丁苯酞腹腔注射對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制探討

王鵬，劉華坤，張磊，李玉芝，王凱麗

(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧 272000)

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丁苯酞腹腔注射對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制探討

王鵬，劉華坤，張磊，李玉芝，王凱麗

(濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院，山東濟(jì)寧 272000)

目的觀察丁苯酞腹腔注射對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，并探討其可能機(jī)制。方法60只成年健康SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C組各20只，A組大鼠腹腔注射400 mg/(kg·d)丁苯酞，B、C組予相同體積生理鹽水，共1周。A、B組均制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，C組僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處。比較各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、腦梗死體積及腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)蛋白、NF-κB mRNA。結(jié)果與C組比較，A組和B組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積、腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)及NF-κB蛋白、mRNA陽性細(xì)胞數(shù)增加；與B組比較，A組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積、腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)及NF-κB蛋白、mRNA陽性細(xì)胞數(shù)減少；P均<0.01。結(jié)論丁苯酞對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB表達(dá)、減少腦組織凋亡細(xì)胞有關(guān)。

丁苯酞；腦缺血再灌注損傷；核轉(zhuǎn)錄因子κB

使缺血腦組織盡快恢復(fù)再灌注是治療腦梗死最有效的方法，然而再灌注往往導(dǎo)致原有缺血腦組織的損害進(jìn)一步加重，即缺血再灌注損傷。既往研究[1]發(fā)現(xiàn)，炎癥因子參與到腦缺血再灌注損傷，其中核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在缺血再灌注損傷中起重要作用。丁苯酞具有抗血小板、促進(jìn)血管生成、改善循環(huán)、減少氧自由基生成、抗凋亡等作用，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腦梗死急性期的治療中。研究[2]證實(shí)，丁苯酞在腦缺血再灌注中產(chǎn)生腦組織保護(hù)作用，其機(jī)制可能涉及到抑制炎癥反應(yīng)，但確切的分子機(jī)制尚不明確。本研究觀察了丁苯酞腹腔注射對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的預(yù)防作用，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥品SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量220～240 g，清潔級(jí)，由濟(jì)南市藥物檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。丁苯酞購自石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司。

1.2丁苯酞用法及局灶性腦缺血再灌注損傷模型制備60只SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C組各20只，A組大鼠腹腔注射400 mg/(kg·d)丁苯酞，B、C組予相同體積生理鹽水，共1周。A、B組用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注損傷模型，缺血2 h，將線栓退至頸外動(dòng)脈殘端恢復(fù)再灌注24 h后做相應(yīng)處理。不符合模型要求的剔除，并及時(shí)補(bǔ)遺。C組僅暴露頸總動(dòng)脈及分叉處。術(shù)中均用白熾燈使其肛溫維持在體溫水平，術(shù)后單籠飼養(yǎng)。

1.3大鼠神經(jīng)功能評(píng)價(jià)于再灌注24 h時(shí)按文獻(xiàn)[3]等級(jí)評(píng)分法對(duì)神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分，無明顯神經(jīng)缺損癥狀計(jì)0分，不能伸展對(duì)側(cè)前肢計(jì)1分，行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)計(jì)2分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒計(jì)3分，不能自行行走伴意識(shí)喪失計(jì)4分。

1.4大鼠腦梗死體積測(cè)算每組隨機(jī)選取6只大鼠，于再灌注24 h后麻醉并斷頭取腦，自額極2 mm向后連續(xù)等距切取5個(gè)冠狀腦片，間距2 mm，2%TTC 37 ℃避光染色10 min。正常腦組織染為紅色，梗死組織為白色。梗死體積=各層梗死面積之和×層間隔(2 mm)。

1.5大鼠腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)觀察采用TUNEL法。高倍鏡下(400×)在梗死灶周圍隨機(jī)取4個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核數(shù)(胞質(zhì))；正常神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞核中有棕黃色或黃褐色顆粒定義為陽性表達(dá)，即凋亡細(xì)胞。

1.6大鼠腦組織NF-κB蛋白、mRNA檢測(cè)取各組剩余14只大鼠，麻醉后取仰臥固定，依次用生理鹽水、4%甲醛溶液各250 mL經(jīng)心臟灌注固定，斷頭，完整取腦，置于4%甲醛溶液后固定2 h，蒸餾水浸泡6 h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋。冠狀位切片后4 ℃保存，免疫組化和原位雜交備用。①NF-κB蛋白檢測(cè)：采用免疫組化法。石蠟切片脫蠟至水，按SABC免疫組化試劑盒說明染色，DAB顯色。光鏡下觀察胞質(zhì)或胞核有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。所有切片均在同一光強(qiáng)度、放大倍數(shù)下進(jìn)行觀察，每張切片先在低倍鏡下隨機(jī)選擇額頂葉梗死灶周圍區(qū)4個(gè)象限視野，然后在高倍鏡下(400×)選擇缺血灶周圍5個(gè)不連續(xù)的視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取其平均值為該張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。②NF-κB mRNA檢測(cè)：采用原位雜交法。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，滅活內(nèi)源性酶；滴加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；室溫后固定10 min，嚴(yán)格按照原位雜交檢測(cè)試劑盒操作程序進(jìn)行。陽性細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色。所有切片均在同一光強(qiáng)度下，同一放大倍數(shù)下進(jìn)行，每張切片先在低倍鏡下隨機(jī)選擇額頂葉梗死灶周圍區(qū)4個(gè)象限視野，然后在高倍鏡下(400×)選擇缺血灶周圍5個(gè)不連續(xù)的視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，取其平均值為該張切片的陽性細(xì)胞數(shù)。

2　結(jié)果

2.1兩組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積、腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積、腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較見表1。

表1　兩組神經(jīng)行為評(píng)分、腦梗死體積、腦組織凋亡細(xì)胞數(shù)比較

注：與C組比較，aP<0.01；與B組比較，bP<0.01。

2.2兩組腦組織NF-κB蛋白、mRNA表達(dá)比較腦組織NF-κB蛋白、mRNA表達(dá)比較見表2。

表2　兩組腦組織NF-κB蛋白、mRNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)，

注：與C組比較，aP<0.01；與B組比較，bP<0.01。

3　討論

目前，隨著溶栓治療的普及和神經(jīng)介入工作的開展，其成為腦梗死血管再通的有效治療方法，然而再灌注早期可能導(dǎo)致致死性腦水腫，出血轉(zhuǎn)化，神經(jīng)血管損傷，甚至腦組織死亡。因此，研究潛在內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制在治療缺血再灌注損傷時(shí)所起的作用尤為重要。炎癥因子的表達(dá)、炎癥反應(yīng)的異?？哼M(jìn)、神經(jīng)細(xì)胞的凋亡在腦缺血再灌注損傷過程中起重要作用[4]。

NF-κB作為機(jī)體廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)等靶基因的表達(dá)中起重要作用。在腦缺血、腦外傷、蛛網(wǎng)膜下腔出血等均有NF-κB參與[5～7]。大量證據(jù)表明，腦缺血再灌注損傷時(shí)，NF-κB信號(hào)通路激活，導(dǎo)致腦組織損傷加重[1,5,8]。在MCAO的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)再灌注30 min時(shí)腦組織NF-κB DNA表達(dá)明顯增加[9]。在缺血再灌注時(shí)，NF-κB激活導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)變化，加重腦組織損害，抑制NF-κB激活時(shí)改善實(shí)驗(yàn)大鼠神經(jīng)缺損評(píng)分、減少腦梗死體積、減輕腦水腫、降低凋亡細(xì)胞數(shù)，相應(yīng)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)減少[10]。另外，NF-κB P50亞基缺陷大鼠在缺血再灌注時(shí)腦組織損傷明顯降低[11]；而缺血后以藥物處理，發(fā)現(xiàn)異氟烷、芍藥苷等通過抑制NF-κB的激活，減少腦組織的損害，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[12～14]。

目前，丁苯酞已廣泛用于腦梗死的治療中。研究[15～17]發(fā)現(xiàn)，丁苯酞通過改善線粒體功能，抑制自由基，維持血腦屏障的完整性，減少腦梗死面積，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。文獻(xiàn)[2]報(bào)道，丁苯酞能抑制炎癥因子NF-κB、TNF-α、IL-6炎癥因子表達(dá)產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。丁苯酞腹腔注射可抑制大腦皮層炎癥細(xì)胞浸潤，使神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷減輕[18]。任建宏等[19]發(fā)現(xiàn)，丁苯酞腹腔注射能夠抑制TLR4及內(nèi)源性配體的表達(dá)，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，發(fā)揮腦保護(hù)作用。另外，丁苯酞在大鼠缺血再灌注的模型中能夠通過抑制細(xì)的凋亡，從而對(duì)缺血再灌注所導(dǎo)致?lián)p傷起到神經(jīng)保作用，并且改善效果與缺血再灌注的時(shí)間及給予丁苯酞的時(shí)間有密切關(guān)系[20]。

總之，丁苯酞對(duì)大鼠缺血再灌注損傷有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB表達(dá)、減少腦組織凋亡細(xì)胞有關(guān)。

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王凱麗(E-mail: wangkaili20033@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.012

R743.3

A

1002-266X(2016)15-0038-03

2015-12-17)