云南省部分蘭科植物中總氨基酸的含量測定

俞向東，伏孟瑜，陳路瓊，楊盛春*

（1.大理市環(huán)保局，云南大理　671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000）

云南省部分蘭科植物中總氨基酸的含量測定

俞向東1，伏孟瑜2，陳路瓊2，楊盛春2*

（1.大理市環(huán)保局，云南大理671000；2.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：對云南省部分蘭科植物中總氨基酸的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，并測定其含量。方法：通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化最佳提取條件，茚三酮顯色法在568 nm處測定總氨基酸的含量。結(jié)果：最佳提取條件為加入20 mL 75%乙醇，回流提取3次，每次60 min。甘氨酸對照品的濃度與吸光度在0.5～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8）。結(jié)論：茚三酮顯色法操作簡便，定量準(zhǔn)確，適用于蘭科植物中總氨基酸的含量測定。

蘭科植物；總氨基酸；含量測定

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.006

蘭科植物（Orchidaceae），是高等植物中分布最廣、種類最多的一個大家族，為單子葉植物第一大科，全球約700屬20 000余種，我國現(xiàn)已查明的蘭科植物為170余屬13 000余種〔1〕。蘭科植物具有很高的藥用價(jià)值，如天麻（Gastrodia elata）、鐵皮石斛（Dendrobium offcinale）、金線蓮（Anoectochilus formosanus）等〔2〕。蘭科植物中主要含有菲類、聯(lián)芐、甾體、黃酮類、多糖、氨基酸等成分〔3〕。目前對蘭科植物中總氨基酸含量測定的研究報(bào)道很少，本文利用溶劑加熱回流提取法〔4-5〕提取蘭科植物中的總氨基酸，并優(yōu)化提取工藝條件〔6〕，利用茚三酮顯色法〔7-9〕在568 nm處測定不同品種蘭科植物中總氨基酸的含量〔10-12〕，為蘭科植物中氨基酸的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；722N可見分光光度計(jì)（上海菁華科技儀器有限公司）；T6紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通儀器有限責(zé)任公司）；SB超聲波清洗機(jī)（寧波新枝生物科技股份有限公司）。

1.2試劑與材料甘氨酸對照品（中國新興化工試劑研究所，批號：130218）；茚三酮（分析純）；無水乙醇（分析純）；蘭科屬植物，經(jīng)昆明植物所胡江苗副研究員鑒定為蘭科植物屬芳香石豆蘭（Bulbophyllum ambrosia（Hance）Schltr.）、巖生石仙桃（Pholidota rupestrisHand-Mazz）、疊鞘石斛（Dendrobiumaurantiacum Rchb.f.var.denneanum（kerv）Z.H.Tsi）、巖筍（Thunia alba（Lindl.）Reichb.F），將新鮮的樣品晾干粉碎后，過60目篩備用。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.12%茚三酮溶液的制備精密稱取茚三酮約1.0 g置于50 mL量瓶中，加適量無水乙醇溶解后定容，冷藏備用。

2.1.2對照品溶液的制備精密稱取甘氨酸對照品0.100 0 g，加蒸餾水溶解后定容至100 mL。

2.1.3供試品溶液的制備精密稱取樣約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入20 mL 65%的乙醇，加熱回流提取3次，每次60 min。過濾，合并濾液，將濾液定容至100 mL，冷藏備用。

2.2最大吸收波長的選擇分別精密量取對照品溶液、供試品溶液各2 mL，置10 mL量瓶中，加入茚三酮溶液0.4 mL，搖勻，水浴加熱15 min，冷卻，蒸餾水定容，以試劑空白作參比，于400～600 nm掃描，對照品溶液和供試品溶液均在568nm處均有最大吸收。

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密移取對照品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，在568 nm處測定吸光度值。以甘氨酸對照品溶液的濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得線性回歸方程A=0.118 2 C-0.001 5，r=0.999 8，對照品溶液濃度與吸光度在0.5～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4單因素考察試驗(yàn)

2.4.1乙醇濃度精密稱取疊鞘石斛樣品5份，每份約1.0 g，置于圓底燒瓶中，分別加入55%、65%、75%、85%、95%的乙醇20 mL，加熱回流提取60 min，過濾，用相應(yīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的提取溶劑將濾液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色。結(jié)果顯示隨著乙醇濃度的增加，樣品中氨基酸的提取效率逐漸降低，在乙醇濃度為65%時(shí)，吸光度值最大。因此選擇65%的乙醇為提取劑。

2.4.2乙醇用量精密稱取疊鞘石斛樣品5份，每份約1.0 g，置于圓底燒瓶中，分別加入10、15、20、25、30 mL的65%乙醇，加熱回流提取60 min，過濾，用65%的乙醇將濾液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色。結(jié)果顯示隨著提取劑用量的增加，樣品中氨基酸的提取效率先增加再減小，當(dāng)乙醇用量為20 mL時(shí)，吸光度值最大。因此乙醇最佳用量為20 mL。

2.4.3提取時(shí)間精密稱取疊鞘石斛樣品3份，每份約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入65%的乙醇20 mL，分別加熱回流提取30、60、90 min，過濾，用65%的乙醇將濾液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色。結(jié)果顯示隨著提取次數(shù)的增加，樣品中氨基酸的提取效率先增加再減小，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，吸光度值最大。因此最佳提取時(shí)間為60 min。

2.4.4提取次數(shù)精密稱取疊鞘石斛樣品3份，每份約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入65%的乙醇20 mL，分別加熱回流提取1、2、3次、每次60 min，過濾，用65%的乙醇將濾液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL容量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色。結(jié)果顯示隨著提取時(shí)間的增加，樣品中氨基酸的提取效率逐漸降低，當(dāng)提取次數(shù)為2次時(shí)，吸光度值最大。因此提取2次為最佳提取次數(shù)。

2.5正交試驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）為考察因素，每個因素分別設(shè)定3個水平，建立因素水平表。采用L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，優(yōu)選最佳提取條件。見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

各因素對疊鞘石斛中總氨基酸的提取率影響的主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取次數(shù)＞乙醇用量。由極差分析可知，最佳提取條件為A3B2C2D3，即乙醇濃度為75%，乙醇用量為20 mL，提取時(shí)間為60 min，提取次數(shù)為3次。見表2。

表2　正交表L9（34）及試驗(yàn)結(jié)果

2.6驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)精密稱取疊鞘石斛樣品6份，每份約1.0 g，置于圓底燒瓶中，在最佳提取條件下，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，測定吸光度值。結(jié)果總氨基酸RSD為1.4%（n=6）。

2.7方法學(xué)考察

2.7.1精密度試驗(yàn)精密移取2 mL疊鞘石斛樣品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，連續(xù)測定6次，計(jì)算RSD為1.9%（n=6）。

2.7.2穩(wěn)定性試驗(yàn)精密移取2 mL疊鞘石斛樣品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，分別在0.25、0.5、1、2、4、8 h測定其吸收度值，樣品溶液顯色后在8 h內(nèi)穩(wěn)定，RSD為1.5%。

2.7.3重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取疊鞘石斛樣品6份，每份約1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，測定吸光度A，計(jì)算RSD值。見表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.7.4加樣回收率試驗(yàn)精密稱取疊鞘石斛樣品9份，每份約2.8 g，設(shè)高、中、低3個濃度，每個濃度各3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備疊鞘石斛樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，測定吸光度A，計(jì)算回收率。見表4。

表4　加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8樣品含量測定取不同蘭科植物各3份，每份約1.0 g，按“2.1.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，精密移取各供試品溶液2 mL于10 mL量瓶中，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色后，分別測定吸光度，計(jì)算總氨基酸的含量。總氨基酸含量的計(jì)算公式為：總氨基酸含量，其中C為氨基酸樣品液濃度，D為樣品液配制過程的稀釋倍數(shù)，1.599為轉(zhuǎn)換系數(shù)，W為樣品質(zhì)量。

不同蘭科植物總氨基酸含量差異很大，其中鹽筍全株中的總氨基酸的含量是最高的，而芳香石豆蘭全株中的總氨基酸的含量是最低的。見表5。

表5　不同蘭科植物總氨基酸含量測定

3　討論

預(yù)實(shí)驗(yàn)中，比較了溶劑加熱回流與超聲提取2種提取方法，溶劑加熱回流方法提取效率高，所以采用溶劑加熱回流提取法。根據(jù)所查文獻(xiàn)可知，測定氨基酸的方法有：化學(xué)法、分光光度法、色譜法和電化學(xué)法。對比這4種方法，分光光度法操作簡單，定量準(zhǔn)確，靈敏度高，相對誤差較小，實(shí)驗(yàn)成本低，所以本文采用分光光度法來測定蘭科植物中的總氨基酸含量。

氨基酸廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)、農(nóng)業(yè)、化妝行業(yè)，本文所用的甘氨酸對照品也有很多的用途，例如可以作抗菌劑、食品添加劑、調(diào)味劑、保鮮劑，此外還有調(diào)節(jié)人體胃液，延緩皮膚衰老等作用。隨著生活水平的提高，人們對氨基酸類物質(zhì)的需求越來越多，研究氨基酸是十分有意義的。本文研究蘭科植物中的總氨基酸提取工藝條件和含量，可為開發(fā)利用蘭科植物中的氨基酸提供依據(jù)。

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〔Abstract〕Objective：To optimize the extraction technology of total amino acids from parts of Orchidaceae plants in Yunnan and determine the content.Methods：The best extraction conditions were optimized by orthogonal test，and the content of total amino acids was determined in 568 nm through Nihydrin colorimetry method.Results：The best extraction conditions were as follows:20 mL 75%ethanol，3 times of reflux extraction and 60 min for each time.The concentration and the absorbance of the GLY show a good linear correlation when changing from 0.5 μg/mL to 10 μg/mL，r=0.999 8.Conclusion：Nihydrin colorimetry method is simple，accurate，which can be used for the determination of total amino acids in Orchidaceae plant.

〔key words〕Orchidaceae plant；total amino acids；content determination

（責(zé)任編輯李楊）

Determination of the Contents of Total Amino Acids in Parts of Orchidaceae Plants in Yunnan

Yu Xiangdong1，F(xiàn)u Mengyu2，Chen Luqiong2，Yang Shengchun2*
（1.Dali Municipal Environmental Protection Bureau，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）08-0020-04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81160393）；云南省教育廳科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（2014Y399）

2015-11-26

2016-01-17

俞向東，工程師，主要從事大氣和水質(zhì)監(jiān)測研究.

楊盛春，副教授.