Graves病131I或抗甲狀腺藥物治療前后外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化

楊　靜，潘天榮，杜益君，鐘　興

Graves病131I或抗甲狀腺藥物治療前后外周血CD4+CD25+CD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化

楊靜，潘天榮，杜益君，鐘興

目的 探討調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在Graves?。℅D）患者外周血中變化，以及131I或抗甲狀腺藥物（ATD）治療后其變化趨勢，尋找評價131I和ATD治療療效的新指標(biāo)。方法健康者40例設(shè)為對照組，初診GD患者40例設(shè)為GD組，并將GD組隨機(jī)分成131I治療組（20例）及ATD治療組（20例）。檢測131I治療組、ATD治療組治療前、治療后及對照組CD4+CD25+CD127lowTreg比例、白介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）水平，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理相關(guān)結(jié)果。結(jié)果 ①治療前GD組Treg比例較對照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；②131I治療組、ATD治療組治療后第3個月及第6個月Treg比例較治療前均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；③治療后第3個月及第6個月，ATD治療組Treg比例與131I治療組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；④治療前GD組IL-10、TGF-β1水平較對照組均降低，治療后6個月，細(xì)胞因子水平較治療前均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），各時間點(diǎn)131I治療組與ATD治療組之間，細(xì)胞因子差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 GD患者Treg比例和功能顯著降低，治療后部分恢復(fù)，因此，對于甲亢患者，Treg可能是評價免疫狀態(tài)及治療后病情緩解的指標(biāo)之一。

Graves??；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞；碘131；抗甲狀腺藥物

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.036.html

Graves?。℅raves disease，GD）又稱彌漫性毒性甲狀腺腫，是一種器官特異性自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為高代謝癥候群、彌漫性甲狀腺腫、突眼等多系統(tǒng)綜合征，其主要內(nèi)科治療方法為抗甲狀腺藥物（antithyroid drugs，ATD）和放射性131I治療。但目前GD發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，并且治療效果、復(fù)發(fā)率的評價等尚無確切指標(biāo)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）自1995年被首次發(fā)現(xiàn)以來［1］，一直是免疫學(xué)者的研究熱點(diǎn)，其通過釋放抑制性細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能，參與多種免疫抑制疾病的發(fā)生發(fā)展。Saitoh et al［2］發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg細(xì)胞與鋸齒類動物GD的發(fā)生及病情嚴(yán)重程度相關(guān)。該研究旨在研究GD患者外周血Treg細(xì)胞比例及功能變化，以及131I和ATD治療后其變化趨勢，尋找評價131I和ATD治療療效的新指標(biāo)。

1　材料與方法

1.1病例資料 選擇2014年9月～2015年1月于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科的門診或住院患者，根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會2008年頒布的《中國甲狀腺疾病診治指南》確診的初診GD患者40例（GD組），診斷標(biāo)準(zhǔn)為：臨床甲亢癥狀、甲狀腺彌漫性腫大、總?cè)饧谞钕僭彼幔╰otal triiodothyronine，TT3）及總甲狀腺素（total thyroxine，TT4）的水平升高、促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）濃度減低、促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAb）陽性。排除GD合并眼病、應(yīng)用免疫抑制劑、橋本甲狀腺炎合并甲亢、亞甲炎合并甲亢、繼發(fā)性甲亢、醫(yī)源性甲亢等。將GD組隨機(jī)分為放射性131I治療組（131I治療組）20例及抗甲狀腺藥物治療組（ATD治療組，以甲巰咪唑?yàn)橹委熕幬铮?0例。對照組為性別及年齡匹配的、無甲狀腺病病史及家族史、TT3、TT4、TSH、TRAb在正常值范圍內(nèi)、2015年7月我院健康體檢者40例。兩組均排除經(jīng)治GD、妊娠可能的育齡婦女以及有其它自身免疫性疾病、感染或患有各種惡性腫瘤的患者。

1.2試劑及儀器 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD25單抗、藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的 CD127單抗、葉綠素蛋白偶聯(lián)物（PC5）標(biāo)記的CD4單抗、流式細(xì)胞儀（FC500-MCL）等購自美國Beckman Coulter公司；溶血劑為0.83%的氯化銨溶液；分析系統(tǒng)軟件為CXP系統(tǒng)；檢測細(xì)胞因子白介素10（interleukin 10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）的ELISA試劑盒購自武漢華美公司。

1.3檢測方法 ATD治療組及131I治療組患者分別于治療前、治療后第3個月、第6個月抽取空腹靜脈血檢測以下指標(biāo)，對照組患者在取得患者同意后抽取一次靜脈血測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3.1臨床指標(biāo)的檢測 采用化學(xué)發(fā)光法測定外周血TT3、TT4、TSH、TRAb水平。

1.3.2外周血CD4+CD25+CD127lowTreg檢測 采用肝素鈉抗凝管取靜脈血2～3 ml，室溫下放置待用。CD4+CD25+CD127lowTreg采用三色直接免疫熒光標(biāo)記法，首先在試管中加抗凝全血100μl，然后分別加入CD25-FITC、CD127-PE以及CD4-PC5單抗各10μl，充分混勻后室溫下避光反應(yīng)15 min，加入1 ml溶血劑，37℃水浴箱內(nèi)放置約10 min，待完全溶血時立刻上流式細(xì)胞儀檢測。檢測前對流式細(xì)胞儀進(jìn)行光流路質(zhì)量調(diào)控和熒光補(bǔ)償，使儀器各項(xiàng)指標(biāo)均在質(zhì)量控制允許值范圍內(nèi)。檢測時首先根據(jù)前向（FSC）和側(cè)向（SSC）散射光信號對淋巴細(xì)胞群進(jìn)行設(shè)門，每份標(biāo)本獲取設(shè)門內(nèi)細(xì)胞在10 000個以上，檢測后數(shù)據(jù)以Listmode文件形式保存。結(jié)果分析時，以CD4+淋巴細(xì)胞設(shè)門，分析CD25、CD127表達(dá)情況，以計(jì)算CD4+CD25+CD127lowTreg比例。

1.4細(xì)胞因子檢測 收集各樣本血清，儲藏于-80℃冰箱中待用。檢測時取出解凍、1 000 r/min離心15 min，采用ELISA試劑盒檢測IL-10、TGF-β1，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行加樣、顯色、測定吸光度，試驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔。使用專業(yè)軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線、計(jì)算樣本濃度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示；樣本間性別比較采用Χ2檢驗(yàn)，各樣本均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或重復(fù)測量資料的方差分析。單因素相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。

2　結(jié)果

2.1治療前GD組與對照組相關(guān)指標(biāo)比較 本研究共納入研究對象80例，GD組40例（男9例，女31例），對照組40例（男15例，女25例），兩組間性別比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Χ2=2.14，P＞0.05）。GD組TT3、TT4和TRAb水平顯著高于對照組（P＜0.01），TSH水平顯著低于對照組（P＜0.01）；與對照組（6.08±0.83）比較，治療前GD組CD4+CD25+CD127lowTreg的比例（5.21±1.64）降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-2.99，P＜0.01），見表1。

表1　治療前GD組及對照組臨床指標(biāo)比較（ˉx±s）

2.2131I和ATD兩種治療方法對CD4+CD25+CD127lowTreg比例的影響131I及ATD兩種方法治療后第3個月、第6個月時，CD4+CD25+CD127lowTreg比例較治療前均顯著增加（P＜0.01）。在治療6個月時CD4+CD25+CD127lowTreg比例與治療3個月比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。治療后3個月和6個月，131I治療、ATD兩種治療方法之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療前后與兩種治療措施之間不存在交互效應(yīng)（F=0.32，P=0.73）。見表2、圖1。各組Treg占CD4+細(xì)胞比例見圖2。

表2　治療前后及　ATD和碘治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg水平的影響

表2　治療前后及　ATD和碘治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg水平的影響

與治療前比較：**P＜0.01

時間　131I治療組　ATD治療組　t值　P值治療前5.25±1.51　5.17±1.80　0.15＞0.05治療3個月　7.59±1.43**7.85±1.67**　-0.54?。?.05治療6個月　7.33±2.56**7.63±1.38**-0.46?。?.05

圖1　治療前后及　ATD和131I治療分別對 CD4+CD25+CD127lowTreg影響

2.3CD4+CD25+CD127lowTreg比例與甲狀腺功能、TRAb的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示TRAb與Treg（r=0.17，P=0.29）、TT3與Treg（r=0.18，P =0.27）、TT4與Treg（r=0.21，P=0.20）、TSH與Treg（r=0.20，P=0.22）無顯著相關(guān)性。見圖3。

2.4細(xì)胞因子檢測 治療前GD組IL-10水平（20.25±4.41）與對照組（26.21±4.30）比較明顯降低（t=6.11，P＜0.05）。TGF-β1水平（1.62± 0.43）與對照組（2.64±0.64）比較明顯降低（t= 8.37，P＜0.05）。治療后6個月，細(xì)胞因子水平較治療前顯著升高（P＜0.05），ATD組與131I治療組之間，IL-10、TGF-β1水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3、4。

表3　131I治療組及　ATD治療組治療前后　IL-10水平變化

表3　131I治療組及　ATD治療組治療前后　IL-10水平變化

項(xiàng)目131I治療組（n=20）ATD治療組（n=20）　t值　P值治療前20.45±4.78　20.05±4.31　0.28＞0.05治療后6個月　24.41±5.77　23.94±3.52　0.31＞0.05 t值　-2.36　-3.13 P值?。?.05＜0.05

表4　131I治療組及　ATD治療組治療前后　TGF-β1水平變化

表4　131I治療組及　ATD治療組治療前后　TGF-β1水平變化

項(xiàng)目131I治療組（n=20）ATD治療組（n=20）　t值　P值治療前1.74±0.53　1.50±0.41　1.60＞0.05治療后6個月　2.25±0.79　2.12±0.59　0.59＞0.05 t值　-2.40　-4.29 P值?。?.05＜0.05

圖2　CD4+細(xì)胞中　CD4+CD25+CD127lowTreg比例

圖3　Treg與 TRAb、TT3、TT4、TSH相關(guān)性分析散點(diǎn)圖A：TRAb；B：TT3；C：TT4；D：TSH

3　討論

Treg穩(wěn)定機(jī)體免疫狀態(tài)和誘導(dǎo)免疫耐受作用的發(fā)現(xiàn)使得研究者們重新認(rèn)識機(jī)體免疫平衡機(jī)制，并且使免疫治療成為可能。Foxp3特異性表達(dá)在Treg細(xì)胞胞內(nèi)，并且在Treg的發(fā)育過程中發(fā)揮十分重要的作用，被公認(rèn)為鑒定CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［3］，但由于 Foxp3存在于胞內(nèi)，檢測方法復(fù)雜，CD127在Treg細(xì)胞表面中特異性低表達(dá)或無表達(dá)，與Foxp3水平存在良好的相關(guān)性，使得CD4+CD25+CD127low成為篩選Treg的重要篩選標(biāo)記［4］。

Treg通過細(xì)胞-細(xì)胞接觸抑制或釋放抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β1），發(fā)揮抑制效應(yīng)性T細(xì)胞的免疫應(yīng)答的作用［5］。本研究結(jié)果顯示，治療前GD組患者外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例及細(xì)胞因子IL-10、TG-β1水平均顯著低于對照者，提示GD患者不僅Treg比例失調(diào)，而且抑制功能也不同程度受損，導(dǎo)致其免疫耐受能力下降，對效應(yīng)性T細(xì)胞的抑制能力減弱，這可能是導(dǎo)致自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展的原因之一。多項(xiàng)研究［5-10］測定GD患者外周血中Treg細(xì)胞的比例或細(xì)胞因子較正常人均降低，與本研究結(jié)果一致。但研究［11-13］顯示，GD患者外周血Treg比例與正常者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能有：①部分研究［13］在納入研究對象時沒有檢測TRAb水平，不能排除納入患者中存在橋本甲亢患者；②選定不同的Treg表面因子對于Treg測定結(jié)果存在較大影響，例如Wang et al［9］選擇CD4+CD25+作為Treg分選標(biāo)記，對Treg識別特異度不高，但是其檢測出的Foxp3水平較正常者顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③樣本量與實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在相關(guān)性，孫偉莉等［12］實(shí)驗(yàn)中，對照組僅10例，使得結(jié)果誤差大，可能并不能反應(yīng)健康患者的真實(shí)水平。

本研究顯示，治療后隨著GD患者臨床癥狀的緩解及甲狀腺激素水平的降低，Treg比例及細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β1）水平較治療前均顯著升高，該結(jié)果與Mao et al［6］報(bào)道一致，提示治療后患者免疫狀態(tài)的改善。查兵兵等［14］測定131I治療后1個月時Treg比例較治療前有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其原因可能是因隨訪時間過短，治療尚未達(dá)到預(yù)期效果，患者機(jī)體的免疫機(jī)制尚未達(dá)到穩(wěn)態(tài)水平。

ATD治療GD時，其可通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制免疫反應(yīng)的作用，減少甲狀腺特異性抗原的釋放［15］。而131I則利用β射線直接損傷甲狀腺濾泡細(xì)胞，導(dǎo)致其破裂、死亡，使甲狀腺素合成及分泌減少以達(dá)到治療作用，其對免疫狀態(tài)的影響目前尚未明確。本研究中，GD兩種治療方法間比較，ATD治療組Treg比例較131I組輕度升高，但細(xì)胞因子水平（IL-10、TGF-β1）低于131I組，兩組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示131I治療也可改善GD患者免疫功能，今后將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，評價ATD及131I治療的作用。

本實(shí)驗(yàn)亦研究了TRAb水平與Treg的相關(guān)性，然而，結(jié)果顯示TRAb水平與患者 Treg無明確相關(guān)性，提示TRAb水平高低并不能真實(shí)地反映患者免疫狀態(tài)，這與Mao et al［6］報(bào)道的結(jié)果不一致，可能因?yàn)槟壳芭R床上檢測的TRAb并不是特異性反映甲狀腺受體刺激性抗體的水平有關(guān)，且不同的實(shí)驗(yàn)試劑盒靈敏度及特異度均存在差異。

綜上所述，本研究顯示甲亢患者Treg比例及功能明顯降低，經(jīng)ATD和131I治療后均可部分恢復(fù)，因此，對于甲亢患者，Treg可作為評價免疫狀態(tài)及治療后病情緩解的指標(biāo)之一。下一步將進(jìn)行長期隨訪，評價Treg的比例及功能變化是否與GD復(fù)發(fā)相關(guān)。

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Change of CD4+CD25+CD127lowregulatory T cells in peripheral blood of patients w ith Graves disease treated by131I or antithyroid drugs therapy

Yang Jing，Pan Tianrong，Du Yijun，et al
（Dept of Endocrinology，The Second Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230601）

Objective To investigate the changes of regulatory T cells（Treg）in Graves disease（GD）before and after being treated by131Ior antithyroid drugs（ATD），and to seek for new clinical indicators to evaluate the treatment response.Methods The study groups included 40 patients with GD（GD group），20 of whom were treated by131I，otherswere treated by ATD.Forty healthy donorswithout history of thyroid or autoimmune diseasewere enrolled in control group.The proportions of CD4+CD25+CD127lowTreg，IL-10 and TGF-β1 were tested before and after treatment respectively.Results ① The significant decrease in the proportion of CD4+CD25+CD127lowTreg cells in untreated GD patients（GD group）was found compared with the control group；②After treatment of131Ior ATD，the proportion of Treg was significantly higher than GD group in 3rd and 6th month（P＜0.05）；③There was no significant difference in the proportion of Treg between ATD group and131Igroup in 3rd and 6th month；④The characteristic of cytokine levels（such as IL-10，TGF-β1）was decreased in untreated GD group，and increased after being treated in 6thmonth（P＜0.05，respectively）.There was no significant difference in the cytokine levels between the131Igroup and ATD group at anymoment.Conclusion The proportion and function of Treg decrease in GD，but increase in both131Iand ATD therapy patients.The study shows that Tregmay play a critical role in affecting immunologic function and prognosis of GD patients.

Graves disease；regulatory T cells；131I therapy；antithyroid drugs

R 581.1

A

1000-1492（2016）05-0691-05

2016-02-25接收

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，合肥 230601

楊 靜，女，碩士研究生；

潘天榮，男，主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：ptr1968@163.com