差示分光光度法測(cè)定漾濞泡核桃花中的總黃酮含量

蘇　敏，楊盛春，周　萍

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理　671000）

差示分光光度法測(cè)定漾濞泡核桃花中的總黃酮含量

蘇敏，楊盛春，周萍*

（大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000）

目的：優(yōu)選漾濞泡核桃花總黃酮的提取工藝，建立漾濞泡核桃花總黃酮含量測(cè)定的方法。方法：在單因素考察基礎(chǔ)上，用正交試驗(yàn)法對(duì)漾濞泡核桃花總黃酮的提取工藝優(yōu)選，并以蘆丁為對(duì)照品，采用差示分光光度法測(cè)漾濞泡核桃花總黃酮含量。結(jié)果：漾濞泡核桃花總黃酮最佳提取工藝為：提取溶劑50%乙醇，料液比1：20，沸水加熱回流3次，每次40 min；漾濞泡核桃花總黃酮濃度在11～77 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度成良好線性關(guān)系（r=0.999 3），平均加樣回收率為99.7%，RSD為1.94%，總黃酮的含量為2.16%～2.82%。結(jié)論：此方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠，可作為漾濞泡核桃花總黃酮的含量測(cè)定。

漾濞泡核桃花；差示分光光度法；總黃酮；含量測(cè)定

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.005

泡核桃（Juglans sigillata Dode.）又名漾濞核桃，系胡桃亞科Juglandaceae胡桃屬Juglans植物〔1〕，主要分布在云南、貴州、四川等地〔2〕。2013年3月，國(guó)家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)對(duì)漾濞泡核桃實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。核桃植株全身都是寶，除了其果仁可食用外，核桃枝、核桃花、核桃殼、核桃葉等都可入藥〔3〕。核桃花即核桃花柱，又稱核桃紐，長(zhǎng)壽菜，龍須菜，含有豐富的磷脂，有益于增強(qiáng)人體細(xì)胞活力，促進(jìn)人體造血功能，能有效降低血脂，膽固醇，預(yù)防動(dòng)脈硬化，此外核桃花酊劑可治疣子〔4〕。賈忠等〔5〕從核桃花中分離鑒定了7個(gè)黃酮類化合物。趙磊等〔6〕采用HPLC-DAD對(duì)核桃花中槲皮素與山奈酚進(jìn)行了含量測(cè)定，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法對(duì)蘭州的核桃花總黃酮進(jìn)行了含量測(cè)定。因核桃花的提取物具有較深的顏色，對(duì)測(cè)定結(jié)果影響較大，故本實(shí)驗(yàn)采用差示分光光度法消除背景吸收的干擾，測(cè)定漾濞泡核桃花總黃酮含量，以期為漾濞泡核桃花的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

1.1儀器TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；CP224C電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；電子恒溫水浴鍋（上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠）；超聲波清潔器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2藥品與試劑蘆?。ㄖ袊?guó)藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)：080-9303）；乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁等試劑均為分析純；漾濞泡核桃花2013年4月采于漾濞縣平坡鎮(zhèn)（由大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院楊月娥老師鑒定為Juglans sigillata Dode.的花），樣品編號(hào)為1#～6#，將核桃花置陰涼通風(fēng)的地方自然風(fēng)干，粉碎備用。

2　實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1蘆丁對(duì)照品溶液的制備精密稱取在40℃下干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.5 mg置于25 mL量瓶中加入適量50%乙醇溶解，定容，搖勻，得0.22 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2樣品溶液的制備精密稱取1#樣品0.5 g，置100 mL的燒瓶中，加入50%的乙醇溶液10 mL，加熱回流3次，每次40 min，過濾，合并濾液后定容至50 mL，即得樣品溶液。

2.2測(cè)定波長(zhǎng)的選擇精密移取“2.1.1”對(duì)照品溶液1 mL和“2.1.2”樣品溶液2 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.2 mL搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液0.2 mL搖勻，放置6 min，再加入4%氫氧化鈉1 mL，搖勻放置15 min后定容，采用差示分光光度法在400～800 nm進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明，蘆丁對(duì)照品和樣品在510 nm處均有最大吸收，與文獻(xiàn)〔7-8〕報(bào)道一致，故選擇510 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3供試品溶液制備方法的考察

2.3.1提取方法的選擇取1#樣品10份（編號(hào)1至10號(hào)），每份約0.5 g，精密稱定，分別加入40%乙醇10 mL，其中第1、2號(hào)浸泡12 h后直接過濾，第3、4號(hào)浸泡12 h后加熱回流40 min后過濾，第5、6號(hào)直接加熱回流40 min后過濾，第7、8號(hào)直接超聲40 min后過濾，第9、10號(hào)浸泡12 h后超聲40 min后過濾，均定容至50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。結(jié)果表明加熱回流提取法的黃酮提取率均大于超聲提取法，浸泡12 h后加熱回流與直接加熱回流2種提取方法吸光度接近，故本實(shí)驗(yàn)采用直接加熱回流的方法。

2.3.2料液比的選擇精密稱取1#樣品7份，每份約0.5 g，以3：1、6：1、9：1、12：1、15：1、20：1、25：1的料液比加入40%的乙醇，在沸水浴中加熱回流40 min后過濾，濾液定容為50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見圖1。結(jié)果表明，料液比為20：1時(shí)總黃酮提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳料液比為20：1。

圖1　料液比對(duì)提取率的影響

2.3.3提取時(shí)間的選擇精密稱取1#樣品5份，每份約0.5 g，加入40%的乙醇10 mL，分別在沸水浴中加熱回流20、30、40、50、60 min后過濾，濾液定容為50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見圖2。結(jié)果表明，加熱回流40 min時(shí)總黃酮提取率較大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取時(shí)間為40 min。

圖2　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.3.4提取溫度的選擇精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，加入40%的乙醇10 mL，分別在40、50、60、70、80℃，沸水浴中加熱回流40 min后過濾，濾液定容為50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見圖3。結(jié)果表明，隨溫度的增加，總黃酮提取率變大，沸水時(shí)最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取溫度為沸水。

圖3　提取溫度對(duì)提取率的影響

2.3.5乙醇濃度的選擇精密稱取1#樣品8份，每份約0.5 g，加入20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇10 mL，分別在沸水浴中加熱回流40 min后過濾，濾液定容為50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見圖4。結(jié)果用40%乙醇總黃酮的提取率最高，因此選擇40%乙醇為提取溶劑。

圖4　乙醇濃度的選擇

2.3.6提取次數(shù)的考察精密稱取1#樣品3份，每份約0.5 g，加入40%的乙醇10 mL，分別在沸水浴中加熱回流1、2、3次，每次加熱40 min后過濾，濾液定容為50 mL。分別取各試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以各樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。見圖5。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮提取率變大，在提取3次的情況下總黃酮提取率最大，故本實(shí)驗(yàn)采用的最佳提取次數(shù)為3次。

圖5　提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

單因素考察泡核桃花總黃酮的提取方法為加入40%的乙醇料液比為1：20，在沸水浴中加熱回流3次，每次40 min。

2.4正交試驗(yàn)考察在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)核桃花總黃酮的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，選用L9（34）正交試驗(yàn)，選擇提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）、料液比（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平。確立因素水平見表1，結(jié)果見表2。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明，4種因素對(duì)提取結(jié)果影響大小依次為提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液比＞乙醇濃度。核桃花總黃酮提取最佳條件組合為A3B1C3D2，即最佳條件為50%乙醇濃度，料液比為1：20，提取3次，每次時(shí)間為40 min，總黃酮提取率最高。

表1　總黃酮提取正交因素及水平設(shè)計(jì)

表2　總黃酮提取的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

表3　提取工藝方差分析

2.5驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)精密稱取1#樣品3份，每份約0.5 g，按正交試驗(yàn)的最佳條件提取樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算黃酮提取率。結(jié)果總黃酮提取率為2.19%，RSD為1.67%。

3　方法學(xué)考察

3.1線性關(guān)系考察精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL分別于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（C）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到線性方程：Y=0.011 8 C+0.016，r= 0.999 3，結(jié)果表明蘆丁在11～77 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2顯色穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一樣品溶液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，分別放置0、0.5、1、2、4、6 h，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為1.56%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品6 h內(nèi)顯色穩(wěn)定性良好。

3.3樣品穩(wěn)定性試驗(yàn)取放置時(shí)間為0、0.5、1、2、4、6 h的同一樣品試液2 mL，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為2.19%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.4儀器精密度試驗(yàn)取同一樣品溶液2 mL，平行6份，于10 mL量瓶中，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD為1.05%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器精密度良好。

3.5重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取1#樣品6份，每份約0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算黃酮提取率。測(cè)得核桃花中總黃酮平均含量為2.24%，RSD為2.05%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的重復(fù)性良好。

3.6加樣回收率試驗(yàn)取已知總黃酮含量（2.24%）的1#樣品約0.25 g，平行6份，精密稱定，加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。見表4。

表4　加樣回收率試驗(yàn)

3.7樣品含量測(cè)定精密稱取1#～6#核桃花粉末各3份，每份約0.5 g。按“2.1.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.2”方法顯色，以樣品提取液作為空白對(duì)照，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入回歸方程計(jì)算黃酮提取率。見表5。

表5　樣品含量測(cè)定

4　討論

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道核桃花內(nèi)含有大量天然黑色素，且該色素易溶于水和乙醇〔9〕，李少泓等〔7〕采用紫外分光度法對(duì)核桃花中總黃酮進(jìn)行含量測(cè)定，但并未考慮核桃花提取液中色素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用比色法測(cè)總黃酮含量時(shí)會(huì)產(chǎn)生較大誤差〔10-11〕。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，掃描未顯色樣品提取液，在510 nm處吸光度大于0.2，測(cè)樣品溶液時(shí)，以空白試劑為參比測(cè)得的吸光度比以未顯色樣品溶液為參比時(shí)的吸光度大。由吸光度過高或過低引起較大測(cè)量誤差時(shí)采用差示分光光度法能提高其精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度，故本實(shí)驗(yàn)采用差示分光光度法。以NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色，并以等量未顯色的提取液作為參比，在510 nm處測(cè)定漾濞泡核桃花中的總黃酮含量，消除背景吸收的干擾。該方法操作簡(jiǎn)單，有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

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〔Abstract〕Objective:To optimize extraction technology of total flavonoids from the flower of Juglans sigillata Dode and establish its content determination method.Methods:On the basis of single factor test，orthogonal experiment was used to to optimize extraction technology of total flavonoids from the flower of Juglans sigillata Dode.With Rutin as the reference substance，differential spectrophotometry method was adopted to determine the content of total flavonids of the flower of Juglans sigillata Dode.Results:The optimum extraction conditions were described as follows:ethanol volume scores 50%，the solid/liquid ratio 1：20，3 times of heating reflux，and the time duration for each extraction was 40 min.Total flavonoids of the flower of Juglans sigillata Dode showed good linear relationship in the range of 11～77 μg/mL（r=0.999 3），the average recovery was 99.7%，RSD=1.94%.The content of total flavonoids was 2.24%.Conclusion:The method was simple，accurate，stable and reliable，and could be used to measure the content of total flavones of the flower of Juglans sigillata Dode.

〔Key words〕flower of Juglans sigillata Dode；differential spectrophotometry；total flavonoids；content determination

（責(zé)任編輯李楊）

The Determination of the Content of Total Flavonoids in Juglans sigillata Dode by Differential Spectrophotometry

Su Min，Yang Shengchun，Zhou Ping*
（College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）08-0015-05

大理大學(xué)應(yīng)用開發(fā)研究基金資助項(xiàng)目（KYYY201401）

2015-11-11

2016-03-28

蘇敏，碩士研究生，主要從事藥物分析研究.

周萍，教授.