT）and aspartate aminotransferase（AST）levels weremeasured using test kits.The Kv1.3 expression was measured by immunohistochemistry，F(xiàn)lorescent real-time quantitative RT-PCR（qRT-PCR）and Western blot.Kupffer cells（KCs）were isolated by in situ perfusion，and then applied to detect Kv1.3，tumor necrosis factor alpha（TNF-α）expression by qRT-PCR.The expression of Kv1.3 was also detected in LPS-stimulated RAW264.7 cells.Margatoxin（MgTx）was pretreated to block Kv1.3 in LPS-stimulated RAW264.7 cells，then detected the expression of cytokines by qRT-PCR and Western blot.Results HE staining showed that liver tissueswere damaged by LPS，ALT and AST levels increased significantly after LPS treatment（P＜0.01）.The Kv1.3 expression decreased significantly inmodel group compared to normal group（P＜0.01）.Kv1.3 was low expressed in KCs in LPS-inducedacute liver injury model group（P＜0.01）.LPS-stimulated RAW264.7 cells expressedlow level of Kv1.3（P＜0.05），and MgTx，the Kv1.3 specific blocker，decreased LPS-induced cytokynesis secretion.Conclusion The results indicate that Kv1.3 is low expressed in LPS-induced acute liver injury and blocking of the Kv1.3 channel decreases LPS-induced cytokynesis secretion inmacrophage.Kv1.3 may play an important role in the treatment of liver diseases.

ion channel；acute liver injury；cytokynesis；Kupffer cells；T lymphocyte

R 967；R 965.2

A

1000-1492（2016）05-0649-07

2016-02-22接收

國家自然科學(xué)基金（編號：81273526、81473268、81500473）；安徽省科技攻關(guān)計劃項目（編號：1301042212）；安徽省自然科學(xué)基金（編號：1308085MH145）

安徽醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院、2肝病研究所，3安徽省創(chuàng)新藥物

產(chǎn)業(yè)共性研究院，合肥 230032

周 群，男，碩士研究生；

李 俊，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：lj@ahmu.edu.cn