高脂飲食對去卵巢大鼠骨強度及骨代謝的影響

朱小歡，尹倩倩，鮑瑩瑩，代　芳，張　楠，魯云霞，章　秋

高脂飲食對去卵巢大鼠骨強度及骨代謝的影響

朱小歡1，尹倩倩1，鮑瑩瑩2，代芳1，張楠1，魯云霞3，章秋1

目的 觀察高脂飲食對去卵巢大鼠骨強度及骨代謝指標的影響。方法 雌性SD大鼠隨機分為假手術基礎飼料組（SHAM組）、假手術高脂飼料組（HFD組）、去卵巢基礎飼料組（OVX組）和去卵巢高脂飼料組（OVX-HFD組）。HFD組和OVX-HFD組予30%高脂飼料喂養(yǎng)28周。實驗結束時檢測血清N端中段骨鈣素（N-MID-OT）和抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）水平，右股骨和腰椎骨密度（BMD）和骨礦含量（BMC），左股骨生物力學性能，左股骨鈣、磷和羥脯氨酸含量，測量右股骨遠端骨小梁HE染色形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)。結果 與SHAM組比較，OVX組血清TRAP顯著升高（P=0.000），股骨骨小梁分離度顯著增加（P=0.035），股骨BMD和BMC、股骨彈性載荷和最大載荷、股骨羥脯氨酸和鈣含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），HFD組血清N-MID-OT和TRAP顯著升高（P=0.007、0.000），股骨和腰椎 BMD、BMC顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），股骨彈性載荷和最大載荷、鈣含量、骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與OVX組比較，OVX-HFD組血清N-MIDOT和TRAP升高，差異無統(tǒng)計學意義，股骨和腰椎BMD、BMC、股骨彈性載荷和最大載荷、鈣含量、骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。結論 30%高脂飲食對去卵巢大鼠骨可能有保護作用。

大鼠；高脂飲食；絕經后骨質疏松；骨密度；骨生物力學；骨組織形態(tài)計量學

網絡出版時間：2016-4-19 11：04：48 網絡出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.014.html

隨著人們生活水平提高和人口老齡化，肥胖與骨質疏松已成為全球關注的健康問題。研究［1-3］表明，健康的絕經后女性總體脂與全身的骨密度（bone mineral density，BMD）呈正相關性，然而，也有研究［4］顯示，過度的脂肪并不能預防骨量丟失。該研究采用30%高脂飲食喂養(yǎng)去卵巢大鼠，旨在觀察高脂飲食對去卵巢大鼠骨骼強度及骨代謝指標的影響。

1　材料與方法

1.1實驗動物 3月齡雌性清潔級SD大鼠38只，（240±24）g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗室溫度20～25℃，相對濕度35%～60%，大鼠自由攝食飲水，每周稱1次體重。

1.2主要儀器和試劑 股骨生物力學性能在中國科學技術大學材料與力學實驗室應用E3000電子動靜態(tài)疲勞試驗機（英國Instron公司）完成測定；BMD測定應用Lunar iDXA雙能X射線骨密度儀（美國GE公司）；大鼠血清抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、N端中段骨鈣素（N-MID osteocalcin，N-MID-OT）、ELISA檢測試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）。

1.3造模與分組 將雌性SD大鼠隨機分為假手術基礎飼料組（SHAM組，n=8）、假手術高脂飼料組（HFD組，n=10）、去卵巢基礎飼料組（OVX組，n =10）和去卵巢高脂飼料組（OVX-HFD組，n=10）。OVX組和OVX-HFD組大鼠經10%水合氯醛（0.3～0.35 ml/100 g）腹腔麻醉，在無菌條件下距肋脊角1.2 cm處作約1 cm皮膚切口，切除雙側卵巢，切口逐層縫合，SHAM組、HFD組僅切除卵巢周圍少許脂肪組織［5］。SHAM組和 OVX組給予基礎飼料，由安徽醫(yī)科大學動物中心提供；HFD組和OVXHFD組在手術后1周給予高脂飲食（30%脂肪、0.632%鈣、0.01%維生素D3），喂養(yǎng)28周。

1.4測定指標

1.4.1血清相關指標測定 大鼠禁食12 h后，10%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈采血，測定空腹血糖（fasting blood-glucose，F(xiàn)BG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDLC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、雌二醇（estradiol，E2）、睪酮（testosterone，T）；ELISA法測定血清TRAP和NMID-OT水平。

1.4.2大鼠右股骨和腰椎BMD、骨礦含量（bone mineral content，BMC）測定 實驗第28周，大鼠處死后，用雙能X射線骨密度儀測定未剔除軟組織的股骨和腰椎BMD、BMC。

1.4.3大鼠骨強度測定 實驗結束時，小心分離大鼠左側股骨，剔除表面結締組織，用生理鹽水紗布包裹，外層包錫紙，-20℃保存。行骨強度測試前，先將股骨在4℃環(huán)境下解凍，然后轉移至室溫環(huán)境下，用E3000電子動靜態(tài)疲勞試驗機進行三點彎曲試驗，跨距17 mm。

1.4.4大鼠左股骨鈣、磷、羥脯氨酸含量測定 分離大鼠左側股骨，將表面結締組織剔除干凈，在80℃的干燥箱中烘72 h，稱量股骨干重，然后將股骨置于10 ml安瓿瓶中，倒入6 ml、6 mol/L鹽酸，用酒精噴燈封口，置于108℃的烘箱中反應24 h，水解液用濾紙過濾，測定濾液中鈣、磷、羥脯氨酸含量，由此計算出股骨中鈣、磷、羥脯氨酸含量（骨鈣總量/骨干重，骨磷總量/骨干重，骨羥脯氨酸總量/骨干重）。

1.4.5股骨形態(tài)學 分離大鼠右股骨，4%中性多聚甲醛固定48 h后，將股骨置于13%EDTA-2Na溶液中脫鈣2～3個月，刀片切下股骨遠端1/3段，經石蠟包埋，切片（厚度5μm），HE染色處理后，觀察股骨干骺端骨小梁形態(tài)，并用Image-J軟件分析骨小梁形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)［6］。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行分析，數(shù)據以ˉx±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著差異法（LSD法），方差不齊時，采用 Tamhane′s T2檢驗。

2　結果

2.1高脂飲食對大鼠體重的影響 與SHAM組比較，HFD組和OVX-HFD組大鼠高脂喂養(yǎng)后體重顯著增加（P＜0.05），OVX組大鼠體重顯著增加（P＜0.05）；OVX-HFD組、HFD組和OVX組間大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義。見圖1。

2.2高脂飲食對大鼠血清相關指標的影響 與SHAM組比較，HFD組血清FBG、TC、TG、T、N-MIDOT、TRAP水平顯著升高（P=0.000、0.009、0.022、0.000、0.007、0.000）；OVX組血清FBG、TRAP顯著升高（P=0.003、0.000），血清E2和T顯著降低（P =0.042、0.001）。與OVX組比較，OVX-HFD組血清FBG、TC、T顯著升高（P=0.000、0.002、0.003），血清E2、N-MID-OT、TRAP有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.413、0.627、0.325）。與HFD組比較，OVX-HFD組血清E2和T顯著降低（P=0.016、0.000），血清TRAP升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P =0.176）。

2.3高脂飲食對大鼠右股骨和腰椎BMD、BMC的影響 與SHAM組比較，HFD組右股骨BMD、BMC顯著升高（P=0.000），伴隨腰椎BMD、BMC顯著升高（P=0.000、0.028），OVX組右股骨BMD、BMC顯著降低（P=0.047、0.001）；與HFD組比較，OVX-HFD組右股骨和腰椎BMD顯著降低（P= 0.018、0.028）；與OVX組比較，OVX-HFD組右股骨BMD、BMC顯著升高（P=0.000），伴隨腰椎BMD、BMC顯著升高（P=0.001、0.041）。見表2。

圖1　高脂飲食對大鼠體重的影響

2.4高脂飲食對去勢大鼠左股骨生物力學性能的影響 與SHAM組比較，HFD組彈性載荷和最大載荷顯著增加（P=0.000），OVX組彈性載荷和最大載荷顯著降低（P=0.014、0.019）；與 HFD組比較，OVX-HFD組彈性載荷和最大載荷顯著降低（P= 0.025、0.007）；與OVX組比較，OVX-HFD組彈性載荷和最大載荷顯著增加（P=0.000、0.000）。彈性橈度、最大橈度和彈性模量，各組間差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

2.5高脂飲食對去勢大鼠左股骨鈣、磷、羥脯氨酸含量的影響 與SHAM組比較，HFD組羥脯氨酸含量顯著降低（P=0.049），鈣含量顯著升高（P= 0.000），OVX組的羥脯氨酸和鈣含量顯著降低（P= 0.005、0.003）；與HFD組比較，OVX-HFD組鈣含量顯著減少（P=0.043）；與OVX組比較，OVX-HFD組鈣含量顯著升高（P=0.000）。各組間磷含量差異無統(tǒng)計學意義。見圖2。

2.6高脂飲食對大鼠股骨遠端松質骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)的影響 與SHAM組比較，OVX組大鼠骨小梁稀疏、不連續(xù)，骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁數(shù)目和骨小梁厚度有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義，骨小梁分離度增加（P=0.035），HFD組大鼠骨小梁粗大、致密，骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁厚度增加（P= 0.000、0.038），但骨小梁數(shù)目減少（P=0.000）；與HFD組比較，OVX-HFD組骨小梁稀疏、斷裂，骨小梁面積百分數(shù)減少（P=0.001），骨小梁分離度增加（P=0.037）；與OVX組比較，OVX-HFD組大鼠骨小梁較致密、粗大，骨小梁面積百分數(shù)、骨小梁厚度增加（P=0.046、0.001），但骨小梁數(shù)目減少（P= 0.001）。見圖3、表4。

圖2　高脂飲食對大鼠左股骨羥脯氨酸、鈣和磷含量的影響

表1　高脂飲食對大鼠血清相關指標的影響

表1　高脂飲食對大鼠血清相關指標的影響

與 SHAM組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與HFD組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與OVX組比較：△△P＜0.01

項目　SHAM組（n=6）　HFD組（n=7）　OVX組（n=6）　OVX-HFD組（n=6）　F值N-MID-OT（ng/ml）　2.78±0.31　3.50±0.33**3.28±0.64　3.40±0.39　3.389 TRAP（U/L）　13.53±0.92　16.27±0.77**　16.49±1.40**　17.13±1.25　12.609 TC（mmol/L）　1.65±0.37　2.13±0.29**　1.50±0.14　2.10±0.33△△　7.107 TG（mmol/L）　0.23±0.03　0.33±0.11*　0.19±0.04　0.27±0.07　4.364 LDL-C（mmol/L）　0.38±0.20　0.52±0.24　0.28±0.06　0.39±0.10　2.275 HDL-C（mmol/L）　0.93±0.13　1.17±0.15　0.89±0.10　1.29±0.47　3.354 E2（pmol/L）　126.00±10.60　147.00±38.80　88.50±30.76*　103.00±30.50#　4.733 T（nmol/L）　2.91±0.17　3.74±0.39**　2.30±0.22**　2.82±0.20##△△　32.799 FBG（mmol/L）　5.94±0.67　14.68±1.53**　8.88±1.63**　13.10±1.96△△43.194

表2　高脂飲食對大鼠右股骨和腰椎BMD和BMC的影響

表2　高脂飲食對大鼠右股骨和腰椎BMD和BMC的影響

與SHAM組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與HFD組比較：#P＜0.05；與 OVX組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

項目　SHAM組（n=6）　HFD組（n=7）　OVX組（n=6）　OVX-HFD組（n=6）　F值股骨BMD（g/cm2）　0.23±0.02　0.29±0.03**　0.20±0.02*　0.26±0.01#△△19.234股骨BMC（g）　0.99±0.13　1.49±0.23**　0.62±0.12**　1.30±0.17△△　31.220腰椎BMD（g/cm2）　0.23±0.02　0.32±0.03**　0.21±0.03　0.28±0.04#△△　16.615腰椎BMC（g）　0.63±0.14　0.82±0.12*　0.62±0.05　0.79±0.21△3.496

表3　高脂飲食對大鼠左股骨生物力學性能的影響

表3　高脂飲食對大鼠左股骨生物力學性能的影響

與 SHAM組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與HFD組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與OVX組比較：△△P＜0.01

項目　SHAM組（n=6）　HFD組（n=7）　OVX組（n=6）　OVX-HFD組（n=6）　F值彈性載荷（N）　117.1±12.2　161.6±16.0**　89.8±14.8*　137.3±24.4#△△18.305最大載荷（N）　155.5±13.3　208.6±12.7**　129.0±18.8*　177.5±24.6##△△　21.122彈性橈度（mm）　0.28±0.04　0.36±0.13　0.23±0.04　0.32±0.14　2.128最大橈度（mm）　0.54±0.09　0.64±0.14　0.55±0.13　0.57±0.26　0.457彈性模量（Mpa）　8 402±1 717　6 621±1 579　6 701±1 592　7 768±1 920　1.531

表4　高脂飲食對大鼠股骨遠端松質骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)的影響

表4　高脂飲食對大鼠股骨遠端松質骨形態(tài)計量學靜態(tài)參數(shù)的影響

與 SHAM組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與HFD組比較：#P＜0.05，##P＜0.01；與OVX組比較：△P＜0.05，△△P＜0.01

項目　SHAM組（n=6）　HFD組（n=7）　OVX組（n=6）　OVX-HFD組（n=6）　F值骨小梁面積百分數(shù)（%）　42.9±7.4　58.8±7.7**　37.4±5.4　45.4±4.7##△12.843骨小梁厚度（μm）　86.0±19.5　207.4±80.0*　82.4±11.6　132.3±15.9△△　11.127骨小梁數(shù)目（個/mm）　5.1±0.4　3.1±0.7**　4.6±0.3　3.5±0.4△△　23.550骨小梁分離度（μm）　113.4±15.5　136.3±19.0　139.8±17.4*　161.5±27.4#5.660

圖3　高脂飲食對大鼠股骨遠端松質骨形態(tài)學的影響 HE×100A：SHAM組；B：HFD組；C：OVX組；D：OVX-HFD組

3　討論

本實驗通過去卵巢手術建立絕經后骨質疏松（postmenopausal osteoporosis，PMOP）大鼠模型，并從多個方面評價高脂飲食對PMOP大鼠骨的保護作用。高脂喂養(yǎng)28周后，HFD組和 OVX-HFD組大鼠與相應的基礎飼料組大鼠比較，血糖、血脂顯著升高，這與Zhou et al［7］的研究結果一致，T也顯著升高，可能與高脂飲食中的膽固醇向T轉化增加有關。OVX組和OVX-HFD組大鼠與相應的假手術組大鼠比較，血清T、E2顯著降低，提示PMOP合并高脂血癥模型建造成功。

絕經后女性發(fā)生骨質疏松的主要原因是雌激素的缺乏導致破骨細胞的功能增強，骨丟失加速。在臨床中，N-MID-OT是骨轉換和骨形成的特異性標志物，TRAP是骨吸收和破骨細胞活性的標志物。本研究中，OVX組與SHAM組比較，血清TRAP水平顯著升高，表明去卵巢后破骨細胞活性增強。本研究顯示HFD組大鼠血清N-MID-OT、TRAP水平及BMD顯著高于SHAM組，提示高脂飲食使正常大鼠骨轉換率加快，但HFD組大鼠BMD的增加表明其骨形成作用仍強于骨吸收作用。

BMD是評價骨量的可靠指標之一，也是目前臨床上診斷骨質疏松的主要標準之一。本研究顯示，OVX-HFD組大鼠右股骨和腰椎BMD顯著高于OVX組，HFD組大鼠右股骨和腰椎BMD顯著高于SHAM組，與吳琳等［8］和Lv etal［9］的研究結果基本一致。骨組織是由骨細胞和骨基質組成的。骨基質包括有機成分和無機成分，有機成分主要由膠原纖維組成，無機成分即骨鹽，以鈣、磷離子為主。實驗結果顯示，HFD組和OVX-HFD組大鼠的骨鈣含量分別高于SHAM組和OVX組，而組間羥脯氨酸和磷含量無明顯差異，表明高脂組大鼠骨礦含量的增加以骨鈣含量增加為主。

骨質疏松的病理過程包括骨組織微觀結構的破壞和骨脆性的增加。骨組織形態(tài)計量學可以很好地評價骨組織微觀結構的變化。通過大鼠松質骨形態(tài)計量學分析可以看出，OVX組大鼠骨小梁斷裂、稀疏，骨小梁面積百分數(shù)減少，高脂喂養(yǎng)后，雖然未能恢復到正常水平，但骨小梁結構明顯改善，說明30%高脂飲食可以改善去卵巢大鼠骨結構的退化。骨強度指骨組織對抗外力的能力，可全面評價骨的質與量［10］。本實驗采用三點彎曲試驗，通過對最大載荷、彈性載荷等指標的檢測，證明30%高脂飲食可以改善去卵巢大鼠和正常大鼠骨的生物力學性能。

研究［11］表明均衡的營養(yǎng)是維持骨健康的重要因素，比如飲食中的蛋白質、鈣、磷、維生素D和微量元素的比例適當。本實驗中的高脂飼料營養(yǎng)全面，成分明確，蛋白質占攝食總熱量的19.7%，碳水化合物占49%，脂肪占30%（大豆油提供5.5%的熱量，豬油提供 24.5%的熱量），鈣含量為 6.32 g/ kg，維生素D3含量為0.1 g/kg，且含一定比例的微量元素，有利于骨骼的生長。此外，Yang et al［12］報道，高體重或高體重指數(shù)患者有高的骨量，而減輕體重則引起骨量丟失，可能是因為高體重在骨骼上施加更大的機械壓力，使骨骼代償性地增生，其機制可能為通過Wnt/β-catenin信號通路［13］增加成骨細胞和骨細胞的增殖和分化。本實驗中高脂喂養(yǎng)的正常和去勢大鼠骨量增加，可能與以上兩種機制有關。

然而Ok et al［14］報道國際標準化的45%高脂飼料（其中含有的鈣、磷、維生素含量與本實驗所用高脂飼料相近）喂養(yǎng)的8周齡雌性去勢SD大鼠骨量丟失加重。張新樂等［15］發(fā)現(xiàn)長期脂肪乳劑灌胃會導致大鼠高脂血癥和骨量丟失。吳琳等［8］和Lv et al［9］在研究中所用的高脂飼料各種營養(yǎng)素的比例未告知，但其研究都表明高脂飲食對兩周齡的雄性C57BL/6小鼠的骨組織有保護作用。推測關于高脂與骨質疏松關系的動物實驗研究結論不一致的原因可能與高脂飼料的成分、動物的性別、種屬、喂養(yǎng)的時間和條件有關。

綜上所述，30%高脂飲食可以增加去卵巢大鼠和正常大鼠的骨量，提高骨強度，高脂可能對骨骼有保護作用。本研究也有一定的臨床意義，即對于絕經后的女性而言，飲食中脂肪的含量不宜過高，應著眼于營養(yǎng)全面、均衡，這對于預防肥胖和骨質疏松皆有益處。

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Effects of high-fat diet on bone strength and metabolic indices of ovariectom ized rats

Zhu Xiaohuan1，Yin Qianqian1，Bao Yingying2，et al
（1Dept of Endocrinology，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2Dept of Pediatrics，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601）

Objective To observe the effects of high-fat diet on bone strength and metabolic indices of ovariectomized rats.Methods Female SD ratswere randomly divided into sham operated group fed normal chow（SHAM），sham operated group fed high-fat diet（HFD），ovariectomized group fed normal chow（OVX）and ovariectomized group treated with high-fat diet（OVX-HFD）.The HFD and OVX-HFD group were fed high-fat diet containing 30%fat for 28 weeks.At the end of the experiment，serum N-MID osteocalcin（N-MID-OT）and tartrate-resistant acid phosphatase（TRAP）were detected；the bone mineral density（BMD）and bone mineral content（BMC）of rats′right femurs and lumbar vertebras，the biomechanics of rats′left femurs and contents of hydroxyproline，calcium and phosphorus of rats′left femurswere determined.HE stainingwas used to observe themorphology of rat trabecula in the distal femoralmetaphysis and the static parameters of distal femoral cancellous bone histomorphometry were calculated.Results Compared with SHAM group，serum TRAP level and femoral trabecular bone separation were significantly increased（P=0.000，0.035），while femoral BMD，BMC，elastic load，maximum load and contents of hydroxyproline and calcium were decreased remarkably（P＜0.05，P＜0.01）in OVX group.Compared with those in SHAM group，the serum levels of N-MID-OT and TRAP were elevated significantly（P=0.007，0.000），and the BMD，BMC of femurs and lumbar vertebras，elastic load，maximum load，femoral calcium contents，the percentage of femoral trabecular bone area and trabecular bone thickness were increased（P＜0.05，P＜0.01）in HFD group.Compared with OVX group，the BMD，BMC of femursand lumbar vertebras，elastic load，maximum load，femoral calcium contents，the percentage of femoral trabecular bone area and trabecular bone thickness were significantly increased（P＜0.05，P＜0.01），while serum levels of N-MID-OT and TRAP were increased without obvious differences in OVX-HFD group.Conclusion The high-fat diet containing 30%fatmay have a protective effect on bone of ovariectomized rats.

rat；high-fat diet；postmenopausal osteoporosis；bone mineral density；bone biomechanics；bone histomorphometry

R 589.21；R 681.4；R-332

A

1000-1492（2016）05-0637-06

2016-02-25接收

安徽省自然科學基金（編號：1308085MH154）

1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院內分泌科，合肥 230022

2安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院兒科，合肥 230601

3安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室，合肥230032

朱小歡，女，碩士研究生；

章 秋，女，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：aynfmk@163.com