結直腸癌組織中Id-1、MMP-9的表達變化及其意義

武雪亮，王立坤，薛軍，楊東東，屈明，郭飛，楊瑞敏，馬鵬程，劉博

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

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結直腸癌組織中Id-1、MMP-9的表達變化及其意義

武雪亮，王立坤，薛軍，楊東東，屈明，郭飛，楊瑞敏，馬鵬程，劉博

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北張家口 075000)

目的觀察結直腸癌組織中癌基因DNA結合分化抑制蛋白1(Id-1)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達變化，并探討其意義。方法結直腸癌組織50例份(觀察組)，正常結直腸組織50例份(對照組)，分別采用免疫組化法、RT-PCR法、Western blotting法檢測兩組Id-1、MMP-9，分析Id-1、MMP-9陽性表達與結直腸癌臨床病理參數(shù)的關系。結果觀察組及對照組Id-1陽性表達率分別為72%、24%，MMP-9陽性表達率分別為78%、22%，兩組比較，P均<0.05。Id-1、MMP-9陽性表達均與結直腸癌漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤相關(P均<0.05)。觀察組及對照組Id-1 mRNA的相對表達量分別為0.96±0.03、0.20±0.04，MMP-9 mRNA的相對表達量分別為0.88±0.04、0.21±0.03，兩組比較，P均<0.05。觀察組及對照組Id-1蛋白的相對表達量分別為0.82±0.04、0.31±0.02，MMP-9蛋白的相對表達量分別為0.86±0.05、0.29±0.03，兩組比較，P均<0.05。結論結直腸癌組織中Id-1、MMP-9表達升高，二者表達與結直腸癌漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤相關。

結腸癌；直腸癌；DNA結合分化抑制蛋白1；基質金屬蛋白酶9

最新流行病學研究顯示，未來5年我國結直腸癌新發(fā)病例將呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡有提前趨勢，嚴重危害國民健康。復發(fā)和遠處轉移(直接浸潤、淋巴結轉移、血行轉移等)是結直腸癌患者預后差的主要原因[1,2]。動物實驗證實，DNA結合分化抑制蛋白1(Id-1)能誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤的生長及侵襲，其表達缺失、沉默與多種惡性腫瘤的發(fā)生、進展、預后密切相關[3～7]?；|金屬蛋白酶9(MMP-9)不僅能降解間質內的基質成分，誘導腫瘤細胞突破基底膜侵襲鄰近組織，而且能促進腫瘤微血管的形成，加速血行轉移。本研究觀察了結直腸癌組織中Id-1、MMP-9的表達變化，并探討其意義。

1　資料與方法

1.1臨床資料選取2012年5月～2014年5月河北北方學院附屬第一醫(yī)院收治的結直腸癌患者50例，男29例，女21例；年齡33～70歲，中位年齡56歲，其中≥60歲34例、<60歲16例；腫瘤直徑≥5 cm 31例，<5 cm 19例；有漿膜浸潤39例，無漿膜浸潤11例；高分化12例，中分化21例，低分化17例；TNM分期Ⅰ、Ⅱ期13例，Ⅲ、Ⅳ期37例；有淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移21例；有肝轉移15例，無肝轉移35例；有脈管浸潤16例，無脈管浸潤34例。手術留取結直腸癌組織50例份(觀察組)和癌旁(距離腫瘤組織>5 cm)正常組織50例份(對照組)。

1.2Id-1、MMP-9蛋白檢測方法①免疫組化法:收集蠟塊并切片，切片厚度為4 μm。HE染色，病理診斷。切片經過80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復；PBS洗3次，加入兔抗人單克隆Id-1抗體(1∶250)、鼠抗人MMP-9單克隆抗體(1∶150)，4 ℃過夜；PBS洗3次，加入相關二抗。室溫下使用DAB顯色試劑顯色，蘇木精輕度復染，1%的鹽酸乙醇分化5 min、梯度乙醇脫水80%、85%、90%、95%、100%、100%及松節(jié)油透明5 min，最后以樹膠封片。陰性對照為PBS代替一抗。結果判定標準[8]：細胞質中有棕黃色、褐色顆粒，計數(shù)陽性細胞百分率并計分，≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，>75%計4分；無著色計0分，淺黃色計1分，黃色計2分，深黃色計3分。兩者相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，9～1 2分為(+++)，(+)～(+++)均視為陽性。②蛋白質印跡法:RIPA裂解液提取總蛋白并定量。取50 μg蛋白，置入5×緩沖液(4∶1)，100 ℃水浴，5 min 3次，SDS-PAGE電泳，后轉至PVDF膜，取出膜，加5%脫脂奶粉，棄封閉液滴加特異性的一抗(Id-1為1∶1 500，MMP-9為1∶150，GAPDH為1∶150)-4 ℃孵育過夜，加TBST洗滌液，10 min 3次，滴加特異性二抗(1∶1 500)37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗滌液，10 min 3次，ECL法檢測條帶，應用Gel Pro-Analyzer3.1軟件進行密度定量分析，以Id-1/GAPDH和MMP-9/GAPDH值來作為Id-1、MMP-9蛋白的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

1.3Id-1、MMP-9 mRNA檢測方法采用RT-PCR法。提取并測定總RNA濃度，反應體系：PCR Buffer×1，dNTP 0.2 mmol/L，cDNA模板200 ng，Taq酶1.25 μL，隨機引物濃度0.4 mol/L，RNA酶抑制劑1 μL，反應總體積25 μL。根據(jù)試劑盒說明書操作進行擴增：Id-1：5′-CTGAGGCACTG-GCGAGGAGA-3′，5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′；MMP-9：5′-TGGAGTCACTGTACACCCTC-3’，5′-CGGACATCCG-CTAAACAGGT-3′；GAPDH(內參)：5′-ACC-CACTCC-TCCACCTTGA-3′，5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′。以1 μL DNA樣本作為模板，以去離子水為陰性對照模板；擴增條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃、10 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。應用Gel Pro-Analyzer3.1軟件進行密度定量分析，以Id-1/GAPDH和MMP-9/GAPDH值來作為Id-1、MMP-9 mRNA的相對表達量，實驗重復3次，取平均值。

2　結果

2.1兩組Id-1、MMP-9陽性表達率比較觀察組及對照組Id-1陽性表達率分別為72%(36/50)、24%(12/50)，MMP-9陽性表達率分別為78%(39/50)、22%(11/50)，兩組比較，P均<0.05。

2.2Id-1、MMP-9陽性表達與結直腸癌臨床病理參數(shù)的關系結果見表1。由表1可知，Id-1、MMP-9陽性表達均與結直腸癌漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移、脈管浸潤相關(P均<0.05)。

2.3兩組Id-1、MMP-9蛋白的相對表達量比較觀察組及對照組Id-1的相對表達量分別為0.82±0.04、0.31±0.02，MMP-9的相對表達量分別為0.86±0.05、0.29±0.03，兩組比較，P均<0.05。

2.4兩組Id-1、MMP-9 mRNA的相對表達量比較觀察組及對照組Id-1 mRNA的相對表達量分別為0.96±0.03、0.20±0.04，MMP-9 mRNA的相對表達量分別為0.88±0.04、0.21±0.03，兩組比較，P均<0.05。

表1　Id-1、MMP-9陽性表達與結直腸癌臨床病理參數(shù)的關系

3　討論

目前，結直腸癌的治療以手術治療為主，但早期治療效果最佳，且術后積極復查預防復發(fā)轉移是關鍵。因此，尋找有效、特異性高的生物學指標對結直腸癌的早期診斷及術后防治有極其重要的價值。

Id-1是螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族重要成員，在正常組織中呈不表達或低表達，而在惡性腫瘤及體外培養(yǎng)的腫瘤細胞系中呈高表達[9]。Id-1通過與E2A結合形成特異性復合物抑制E2A活化P21，激活CDK2誘導Rb蛋白磷酸化，而Rb蛋白的磷酸化在腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用，能抑制細胞分裂周期中G1/S停滯，促使細胞分裂周期順利進行[10]。此外，Id-1表達上調能激活Raf-1及MAPK激酶信號傳導途徑，抑制細胞凋亡，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[11]。

MMP-9能有效降解腫瘤細胞表面的基底膜和細胞外基質，使腫瘤細胞穿過破壞的基底膜向鄰近組織侵襲，促進腫瘤浸潤和轉移[12]。MMP-9還能促進血管內皮細胞自基底膜的釋放和遷移，促進微血管的形成，并為腫瘤的生長和浸潤提供必要的空間和營養(yǎng)基礎[13]。大量研究[14,15]表明，MMP-9在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)；體外侵襲實驗也證，實腫瘤細胞的高侵襲轉移能力與MMP-9的過表達密切相關。

研究[16]證實，將PD98059導入轉移的乳腺癌細胞中抑制Id-1的表達，發(fā)現(xiàn)MMP-9和MT1-MMP表達水平均隨之下降，腫瘤細胞的侵襲能力亦明顯降低。此外，在前列腺癌細胞系的研究[17]中也發(fā)現(xiàn)Id-1能調節(jié)MMP-9表達，考慮上調的Id-1通過誘導血管內皮生長因子轉錄而上調VEGF的表達，并激活MMP-9的分泌，從而促進腫瘤微血管生成和轉移。胡斌等[18]發(fā)現(xiàn)，大腸癌組織中Id-1和MMP-9的表達呈正相關，Id-1通過促進MMP-9的表達，調控大腸癌細胞的侵襲、浸潤、轉移等生物學行為，但具體機制還需進一步探討。

本研究顯示，觀察組Id-1、MMP-9陽性表達率高于對照組，且Id-1、MMP-9陽性表達與結直腸癌浸潤程度、TNM分期、肝轉移、淋巴結轉移和脈管浸潤相關。此外，RT-PCR和Western blotting檢測結果與免疫組化檢測結果基本一致。表明Id-1在結直腸癌組織中的高表達不僅與結直腸腺癌的發(fā)生進展有關，而且與腫瘤的浸潤和侵襲相關。郭云[19]對62例直腸癌組織進行免疫組化檢測，發(fā)現(xiàn)Id-1在癌組織中呈100%陽性染色，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移密切相關，且與Ki-67和VEGF亦呈正相關，考慮Id-1與Ki-67、VEGF具有協(xié)同作用。

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Expression changes of Id-1 and MMP-9 in colorectal carcinoma tissues and its clinical significance

WU Xueliang, WANG Likun, XUE Jun, YANG Dongdong, QU Ming, GUO Fei,YANG Ruimin, MA Pengcheng, LIU Bo

(The First Affiliated Hospital of Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China)

ObjectiveTo observe the expression changes of inhibitor of DNA binding-1 (Id-1) and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in the human colorectal carcinoma tissues and to discuss the clinical significance. MethodsThe expression of Id-1 and MMP-9 in 50 specimens of colorectal carcinoma tissues (observation group) and 50 specimens of normal colorectal tissues (control group) was detected by immunohistochemistry, RT-PCR and Western blotting. The correlations between their positive expression and the clinicopathological features were analyzed. ResultsThe positive rates of Id-1 in the observation group and the control group were 72% and 24%, the positive rates of MMP-9 were 78% and 22%, respectively, and there were significant differences between these two groups (all P<0.05). The positive expression of Id-1 and MMP-9 was related with the depth of tumor invasion, TNM stage, lymph node metastasis, vessel invasion and liver metastasis (all P<0.05). The relative expression of Id-1 mRNA in the observation group and the control group was 0.96±0.03 and 0.20±0.04, the relative expression of MMP-9 mRNA was 0.88±0.04 and 0.21±0.03, respectively, and there were significant differences (all P<0.05). The relative expression of Id-1 protein was 0.82±0.04 and 0.31±0.02, the relative expression of MMP-9 in the observation group and the control group was 0.86±0.05 and 0.29±0.03, respectively, and there were significant differences between these two groups (all P<0.05). ConclusionThe expression of Id-1 and MMP-9 was increased in the human colorectal carcinoma tissues, and the expression was related with tumor invasion, TNM stage, lymph node metastasis, liver metastasis and vessel invasion.

colon carcinoma; rectal carcinoma; inhibitor of DNA binding-1; matrix metalloproteinase-9

河北省衛(wèi)計委醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20150058)；河北省科技支撐計劃項目(152777237)；張家口市科技局指令性計劃(1311055D)。

武雪亮(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要研究方向為消化道惡性腫瘤的臨床診治與基礎研究。E-mail: wxlwlk@163.com

簡介：薛軍(1965-)，男，碩士生導師，主任醫(yī)師，主要研究方向為胃腸道惡性腫瘤的基礎與臨床診治。E-mail: yfyxuejun@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.009

R735.35

A

1002-266X(2016)15-0030-04

2016-01-27)