云南松松針中原花青素的含量測定研究

劉　嘉，肖培云，劉光明，楊永壽

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理　671000）

云南松松針中原花青素的含量測定研究

劉嘉1，肖培云1，劉光明1，楊永壽2*

（1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理671000）

目的：建立云南松松針中原花青素的含量測定方法，并研究不同月份云南松松針中原花青素的動(dòng)態(tài)變化。方法：通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)考察提取溶劑，溶劑pH值，提取溫度，提取時(shí)間等因素對原花青素提取的影響；并以兒茶素為對照，采用紫外-可見分光光度法，在500 nm處測定原花青素的含量。結(jié)果：云南松松針中原花青素的最佳提取工藝為：采用pH 4.0的50%乙醇沸水浴回流3.0 h。結(jié)論：該法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于云南松松針中原花青素的含量測定。

云南松松針；原花青素；含量測定

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.007

原花青素（proanthocyanidin）是廣泛存在于植物的葉、花、果、皮中的天然多酚化合物，是目前國際上公認(rèn)的天然抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，并能預(yù)防心血管疾病，抗腫瘤、抗輻射〔1〕等多種生物活性，且高效、低毒、生物利用度高等，已廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域，與原花青素相關(guān)的植物學(xué)和農(nóng)學(xué)性狀的研究、利用和改良正日益受到重視〔2〕。由于原花青素在自然界中總是以復(fù)雜混合物的形式存在，目前原花青素檢測方法主要有：酸-丁醇法、對二甲氨基肉桂醛法、香草醛-鹽酸法、花色素原法和Tannoid法〔3〕。其中香草醛-鹽酸法對原花青素（縮合單寧）的測定具有特異性，特別是對于黃烷醇類物質(zhì)測定效果較好〔4〕。

云南松（Pinus yunnanensis Franch）為常綠針葉喬木，又名青松，飛松，屬松科松屬植物。分布于云南、貴州西部、西藏東南部、四川西南部、廣西西部等海拔多為600～2 800 m的廣大地區(qū)〔5〕，資源十分豐富。松針（pine needle）是松樹的葉，別名豬鬃松葉、松毛，性溫，味苦，澀〔6〕。研究表明，其主要化學(xué)成分為多糖、植物蛋白、揮發(fā)油、原花青素、氨基酸、維生素、黃酮等〔7〕，具有鎮(zhèn)靜催眠、抗衰老、抗疲勞、抗氧化、抑菌、調(diào)血脂、保肝、抗腫瘤等藥理作用〔8〕。經(jīng)查閱文獻(xiàn)可知，云南松松針中原花青素的含量測定尚未見報(bào)道，本文通過研究，建立其含量測定的方法，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究云南松松針中原花青素的提取工藝，為該資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器UV-2550紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；AL204-IC電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；SSY-4電子恒溫水浴鍋（上海科析試驗(yàn)儀器廠）；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SK8200超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司，300 W，50 KHz）；101A-3B型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（上海一恒）。

1.2材料云南松松針（采自云南省大理市巍山縣者嬤山，海拔約2 500 m，由大理大學(xué)生藥與藥用植物學(xué)教研室楊月娥老師鑒定），兒茶素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110721-201039）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備精密稱取兒茶素對照品4.03 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，即得，冷藏放置，備用。

2.1.2供試品溶液的制備精密稱取云南松松針供試品（干燥、粉碎后過2號篩）0.5 g，置50 mL圓底燒瓶中，精密加入用鹽酸調(diào)至pH 4.0的50%乙醇溶液25 mL，密塞，稱重，水浴回流提取3.0 h，用pH 4.0 的50%乙醇溶液補(bǔ)重，混勻，用0.45 μm濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.34.0%的香草醛-甲醇溶液的制備精密稱取香草醛4.00 g，置100 mL量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，于暗處放置，備用〔4-9〕。

2.2單因素考察

2.2.1測量波長的選擇分別精密移取“2.1.1”、“2.1.2”項(xiàng)配制的供試品溶液、對照品溶液及50%乙醇各0.5 mL于10 mL棕色量瓶中，依次加入6 mL濃度為4.0%的香草醛-甲醇溶液，3 mL濃鹽酸，再加甲醇定容至10 mL，密塞、搖勻，避光反應(yīng)15 min，于400～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液都在500 nm波長處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔9-10〕，故選500 nm作為測量波長。見圖1。

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品-供試品紫外組合光譜

2.2.2提取方法考察精密稱取供試品6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下，以pH 4.0的50%乙醇為提取溶劑，提取時(shí)間2.5 h，制備供試品溶液，分別考察回流、超聲（300 W，50 KHz）2種提取方法，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，以外標(biāo)對照法計(jì)算原花青素的含量，結(jié)果表明，回流提取所得的原花青素含量最高，故采用回流提取法進(jìn)行提取。見表1。

表1　提取方法考察結(jié)果（n=3）

2.2.3提取溶劑的考察精密稱取供試品8份，每份約0.5 g，分別精密加入30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇及水溶液25 mL，80℃水浴回流2.5 h，提取液按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，并計(jì)算含量。見圖2。蒸餾水所提的松針原花青素含量最低；且乙醇濃度為30%～50%時(shí)，原花青素的含量隨乙醇濃度的增大而提高；但當(dāng)乙醇濃度大于50%以后，原花青素的含量開始下降，故可選擇50%乙醇溶液為提取溶劑。

圖2　不同含量乙醇溶液對原花青素提取的影響

2.2.4pH值的考察精密稱取供試品7份，每份約

0.5 g，分別加入pH值為2、3、4、5、6、7、8的50%乙醇溶液25 mL，80℃水浴回流2.5 h，提取液按“2.2.1”

項(xiàng)下顯色測定，并計(jì)算含量。原花青素的含量隨pH

的改變而改變，pH 4.0時(shí)最高，這與文獻(xiàn)〔11〕報(bào)道一致。見圖3。

圖3　pH對原花青素提取的影響

2.2.5提取溫度考察精密稱取供試品5份，每份約0.5 g，精密加入pH 4.0的50%乙醇溶液25 mL，分別在50、60、70、80℃及沸水下提取2.5 h，提取液按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，并計(jì)算含量。隨著提取溫度的升高，原花青素的含量呈增加的趨勢。故選擇用沸水浴提取。見圖4。

圖4　提取溫度對原花青素提取的影響

2.2.6提取時(shí)間的考察精密稱取供試品7份，每份約0.5 g，精密加入pH 4.0的50%乙醇溶液25 mL，分別提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，提取液按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，并計(jì)算含量。隨著提取時(shí)間的增加，原花青素的含量呈增加的趨勢，3.0 h后含量降低。故可選擇3.0 h為提取時(shí)間。見圖5。

圖5　提取時(shí)間對原花青素提取的影響

2.3正交試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以原花青素含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)L9（34）進(jìn)行優(yōu)化，因素水平見表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2　正交試驗(yàn)因素和水平表

表3　松針原花青素提取正交試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

由正交試驗(yàn)極差分析可知，4個(gè)影響因素對原花青素的影響順序是A＞D＞B＞C，即提取溫度＞pH值＞提取時(shí)間＞乙醇濃度，影響最大的為提取溫度。最佳工藝條件為A3B3C2D1，即：提取溶劑為pH 4.0的50%乙醇，提取溫度為沸水浴，提取時(shí)間3.0 h。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系的考察分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL棕色量瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y=34.595X+0.005 0，r=0.999 6，線性范圍為4.03～40.30 μg/mL。

2.4.2精密度試驗(yàn)精密移取兒茶素對照品0.5 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定，重復(fù)測定6次，RSD為0.18%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn)精密稱取供試品適量，按“2.1.2”制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)顯色，每隔10 min測定1次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在90 min內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.1%。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取供試品6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下顯色測定吸光度值，并計(jì)算含量。實(shí)驗(yàn)所得原花青素的平均含量為33.45 mg/g，RSD為2.6%，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。見表4。

表4　重復(fù)性試驗(yàn)表

2.4.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取供試品6份，每份約0.24 g，按表5精密加入兒茶素對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)顯色后測定，計(jì)算回收率。見表5。

2.5松針干燥方法的考察分別精密稱取不同干燥方法所得的云南松松針供試品各3份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)制備供試品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)顯色后測定吸光度值，并計(jì)算含量。烘箱烘干的云南松松針中原花青素含量顯著高于自然曬干和自然晾干的，故以烘箱烘干作為松針的干燥方法。見表6。

表5　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表6　不同干燥方法的考察（n=3）

2.6不同月份云南松松針中原花青素的含量測定由于藥材不同生長時(shí)期其主要成分的含量有所不同，因此實(shí)驗(yàn)考察了不同生長時(shí)期云南松松針中原花青素的含量。見圖6。由圖6可知：10月份的云南松松針中原花青素的含量最高，故云南松的采摘應(yīng)選擇在10月份左右。

圖6　不同月份松針中原花青素的含量

3　討論

采用香草醛-鹽酸法測定原花青素的質(zhì)量濃度，其原理是利用在醇體系中的原花青素各種黃烷-3-醇單元間的酚醛縮合反應(yīng)來測定原花青素的質(zhì)量濃度，是一種比較準(zhǔn)確的原花青素質(zhì)量濃度測定方法。

從提取所得原花青素的含量上看，采用回流提取法優(yōu)于超聲提取法；比較了曬干、晾干、烘干3種干燥方式，結(jié)果表明烘干的松針中原花青素的含量最高；通過單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)確定了云南松松針中原花青素的最佳提取工藝條件：采用pH 4.0的50%乙醇溶液進(jìn)行水浴回流提取3.0 h。

本實(shí)驗(yàn)通過研究，得到云南松松針中原花青素的提取和含量測定方法，該方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可作為云南松松針中原花青素的含量測定方法。

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〔Abstract〕Objective:To establish a method for determining proanthocyanidins in Yunnan pine needles and comparing their dynamic changes in different months.Methods:The influence of the extraction solvent，the pH of solvent，the temperature and the duration for the extraction proanthocyanidins were studied through single factor and orthogonal experiment.Taking catechin as controls，proanthocyanidins was determined on 500 nm by Ultraviolet-Visible Spectrophotometry.Results:The optimal parameters for the extraction of proanthocyanidins from Yunnan pine needles were 50%ethanol of pH 4.0 in the boiling water with reflux extraction，and each extraction time duration was 3.0 h.Conclusions:The method was simple and accurate，which could be used to measure the content of proanthocyanidins in Yunnan pine needles.

〔Key words〕Yunnan pine needles；proanthocyanidin；content determination

（責(zé)任編輯李楊）

Study on a Method for Determination of Proanthocyanidins in Yunnan Pine Needles

Liu Jia1，Xiao Peiyun1，Liu Guangming1，Yang Yongshou2*
（1.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）08-0024-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81260632）

2015-08-04

2015-10-24

劉嘉，碩士研究生，主要從事藥物分析研究.

楊永壽，高級實(shí)驗(yàn)師.