大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，謝亞亞，李　悅，代貝貝，王志強(qiáng)，葛金芳，陳飛虎

大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建及其功能鑒定

周仁鵬，吳小山，王志森，謝亞亞，李?lèi)?，代貝貝，王志?qiáng)，葛金芳，陳飛虎

目的 構(gòu)建大鼠酸敏感離子通道1（ASIC1）基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pGL3-ASIC1-promoter，并進(jìn)行功能的鑒定。方法 設(shè)計(jì)、合成ASIC1啟動(dòng)子引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)從大鼠全基因組DNA中擴(kuò)增出ASIC1啟動(dòng)子片段；Nhe I和Xho I雙酶切后將目的片段連接到pGL3-Basic報(bào)告載體上；構(gòu)建的pGL3-ASIC1-promoter重組質(zhì)粒和pRLTK內(nèi)參質(zhì)粒瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測(cè)ASIC1啟動(dòng)子活性。結(jié)果 PCR擴(kuò)增得到大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子片段；成功構(gòu)建pGL3-ASIC1-promoter報(bào)告基因載體，菌落PCR和測(cè)序結(jié)果表明啟動(dòng)子DNA序列正確。與空質(zhì)粒pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組相比，pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性明顯增加（P＜0.01）。結(jié)論 成功構(gòu)建了大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子報(bào)告基因載體，為探究ASIC1轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

ASIC1；啟動(dòng)子；熒光素酶；報(bào)告基因

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-4-19 11：04：48 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160419.1104.006.html

酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）是一類(lèi)胞外H+激活的陽(yáng)離子通道，屬于阿米洛利敏感的上皮鈉通道/退變素（epithelial Na+channels/degenerin，ENaC/DEG）超家族，廣泛地表達(dá)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)以及非神經(jīng)組織中，通過(guò)介導(dǎo)Na+和Ca2+內(nèi)流參與各種病理生理效應(yīng)［1］。ASIC1因其對(duì)Ca2+有通透性而有廣泛的生物學(xué)功能及重要的生理病理學(xué)意義［2］。ASIC1a在佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上有表達(dá)［3-4］，并參與關(guān)節(jié)軟骨的代謝過(guò)程［5］；阻斷ASIC1a可以降低酸誘導(dǎo)的AA大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡［6-7］。由此推測(cè)ASIC1可能在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。該研究通過(guò)構(gòu)建大鼠ASIC1啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，并觀察其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，為探究其基因轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控機(jī)制以及為進(jìn)一步探究ASIC1在RA中的作用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料 293T細(xì)胞株（本實(shí)驗(yàn)室保存）；DMEM/ F-12培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 DH5α、Taq酶和 dNTP、PrimeSTAR、6 ×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；1 000 bp DNA ladder Marker（美國(guó)Thermo Scientific公司）；細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（美國(guó) Axygen公司）；限制性內(nèi)切酶Nhe I和Xho I（美國(guó)NEB公司）；pGL3-Basic載體、內(nèi)參質(zhì)粒pRLTK、Dual-Luciferase?Reporter Assay Kit、小抽試劑盒、GloMax?Multi Jr單管型多功能檢測(cè)儀（美國(guó)Promega公司）；無(wú)縫克隆試劑盒（上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司）；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、Opti-MEM（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 采用細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒抽提大鼠腦組織DNA，具體實(shí)施步驟按照產(chǎn)品操作說(shuō)明手冊(cè)進(jìn)行。對(duì)提取DNA測(cè)量光密度（optical density，OD）值后，加ddH2O保存于-20℃。

1.2.2ASIC1基因啟動(dòng)子序列PCR擴(kuò)增及純化登陸美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI），搜索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的大鼠ASIC1 DNA序列（Gene ID：79123），利用Primer 5.0軟件輔助設(shè)計(jì)針對(duì)ASIC1基因啟動(dòng)子區(qū)（-1545～+384）的引物，上游引物：5′-CTTACGCGTGCTAGCGCTTTATAGGTCGGCCATGGA-3′；下游引物：5′-ATCGCAGATCTCGAGCCTTGCCAAGGGGATCCTG-3′，上、下游引物分別引入酶切位點(diǎn)分別為Xho I、Nhe I，實(shí)驗(yàn)所需引物均委托上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。以所提取的大鼠腦基因組DNA為擴(kuò)增模板，采用50μl反應(yīng)體系：前段引物（10μmol/L）1.0μl、后段引物（10μmol/L）1.0μl、5×Buffer（with Mg2+）10μl、dNTP（各2.5 mmol/L）4μl、DNA模板1.0μl、PrimeSTAR 0.5μl，加ddH2O補(bǔ)足至50μl。循環(huán)條件為98℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s、55℃退火15 s、72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃10 min終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化備用。

1.2.3pGL3-ASIC1-promoter載體的構(gòu)建 用Xho I和Nhe I分別雙酶切PCR產(chǎn)物和pGL3-Basic載體，回收目的片段。將線性化載體和回收的目的片段以1：2（摩爾比）的比例加到試管中進(jìn)行重組反應(yīng)（42℃孵育30 min），放置2～3 min后取10μl反應(yīng)液體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含氨芐青霉素（100 mg/L）抗性的LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)16 h后，從轉(zhuǎn)化子的平板上隨即挑取8個(gè)菌落，挑取菌落接種于10μl含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中。取培養(yǎng)后的菌液（1μl），進(jìn)行菌落PCR，上游引物：5′-TCGCAGACACTCGTAGGCG-3′；下游引物：5′-CCTTATGCAGTTGCTCTCC-3′，以培養(yǎng)后的菌液為模板，采用20μl反應(yīng)體系：前段引物（10 μmol/L）0.8μl、后段引物（10μmol/L）0.8μl、5× Buffer（with Mg2+）2μl、dNTP（各 2.5 mmol/L）1.6 μl、DNA模板1.0μl、Taq酶0.1μl，加ddH2O補(bǔ)足至20μl。循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃10 min終止反應(yīng)。進(jìn)行凝膠電泳、觀察并照相。選取陽(yáng)性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌過(guò)夜；取含ASIC1啟動(dòng)子的菌液行DNA測(cè)序，之后提取質(zhì)粒備用。構(gòu)建攜帶ASIC1基因啟動(dòng)子序列的pGL3表達(dá)載體，命名為pGL3-ASIC1-promoter。

1.2.4熒光素酶報(bào)告基因載體轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞293T細(xì)胞于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的DMEM/F-12培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24 h將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)（密度為1× 105個(gè)/孔），種于24孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)至60%～70%，用50μl Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋0.9μg質(zhì)粒報(bào)告質(zhì)粒和0.1μg pRL-TK質(zhì)粒，同時(shí)1μl Lipofectamine2000溶于50μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，5 min后將兩者混合室溫靜置20 min；用PBS清洗細(xì)胞3次后加入400μl Opti-MEM，再逐滴加入質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物，輕輕搖晃，置37℃、5%CO2培養(yǎng)6 h，然后更換含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液500μl繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)中將作為陰性對(duì)照的pGL3-Basic空載體與作為內(nèi)參的pRL-TK質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)設(shè)6個(gè)復(fù)孔/次。

1.2.5熒光素酶報(bào)告基因活性的檢測(cè) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞1次，室溫?fù)u動(dòng)15 min。按照雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)，取100μl Luciferase Assay Buffer II于1.5 ml的離心管中；將GloMax?Multi Jr單管型多功能檢測(cè)儀測(cè)定間隔設(shè)定為2 s，測(cè)讀為10 s；將293T細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中，用移液器輕輕吸打2～3次混勻，切勿要旋渦振蕩，將離心管放入到化學(xué)發(fā)光儀中讀取螢火蟲(chóng)熒光素酶發(fā)光值；再將離心管移出發(fā)光儀，加入100μl Stop&Glo Reagent，用移液器吹打混勻后，再將離心管放回多功能檢測(cè)儀中讀取海腎熒光素酶發(fā)光值，計(jì)算前者與后者的發(fā)光值的比值，即為被檢測(cè)質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性（relative light unit，RLU）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)行兩組間的差異性分析，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1pGL3-Basic載體雙酶切 用NheⅠ和XhoⅠ對(duì)pGL3-Basic表達(dá)載體（圖 1A）進(jìn)行酶切，瓊脂糖電泳結(jié)果表明，在4 000～5 000 bp有明顯條帶，回收4 807 bp長(zhǎng)度的pGL3-Basic載體片段（圖1B）。

2.2大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增 以基因組DNA為模板擴(kuò)增ASIC1啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增的 PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.2%瓊脂糖電泳后，結(jié)果可見(jiàn)在約2 000 bp處出現(xiàn)單一的明亮的條帶，與1 929 bp的 ASIC1啟動(dòng)子片段大小相符合（圖2）。

2.3大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 PCR擴(kuò)增大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子片段（-1545～+384）后，將其克隆至pGL3-Basic載體上構(gòu)建 pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)化后涂布于LB瓊脂平板上，挑取8個(gè)克隆搖菌，菌落PCR鑒定結(jié)果顯示均出現(xiàn)了陽(yáng)性克隆片段（圖3A）；另外將所得陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序，DNA測(cè)序結(jié)果顯示，兩者序列一致（圖3B）。上述結(jié)果提示大鼠pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒已成功構(gòu)建。

2.4大鼠ASIC1基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的功能鑒定重組質(zhì)粒 pGL3-ASIC1-promoter和pGL3-Basic質(zhì)粒分別與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，觀察螢火蟲(chóng)以及內(nèi)參海腎熒光素酶報(bào)告基因活性，兩者活性的比值即為ASIC1啟動(dòng)子活性，內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK可以排除由于轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞數(shù)目等因素不同所引起的組間差異，結(jié)果表明，與空質(zhì)粒pGL3-Basic轉(zhuǎn)染組相比，重組質(zhì)粒pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性高14倍，兩者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-19.077，P＜0.01）（圖4）。提示構(gòu)建的大鼠pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒可以反映ASIC1啟動(dòng)子的功能。

圖1　載體及雙酶切瓊脂糖電泳A：pGL3-Basic質(zhì)粒載體圖譜；B：NheⅠ、XhoⅠ雙酶切后結(jié)果；M：Marker；1：4 807 bp的 pGL3-Basic片段

圖2　ASIC1啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果M：Marker；1：1 929 bp的　ASIC1啟動(dòng)子片段

圖3　pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒的鑒定A：菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果；M：Marker；1～8：8個(gè)克隆的　pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒的測(cè)序圖譜（部分）

圖4　pGL3-ASIC1-promoter轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后的相對(duì)熒光素酶活性與pGL3-Basic組比較：**P＜0.01

3　討論

ASICs是一類(lèi)H+門(mén)控的陽(yáng)離子通道，當(dāng)細(xì)胞外pH值下降（H+濃度上升）時(shí)，ASICs被激活，其離子通道打開(kāi)，通過(guò)對(duì)Na+和Ca2+的通透形成內(nèi)向電流，引起細(xì)胞膜去極化而產(chǎn)生興奮性效應(yīng)；幾乎所有疾病如癌癥、炎癥、缺血、缺氧等的過(guò)程都會(huì)引起不同程度的pH值下降，而ASICs作為一種重要的酸感受器，感受這種變化進(jìn)而影響著組織病理生理的改變［8］。近年來(lái)對(duì)ASICs的研究發(fā)展非常迅速，到目前為止，已克隆出來(lái)由4個(gè)基因編碼（ASIC1/Ac-cn2、ASIC2/Accn1、ASIC3/Accn3、ASIC4/Accn4）的7個(gè) ASIC亞基：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4；其中ASIC1a因其可以參與Ca2+內(nèi)流的調(diào)控并具有重要的生物學(xué)特性和病理生理學(xué)價(jià)值而深受關(guān)注［9］。大鼠ASIC1基因的全長(zhǎng)約為28 620 bp，包括由13個(gè)外顯子和12個(gè)內(nèi)含子，定位于第7號(hào)染色體7q36；其mRNA約3 800 bp，基因編碼528個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量約59 ku。近些年來(lái)，已有對(duì)ASIC1基因敲除、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控及下游靶分子的研究［10-11］，但對(duì)于其轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究較少。啟動(dòng)子是轉(zhuǎn)錄激活過(guò)程中起動(dòng)作用的特異的DNA序列，與序列上的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后可以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)翻譯，因此對(duì)于ASIC1基因啟動(dòng)子研究顯得尤為必要。

目前，熒光素酶報(bào)告基因是檢測(cè)檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與目的基因啟動(dòng)子區(qū)DNA相互作用的一種檢測(cè)方法；即將目的基因的啟動(dòng)子序列插入到報(bào)告基因質(zhì)粒中，然后將構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入相應(yīng)的細(xì)胞中，最后通過(guò)觀察報(bào)告基因表達(dá)的水平，可反映插入的啟動(dòng)子序列的功能［12-13］。在前期研究的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增了ASIC1啟動(dòng)子序列，并將這段序列定向克隆入pGL3-Basic載體中，菌落PCR和DNA測(cè)序分析證明導(dǎo)入序列、片段大小正確，成功構(gòu)建了ASIC1的報(bào)告基因質(zhì)粒。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pGL3-ASIC1-promoter與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，采用雙熒光素酶報(bào)告基因（DLRTM）檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行相對(duì)表達(dá)活性的檢測(cè)。結(jié)果顯示，空載體pGL3-Basic陰性對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄活性非常的低；而pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組有明顯的轉(zhuǎn)錄活性。證實(shí)了1 929 bp堿基ASIC1基因啟動(dòng)子區(qū)啟動(dòng)了熒光素酶的表達(dá)，提示這段靶序列具有較好的功能。成功構(gòu)建出大鼠pGL3-ASIC1-promoter質(zhì)粒是探究ASIC1表達(dá)轉(zhuǎn)錄的前提，這為進(jìn)一步尋找ASIC1基因調(diào)控區(qū)中的順式作用元件及其轉(zhuǎn)錄因子、甲基化狀態(tài)提供了有效工具，也為探究和篩選ASIC1a的抑制劑奠定了前期基礎(chǔ)。

［1］ LiW G，Xu T L.Acid-sensing ion channels：a novel therapeutic target for pain and anxiety［J］.Curr Pharm Des，2015，21（7）：885-94.

［2］ Li X，Wu FR，Xu R S，etal.Acid-sensing ion channel1a-mediated calcium influx regulates apoptosis of endplate chondrocytes in intervertebral discs［J］.Expert Opin Ther Targets，2014，18（1）：1-14.

［3］ Yuan F L，Chen FH，Lu W G，etal.Acid-sensing ion channel 1amediates acid-induced increases in intracellular calcium in rat articular chondrocytes［J］.Mol Cell Biochem，2010，340（1-2）：153-9.

［4］ 袁鳳來(lái)，陳飛虎，李 霞，等.大鼠關(guān)節(jié)軟骨酸敏感離子通道的表達(dá)［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（5）：513-6.

［5］ Yuan F L，Chen F H，Lu W G，et al.Inhibition of acid-sensing ion channels in articular chondrocytes by amiloride attenuatesarticular cartilage destruction in rats with adjuvant arthritis［J］.Inflamm Res，2010，59（11）：939-47.

［6］ Hu W，Chen F H，Yuan F L，etal.Blockade of acid-sensing ion channels protects articular chondrocytes from acid-induced apoptotic injury［J］.Inflamm Res，2012，61（4）：327-35.

［7］ Rong C，Chen F H，Jiang S，et al.Inhibition of acid-sensing ion channels by amiloride protects ratarticular chondrocytes from acidinduced apoptosis via amitochondrial-mediated pathway［J］.Cell Biol Int，2012，36（7）：635-41.

［8］ 周仁鵬，陳飛虎.酸敏感離子通道在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中作用的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2015，31（3）：315-8.

［9］ Deval E，Lingueglia E.Acid-Sensing Ion Channels and nociception in the peripheraland central nervous systems［J］.Neuropharmacology，2015，94：49-57.

［10］Yu XW，Hu Z L，Ni M，et al.Acid-sensing ion channels promote the inflammation andmigration of cultured ratmicroglia［J］. Glia，2015，63（3）：483-96.

［11］周仁鵬，吳小山，王志森，等.ASIC1基因敲除小鼠的繁殖及基因鑒定［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（9）：1341-3.

［12］Tirodkar T S，Lu P，Bai A，et al.Expression of ceramide synthase 6 transcriptionally activates acid ceramidase in a c-Jun N-terminal kinase（JNK）-dependentmanner［J］.JBiol Chem，2015，290（21）：13157-67.

［13］趙 虹，高星杰，葛 林，等.人Tudor-SN基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及活性檢測(cè)［J］.醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志，2011，8（3）：198-203.

Construction and identification of the rat ASIC1 promoter luciferase reporter p lasm id

Zhou Renpeng，Wu Xiaoshan，Wang Zhisen，et al
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Hefei 230032）

Objective To construct ratacid sensing ion channel1（ASIC1）promoter recombined luciferase reportergene plasmid，and then identify its function.Methods Primers were designed and synthetised，ASIC1 promoter fragment from rat genome DNA was replicated by polymerase chain reaction（PCR）.The luciferase report gene pGL3-Basic reporter vector and ASIC1 promoter were digested with restriction enzymes NheI and XhoI separately，and then ASIC1 promoter was connected to pGL3-Basic reporter vector.293T cells were transiently co-transfected with the constructed pGL3-ASIC1-promoter plasmid and pRL-TK control plasmid，and then detected for luciferase activity after 48 hours.Results Rat ASIC1 gene promoter was amplified by PCR and pGL3-ASIC1-promoter reporter vector was successfully constructed，and the result of colony PCR and sequencing analysis of recombined plasmid were correct.The transcriptional activity of pGL3-ASIC1-promoter plasmid group was significantly increased compared to that of pGL3-Basic plasmid group（P＜0.01）.Conclusion The rat ASIC1 promoter luciferase reporter gene vector can be successfully constructed，which provides a pivotal basis for further study of regulatorymechanism of ASIC1 gene in transcription.

ASIC1；promoter；luciferase；reporter gene

R 392.2

A

1000-1492（2016）05-0620-05

2016-03-02接收

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81271949）

安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032

周仁鵬，男，博士研究生；

陳飛虎，男，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：cfhchina@sohu.com