Toll樣受體10基因rs10004195位點(diǎn)多態(tài)性與Hp感染以及相關(guān)疾病的關(guān)系

舒　穎，張平安，童永清

Toll樣受體10基因rs10004195位點(diǎn)多態(tài)性與Hp感染以及相關(guān)疾病的關(guān)系

舒穎，張平安，童永清

目的 探討Toll樣受體10（TLR10）基因rs10004195位點(diǎn)多態(tài)性與幽門(mén)螺桿菌（Hp）感染以及相關(guān)疾病的關(guān)系。方法 收集行胃鏡活檢的患者652例，同時(shí)采集患者外周血標(biāo)本。采用免疫膠體金法檢測(cè)患者外周血中Hp抗體，DNA直接測(cè)序方法檢測(cè)TLR10基因rs10004195位點(diǎn)基因型。結(jié)果 TLR10基因rs10004195位點(diǎn)AA、TT和AT基因型分別為30.98%、20.71%、48.31%；Hp抗體陽(yáng)性組TT基因型頻率明顯高于Hp抗體陰性組（P＜0.05）。Hp抗體陽(yáng)性組中各疾病組與對(duì)照組基因型分布的比較，以及Hp抗體陰性組中各疾病組與對(duì)照組基因型分布的比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 TLR10基因rs10004195位點(diǎn)多態(tài)性與Hp感染有易感相關(guān)性，而與Hp感染相關(guān)疾病無(wú)相關(guān)性。

Toll樣受體10基因；單核苷酸多態(tài)性；幽門(mén)螺桿菌

R 735.2

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.054.html

幽門(mén)螺桿菌（helicobacter pylori，Hp）是人類(lèi)最常見(jiàn)的慢性感染之一，不同的人群中，感染率有所不同，我國(guó)人群感染率為20%～80%［1］。個(gè)體感染Hp后也并非全都發(fā)病，部分可能僅為Hp抗體陽(yáng)性，而無(wú)任何病癥，且Hp感染后所表現(xiàn)的疾病類(lèi)型也不盡相同，Hp感染患者最終大約只有1%～2%會(huì)發(fā)展為胃癌［2］，不同個(gè)體針對(duì)Hp感染產(chǎn)生不同程度的生理病理反應(yīng)，這可能與細(xì)菌毒力、環(huán)境因素以及宿主本身的遺傳易感性密切相關(guān)。近年來(lái)，宿主的遺傳易感性在Hp的感染中的作用備受關(guān)注。IL-1B基因C-31T［3］以及FCGR2A基因rs368433位點(diǎn)［4］等基因多態(tài)性與Hp感染有易感相關(guān)性，其他一些基因多態(tài)性位點(diǎn)與Hp感染的相關(guān)目前也有研究。該研究擬探討TLR10基因rs10004195位點(diǎn)基因多態(tài)性與Hp感染以及Hp感染所致相關(guān)疾病的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1病例資料 收集2012年12月～2014年7月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)鏡中心進(jìn)行胃鏡活檢的就診患者652例。其中男416例，女236例，年齡17～73（46.8±6.3）歲。根據(jù)胃鏡及活組織病理學(xué)診斷，胃癌患者146例，消化道潰瘍患者90例，非萎縮性胃炎患者140例，胃黏膜組織正常者276例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽訂知情同意書(shū)。

1.2試劑與儀器 全血基因組DNA提取試劑盒（上海萊楓公司）；瓊脂糖（英國(guó)OXIOD公司）；DNA marker DL 2000（日本TaKaRa公司）；PCR試劑盒（深圳富酶泰斯生物技術(shù)有限公司）；胃Hp抗體檢測(cè)試劑盒（深圳市惠安公司）；ABI 9700基因擴(kuò)增儀、測(cè)序所用試劑和ABI 3130測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystem公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一公司）；凝膠成像系統(tǒng)（SYNGENE公司）。

1.3標(biāo)本的采集 采集所有研究對(duì)象空腹靜脈血3 ml，取1 ml，3 000 r/min離心5 min，分離出血清，-20℃保存?zhèn)溆茫?ml置于乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝試管中充分混勻，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4Hp抗體檢測(cè) 采用免疫膠體金法，按照Hp抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行Hp抗體檢測(cè)，靈敏度92.3%，特異性97.7%。

1.5基因組DNA提取 取EDTA-Na2抗凝血200 μl，按照因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取外周血基因組DNA，操作過(guò)程參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。所提取基因組DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6rs10004195位點(diǎn)基因型的檢測(cè) 參照Genbank中TLR10基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物：5′-TTGCACTCTCTCAGCAGAGCT-3′，下游引物：5′-GACATTTGCGGGACT GAGAA-3′，擴(kuò)增目的片段為376 bp。PCR總擴(kuò)增體系為20μl：mix 10μl，diH2O 7μl，DNA 2μl，10 μmol/L引物1μl。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，62℃退火40 s，72℃延伸1 min，30

2016-02-22接收

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)采用百分比表示，基因型和等位基因型頻率的比較，以及是否符合Hardy-Weiberg遺傳平衡采用Χ2檢驗(yàn)。關(guān)聯(lián)程度用OR值（95%CI）表示。

2　結(jié)果

2.1Hp抗體檢測(cè)結(jié)果 胃癌患者Hp抗體陽(yáng)性率為71.2%（104/146），消化道潰瘍患者為86.7%（78/90），慢性非萎縮性胃炎患者為68.6%（96/ 140），胃黏膜組織正常者為50.7%（140/276）。

2.2TLR10基因rs10004195位點(diǎn)基因型分析 經(jīng)PCR擴(kuò)增后，所得目的條帶片段大小為376 bp，見(jiàn)圖1。對(duì) 652例DNA樣本進(jìn)行分析，TLR10基因rs10004195位點(diǎn)AA、TT和AT基因型分別為30.98%（202/652）、20.71%（135/652）、48.31%（315/ 652），其中 Hp陽(yáng)性組AA、TT和 AT基因型分別為31.10%（130/418）、23.44%（98/418）、45.46%（190/ 418），Hp陰性組AA、TT和AT基因型分別為30.77%（72/234）、15.81%（37/234）、53.42%（125/ 234）?？?cè)后w、Hp陽(yáng)性組以及 Hp陰性組各基因型的分布均符合Hardy-Weiberg遺傳平衡定律（Χ2= 0.35、3.06、2.02，P＞0.05），具有群體代表性。3種基因型測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1　PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M：Marker

圖2　rs10004195位點(diǎn)3種基因型測(cè)序圖A：AA型；B：TT型；C：AT型；箭頭示多態(tài)性位點(diǎn)

2.3TLR10基因rs10004195位點(diǎn)多態(tài)性與Hp感染及相關(guān)疾病的關(guān)系 胃癌組、消化性潰瘍組、非萎縮性胃炎組以及胃黏膜組織正常組TLR10基因rs10004195位點(diǎn)基因型的分布均符合Hardy-Weiberg遺傳平衡定律（Χ2=1.53、0.11、0.24、0.02，P＞0.05）。TLR10基因rs10004195位點(diǎn)各基因型在Hp抗體陽(yáng)性組和陰性組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=6.2，P=0.04）；Hp抗體陽(yáng)性組TT基因型頻率明顯高于Hp抗體陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=5.32，P=0.02，OR=1.63，95%CI：1.07～2.48）。Hp抗體陽(yáng)性組中各疾病組與正常組基因型分布的比較以及Hp抗體陰性組中各疾病組與正常組基因型分布的比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　Hp抗體陽(yáng)性組中以及陰性組各疾病組與正常組基因型分布的比較

3　討論

Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的在抗病原微生物免疫防御反應(yīng)中起重要作用的受體蛋白，能通過(guò)識(shí)別細(xì)菌、病毒等病原體的相關(guān)模式分子，啟動(dòng)天然免疫和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫中也起著橋梁的作用。至今為止，在哺乳動(dòng)物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的TLRs家族成員有13種，其中在人類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的為T(mén)LR1～TLR10［5］。TLR10基因位于染色體4p14（第4染色體短臂1區(qū)4帶），有 4個(gè)外顯子，mRNA全長(zhǎng) 3 990 bp（NM＿030956.3），由于缺少嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型，目前對(duì)TLR10基因的研究甚少，其功能以及內(nèi)外源性配體仍不是很清楚。文獻(xiàn)［6-7］報(bào)道，TLR10基因高表達(dá)于淋巴組織系統(tǒng)，如脾臟、淋巴結(jié)、胸腺和扁桃體等，可能作為一種易感因素參與了人類(lèi)感染以及免疫性疾病的發(fā)生。研究［8］證實(shí)，TLR10基因啟動(dòng)子區(qū)rs10004195位點(diǎn)基因多態(tài)性與兒童IgA腎病有易感相關(guān)性。

該位點(diǎn)總?cè)后w3種基因型分布的頻率與亞洲地區(qū)日本人群以及歐洲地區(qū)人群的分布差異都較大，而Hp陰性組3種基因型的分布頻率與中國(guó)北京人群的分布相類(lèi)似（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/SNP/snp＿ref.cgi？rs=10004195），表明不同人種中rs10004195位點(diǎn)各基因型分布存在很明顯的差異。本研究顯示TLR10基因rs10004195位點(diǎn)各基因型在Hp抗體陽(yáng)性組和陰性組中的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Mayerle et al［4］通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析得出的結(jié)論相一致，并且通過(guò)測(cè)序的方法檢測(cè)出TLR10基因rs10004195位點(diǎn)TT基因型頻率在Hp抗體陽(yáng)性組中明顯高于Hp抗體陰性組，表明rs10004195位點(diǎn)TT基因型可能為人群感染Hp的易感因素，但確切的作用機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。除此之外，本文還比較了rs10004195位點(diǎn)Hp抗體陽(yáng)性組各疾病組與對(duì)照組基因型分布以及Hp抗體陰性組各疾病組與對(duì)照組基因型分布，顯示Hp抗體陽(yáng)性組以及陰性組中疾病組與對(duì)照組相比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明rs10004195位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性可能與胃癌、消化道潰瘍以及慢性萎縮性胃炎的發(fā)生不存在相關(guān)性。

綜上所述，本研究得出結(jié)論TLR10基因rs10004195位點(diǎn)TT基因型與Hp感染有易感相關(guān)性，表明了宿主的遺傳因素在Hp的感染過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，但確切的作用機(jī)制目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Association of rs10004195 single nucleotide polymorphisms in Toll like receptor 10 gene with helicobacter pylori infection and associated diseases

Shu Ying，Zhang Pingan，Tong Yongqing
（Dept of Laboratory Science，Renmin Hospital ofWuhan University，Wuhan 430060）

Objective To investigate the association of rs10004195 single nucleotide polymorphisms in Toll like receptor 10（TLR 10）gene with helicobacter pylori infection and associated diseases.Methods A total of 652 patients who has been examined by gastroscopy were obtained，and then peripheral blood sampleswere collected from all the patients.Immune colloidal gold method was used to test the serological Hp antibody of all the patients.TheTLR10 gene rs10004195 polymorphismswere examined by direct DNA sequencing of the PCR products.Results The frequencies of AA，TT and AT genotype on TLR10 rs10004195 were 30.98%，20.71%，48.31%；there was significant difference between Hp antibody positive group and Hp antibody negative group in the TT frequencies of TLR10 rs10004195（P＜0.05）.No significant difference between controls and Hp associated diseases groups in Hp antibody positive group or in Hp antibody negative group were observed.Conclusion There was correlation between the TLR10 rs10004195 locigenotype and the risk of Hp infection，but no correlation with Hp associated diseases.

Toll like receptor 10 gene；single nucleotide polymorphism；helicobacter pylori

A

1000-1492（2016）05-0728-04

國(guó)家臨床重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目（編號(hào)：財(cái)社［2010］305）

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，武漢 430060

舒 穎，女，技師；

張平安，男，主任技師，責(zé)任作者，E-mail：zhangpingan@ aliyun.com個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取10μl PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化上述DNA條帶，最后在ABI 3130測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序分析。