奧曲肽在蜜蜂毒疼痛模型中的抗傷害感受作用及對背根神經節(jié)pCREB表達的影響

唐　珍，歐陽征鵬，王含彥，易　芳，郭冬梅，羅 蓉

奧曲肽在蜜蜂毒疼痛模型中的抗傷害感受作用及對背根神經節(jié)pCREB表達的影響

唐珍1*，歐陽征鵬2*，王含彥3*，易芳1，郭冬梅1，羅 蓉3

目的 利用傷害感受敏感型DA大鼠研究奧曲肽（OCT）在蜜蜂毒（BV）疼痛模型中的抗傷害感受作用以及背根神經節(jié)（DRG）內磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（pCREB）表達的變化，為生長抑素受體（SSTR）的外周鎮(zhèn)痛作用提供理論依據。方法 于DA大鼠右爪足底中間部位，用50μl微量注射器皮下注射BV（0.1mg/50μl）建立BV疼痛模型。成年雄性DA大鼠隨機分為5組：對照組、BV組、OCT組、對側OCT組和環(huán)生長抑素（c-SOM）組。分別用秒表和計數(shù)器記錄大鼠注射BV后抬/舔爪時間和自發(fā)性縮足反射次數(shù)等傷害感受行為。大鼠機械敏感性閾值用up-down法測定，用50%機械縮爪閾值（PWMT）表示，分別于注射前1 h和注射后1.5 h測量。熱刺激反應用熱縮爪潛伏期（PWTL）表示，于注射前30 min和注射后2 h測量。采用免疫組織化學方法觀察pCREB在DRG表達的變化。結果在DA大鼠足底注射BV后1 h內，OCT組比BV組的抬/舔爪持續(xù)時間均縮短（P＜0.05）；OCT組PWMT較BV組升高，但這兩組間PWTL差異無統(tǒng)計學意義。注射BV后BV組同側DRG中pCREB陽性細胞百分數(shù)較對照組明顯增加（P＜0.05），局部OCT預處理明顯減少pCREB陽性細胞百分數(shù)（P＜0.05）。結論 足底注射OCT抑制BV導致的自發(fā)性傷害感受行為和機械痛敏，并伴有同側DRG內pCREB表達降低，這一作用可能是OCT通過激活外周局部SSTR導致的。

奧曲肽；蜜蜂毒疼痛模型；背根神經節(jié)；pCREB

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.008.html

生長抑素（somatostatin，SST）是廣泛分布于中樞和外周神經系統(tǒng)的肽類物質，激活生長抑素受體（somatostatin receptor，SSTR）能抑制脊髓背角神經元的活性并導致動物傷害性行為的抑制和人類急慢性疼痛減輕［1］。奧曲肽（octreotide，OCT）是一種人工合成的由8個氨基酸組成的SST類似物。磷酸化cAMP應答元件結合蛋白（phosphorylated cAMP response element binding protein，pCREB）在痛覺信號傳遞中有重要作用。局部皮下注射角叉菜膠［2］、福爾馬林［3］后雙側腦內前扣帶回皮質、島葉皮質、脊髓背角神經元和背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經元內CREB磷酸化，并且CREB磷酸化與炎癥性疼痛時間一致。DA大鼠是一近交品系大鼠，其典型特點是對機械和熱刺激較其他種系大鼠更為敏感［4］。目前國內外尚無關于DA大鼠傷害感受行為學研究的相關報道。該研究利用疼痛敏感型DA大鼠，觀察OCT在BV模型中的抗傷害感受效應；并應用BV疼痛模型，用免疫組織化學方法探討pCREB在BV模型中在DRG表達的變化，初步探討SSTR鎮(zhèn)痛機制，為SST作為局部鎮(zhèn)痛劑的臨床應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料 75只成年雄性DA大鼠，190～250 g，由瑞典隆德大學引進。大鼠飼養(yǎng)于室溫20～25℃環(huán)境，12 h光/暗交替循環(huán)并給予標準食物。實驗遵循國際疼痛研究協(xié)會道德倫理要求。von Frey filament購自美國North Coast Medical公司；熱刺激儀購自北京碩林苑科技有限公司；冰凍切片機購自德國萊卡公司；自動磨刀機（ZMD-A）購自上海申醫(yī)教儀器廠；顯微照相系統(tǒng)購自日本 Olympus公司；BV、環(huán)生長抑素（cyclo-somatostatinc-SOM，c-SOM）及克紫購自美國Sigma公司；OCT購自瑞士Nowartis公司；戊巴比妥鈉購自上海山浦化學有限公司；SP免疫組織化學試劑盒及pCREB抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2建立BV模型，觀察自發(fā)傷害感受行為 于DA大鼠右爪足底中間部位，用50μl微量注射器皮下注射BV（0.1 mg/50μl）產生自發(fā)性傷害感受行為。行為學觀察指標包括：BV注射后大鼠抬/舔爪持續(xù)時間和自發(fā)性縮足反射次數(shù)以及大鼠的基礎機械縮爪閾值（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）、基礎熱縮爪潛伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）以及BV注射后2 h的PWMT、PWTL。分別用秒表和計數(shù)器記錄大鼠注射BV后1 h內抬/舔爪時間和自發(fā)性縮足反射次數(shù)等傷害感受行為。在每次實驗前大鼠先適應環(huán)境3 d，行為學測試前大鼠被放測試盒中30 min直到探索和理毛行為消失才開始正式測試。

1.3PWM T的測定 使用up-down法［5-6］及足底觸覺測量儀von Frey毛（力度梯度：0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、15.0 g）。首先使用2.0 g von Frey毛作用于大鼠足底皮膚6～8 s，若產生縮爪反應，則選擇其上一力度1.4 g von Frey毛彎曲至同一程度作用于大鼠足底皮膚的同一點，若2.0 g刺激無縮爪反應則選擇其下一力度4.0 g刺激，直至發(fā)現(xiàn)分別可誘發(fā)縮腿及無縮腿的相鄰兩個刺激強度后，依序繼續(xù)刺激4次，包括前面的2次，共刺激6次，即可計算50%PWMT。若要求力度超過15.0～0.4 g，則該閾值直接記為15.0 g或0.4 g。50%PWMT（以下簡稱PWMT）=10 lg（x）+kδ［x為最后刺激力度；k為刺激方式的系數(shù)，δ是指各刺激力度（g）相鄰間距的平均值，δ=0.17］。

1.4PWTL的測定 分別測定BV注射前30 min和注射后2 h的PWTL，參照文獻［7-10］測定，每只動物PWTL測定5次，輪流測定兩爪PWTL，5 min作為兩爪間隔時間，10 min作為同一爪的間隔時間。第1次測定值棄去，取后4次PWTL的平均值，20 s以上不反應的熱刺激確定為20 s。

1.5分組和藥物干預及灌注取材 大鼠共分為5組，隨機分配：①對照組：右側足底先注射生理鹽水（normal saline，NS）（60μl），10min后同一位點注射NS（50μl）；②BV組：右側足底先注射NS（60μl），10 min后再注射BV（50μl）；③OCT組：右側足底先注射OCT（60μl），10 min后再注射BV（50μl）；④對側OCT組：左側足底先注射 OCT（60μl），10 min后再右側足底注射BV（50μl）；⑤c-SOM組：在同側OCT（60μl）注射前，先注射SSTR拮抗劑c-SOM（60μl），10 min后注射OCT及隨后的BV。其中0.1 mg BV凍干粉溶解于50μl無菌 NS中配制成0.1 mg/50μl的BV液，OCT、c-SOM濃度分別為20、128μmol/L。

1.6免疫組織化學 注射BV后30 min在2%戊巴比妥腹腔注射麻醉后灌注取材按免疫組織化學流程操作，在2%戊巴比妥腹腔注射麻醉（80 mg/kg）后，以12號注射針頭從左心室插入升主動脈，用37℃NS 200～300 ml快速灌流沖洗血液，4℃、4%的多聚甲醛400 ml灌流固定后取出注射側L5 DRG，置于4%的多聚甲醛中后固定24 h，25%蔗糖中脫水至標本沉底，按免疫組織化學操作流程進行后續(xù)免疫組織化學實驗。包括載玻片預處理、免疫組織化學染色流程及染色后顯微照相?？贵w染色完成后置于1%的克紫中復染，然后封片計數(shù)pCREB陽性細胞百分數(shù)。每個大鼠隨機取5張切片進行統(tǒng)計學分析。每個實驗組5只動物。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SigmaStat 2.0軟件進行分析，數(shù)據用ˉx±s表示。對不同處理組的比較采用單因素方差分析，組間比較采用Dunnett法檢驗，注射BV前后的PWMT及PWTL的比較采用配對t檢驗進行分析。

2　結果

2.1OCT對BV導致的自發(fā)性傷害感受行為影響

注射BV后DA大鼠產生抬/舔爪和自發(fā)性縮足反射，BV組抬/舔爪持續(xù)時間和自發(fā)性縮足反射次數(shù)與對照組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而注射后1 h內OCT組抬/舔爪持續(xù)時間較BV組明顯減少（P＜0.05），但自發(fā)性縮足反射次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。表明OCT抑制了局部注射BV導致的自發(fā)性傷害感受行為。對側OCT組及c-SOM組抬/舔爪持續(xù)時間和自發(fā)性縮足反射次數(shù)與BV組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1　局部注射OCT對抬/舔爪和自發(fā)性縮足反射的抗傷害感受作用

表1　局部注射OCT對抬/舔爪和自發(fā)性縮足反射的抗傷害感受作用

與BV組比較：*P＜0.05

組別抬/舔爪持續(xù)時間（s）自發(fā)性縮足反射次數(shù)（次）對照　6.02±3.21*　7.80±3.33*BV　1 481.35±188.75　95.80±16.22 OCT　947.23±101.96*　101.00±18.12對側OCT　1 375.50±117.25　92.40±11.90 c-SOM　1 279.21±92.66　95.10±24.21

2.2OCT對PWM T的影響 與BV組比較，局部OCT預處理后PWMT明顯升高（P＜0.05），對側OCT預處理以及 c-SOM組 PWMT均與 BV組差異無統(tǒng)計學意義，表明OCT預處理減輕了DA大鼠因注射BV導致的機械痛敏，SSTR拮抗劑c-SOM拮抗了OCT的效應。見表2。

2.3OCT對PWTL的影響 各組在注射NS前后PWTL差異均無統(tǒng)計學意義。在BV組與OCT組，分別與注射前比較，注射后同側后爪PWTL明顯縮短（P＜0.05），表明足底局部注射BV導致了熱痛敏。與對照組再注射后比較，其他4組注射BV后同側后爪 PWTL均明顯降低（P＜0.05），表明局部OCT預處理對熱痛敏無效。見表3。

2.4OCT DRG內pCREB表達的影響 pCREB表達于DRG神經元中。在L5 DRG，大多數(shù)pCREB存在于?≤25μm的小神經元中。對照組和BV組同側L5 DRG的pCREB的陽性細胞表達百分數(shù)分別為（16.38±2.51）%和（31.04±3.50）%。與對照組比較，BV組同側DRG中 pCREB表達的細胞百分數(shù)明顯增加，局部OCT預處理后pCREB的陽性細胞表達百分數(shù)為（17.04±2.44）%，與BV組比較明顯減少（P＜0.05）；而對側OCT組及 c-SOM組 pCREB表達的陽性細胞百分數(shù)［（29.25±1.65）%、（26.76±3.52）%］與BV組差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

圖1　L5 DRG中pCREB的表達 ×200

3　討論

DA大鼠是一近交品系大鼠，繁殖能力較差，其細胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）2D1/2D2普遍缺乏，這種酶是人類CYP2D6同工酶的同系物［11］，能將可待因通過生物轉化成嗎啡而起到鎮(zhèn)痛效果。研究［3］表明DA大鼠對機械和熱刺激較其他種系大鼠更為敏感。

本研究結果表明，足底OCT預處理能降低BV所致的抬爪/舔爪持續(xù)時間，但對側OCT預處理沒產生類似的抗傷害感受作用。同側給予OCT注射之前用SSTR拮抗劑c-SOM預處理，拮抗了OCT的效應。這些結果提示，局部注射 OCT所產生的抗傷害感受作用是通過外周SSTR發(fā)揮作用的［12］。與以往報道［7］的SST通過外周SSTR在大鼠和人類發(fā)揮抗傷害感受作用一致。

表2　局部注射OCT對PWM T的影響

表2　局部注射OCT對PWM T的影響

與BV組比較：*P＜0.05

項目對照組　BV組　OCT組對側OCT組　c-SOM組預注射　4.53±0.61　4.08±0.39　4.93±0.49　4.31±0.54　4.20±0.31再注射　3.93±0.48*　2.12±0.66　4.99±0.59*2.73±0.58　3.08±0.29

表3　局部注射OCT對PW TL的影響

表3　局部注射OCT對PW TL的影響

與同一組預注射比較：*P＜0.05；與對照組再注射比較：#P＜0.05

項目對照組　BV組　OCT組對側OCT組　c-SOM組預注射　12.52±0.80　11.82±0.26　11.40±0.54　12.06±0.2411.93±0.17再注射　12.60±0.78　10.64±0.65*#　8.86±0.76*#　10.64±0.11*#　10.64±0.27*#

抑制傷害感受信息的傳遞是SST激動劑發(fā)揮抗傷害感受作用的重要機制［6］。在炎癥狀態(tài)下，SST能降低前炎癥性神經肽在感覺神經末梢的釋放，從而下調傷害感受［7］。SST也能作用于血管內皮細胞、炎癥細胞和免疫細胞上的受體，形成神經系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的交流網絡，從而發(fā)揮抗炎和抗傷害感受作用［8］。文獻［9］報道，SST能調節(jié)SD大鼠外周感覺神經末梢上的瞬時感受器電位香草酸受體1（transient receptor potential cation channel，subfamily V，member 1，TRPV1）離子通道。SSTR2a受體與TRPV1共存于L5 DRG細胞，SSTR能夠控制TRPV1受體離子通道的活性，后者在BV的致痛機制中發(fā)揮著重要作用［10］。在細胞水平，激活 SSTR開放多種鉀通道并抑制電壓依賴性鈣通道［13］，從而導致抑制動作電位和神經遞質的釋放。

本研究顯示，大鼠足底注射BV后同側DRG中pCREB較對照組表達升高。文獻［14］報道，CREB作為管家基因，在神經系統(tǒng)中參與多種生物功能的調控，如神經細胞的興奮等。CREB通過特異性 DNA共有序列CRE激活c-jun和c-fos，從而調節(jié)即早基因或一些晚期效應基因的轉錄。部分坐骨神經結扎模型和福爾馬林或角叉菜膠皮內注射引起的炎癥均可引起脊髓背角神經元早期pCREB增加，同時也可誘導脊髓背角Fos和Jun-D表達升高［15］。傷害性刺激后pCREB可能是一個比Fos表達更好代表神經元活動的指標，因為其誘導更加迅速和敏感［16］。本研究顯示局部注射OCT后，同側L5 DRG中 pCREB表達較BV組明顯減少，并出現(xiàn)了SSTR拮抗劑c-SOM預處理拮抗OCT這一效應。這一結果與前面觀察到的行為學結果一致，提示pCREB調節(jié)的基因轉錄在BV導致的疼痛行為中起著重要作用。

綜上所述，局部注射BV可導致DA大鼠產生自發(fā)疼痛行為、機械痛敏及熱痛敏。通過激活外周局部SSTR，實現(xiàn)OCT抑制此自發(fā)疼痛及機械痛敏。此結果可為SSTRs在外周發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用提供新證據。OCT通過激活外周SSTR后，產生抗傷害感受作用，傷害感受信息傳入減少使 DRG內pCREB表達降低，從而導致pCREB介導的痛覺信號轉導減弱。本研究為探討SSTR在外周抗傷害感受作用機制提供了新的資料，也為 SSTR激動劑OCT的局部鎮(zhèn)痛作用和臨床用藥提供理論依據。

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Antinociceptive effect of octreotide in bee vemon test and its effect on the expression of pCREB in dorsal root ganglion

Tang Zhen1，Ouyang Zhengpeng2，Wang Hanyan3，et al
（1Dept of Biological Chemistry，North Sichuan Medical College，Nanchong 637000；
2Sichuan Academy of Medical Sciences and Sichuan Provincial People′s Hospital，Chengdu 610072；
3Key Laboratory of Thermoregulation and Inflammation of Sichuan Higher Education Institutes，Chengdu Medical College，Chengdu 610083）

Objective To investigate the antinociceptive effect of octreotide（OCT）in bee vemon（BV）test and its effect on the expression of pCREB in dorsal rootganglion（DRG）using a inbred Dark-Agouti（DA）rats，which was sensitive to nociception.In doing so，evidence for peripheral analgesic action of somatostatin receptor（SSTR）was expected to provide.Methods Intraplantar injection of50μl bee venom（BV）was performed tomake the nociceptivemodel.Adultmale DA ratswere randomly divided into 5 groups：the control group，BV group，OCT group，the contralateral OCT group and cyclosomatostatin（c-SOM）group.A stopwatch and counter was used to record the duration of lifting/licking and number of flinches.Up-down method was used to measure 50%mechanical paw threshold（PWMT）.PWMT was determined 1 h before injection BV aswell as 1.5 h after injection，respectively. Paw withdrawal thermal latency（PWTL）was used to present thermal stimulation reaction.Itwasmeasured half an hour before injection BV and 2 h after injection.Immunohistochemicalmethod was used to explore pCREB expression in DRG.Results After intraplantar injection of BV，the duration of lifting/licking in one hour in OCT group was reduced than the BV group（P＜0.05），PWMTwas bigger in OCT group than that in the BV group.However，there was no significant difference in the PWTL between OCT group and BV group.In addition，the percentage of positive cell of pCREB was higher in the BV group than that in the control group in ipsilateral DRG（P＜0.05）. Local OCT pretreatment significantly reduced the percentage of positive cell of pCREB in ipsilateral DRG（P＜0.05）.Conclusion Local OCT pretreatment reduced the spontaneous nociception andmechanical pain sensitivity. In addition，the expression of pCREB in the ispsilateral DRG is reduced.These effectsmay be due to the activation of peripheral SSTRs.

octreotide；bee venom pain；dorsal root ganglion；pCREB

Q 426

A

1000-1492（2016）05-0624-05

2016-02-22接收

國家自然科學基金（編號：81160141）；四川省教育廳自然科學基金（編號：15ZA0251）；成都醫(yī)學院自然科學基金資助課題（編號：CYZ14-005）

1川北醫(yī)學院生物化學教研室，南充 6370002四川省醫(yī)學科學院、四川省人民醫(yī)院心血管超聲及心功能科，成都 610072

3成都醫(yī)學院體溫與炎癥四川省高校重點實驗室，四川610083

唐 珍，女，講師，碩士；

羅 蓉，女，副研究員，博士，責任作者，E-mail：luorong77@ 126.com

*對本文具有同等貢獻