5-氮雜脫氧胞苷對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87增殖的影響及其機(jī)制探討

沈軍，邵雪非，徐宗華，江曉春，徐善水

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，安徽蕪湖 241001)

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5-氮雜脫氧胞苷對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87增殖的影響及其機(jī)制探討

沈軍，邵雪非，徐宗華，江曉春，徐善水

(皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院，安徽蕪湖 241001)

目的觀察5-氮雜脫氧胞苷對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。方法采用不同濃度(0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L)5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細(xì)胞，比較細(xì)胞增殖抑制率和Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關(guān)蛋白3 mRNA(BNIP3 mRNA)；將5 μmol/L的5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細(xì)胞0、1、2、3、4、5、6 d，比較細(xì)胞增殖抑制率及BNIP3 mRNA。將5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷作用于U87細(xì)胞4 d，并分別添加和不添加Caspase抑制劑Boc-D-FMK，測(cè)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果5-氮雜脫氧胞苷對(duì)U87細(xì)胞增殖有抑制作用，且呈劑量及時(shí)間依賴性(P均<0.05)，抑制作用最強(qiáng)的濃度為5 μmol/L，最強(qiáng)的時(shí)間點(diǎn)為4 d；Boc-D-FMK并不能抑制由BNIP3所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，P>0.05。結(jié)論5-氮雜脫氧胞苷可抑制U87細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與BNIP3 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

5-氮雜脫氧胞苷；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關(guān)蛋白3

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性程度最高的神經(jīng)上皮性腫瘤，其發(fā)生發(fā)展與抑癌基因、癌基因的改變密切相關(guān)[1]。Bcl-2腺病毒E1B19kDa相關(guān)蛋白3(BNIP3)是Bcl-2家族中BH3-only亞家族成員之一，具有BH3結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要定位于線粒體外膜，通過(guò)其跨膜結(jié)構(gòu)域與其他蛋白相互作用而發(fā)揮其功能。BNIP3屬促凋亡蛋白，其表達(dá)異常參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2,3]，表達(dá)水平主要與其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)有關(guān)，應(yīng)用甲基化抑制劑后能明顯上調(diào)BNIP3表達(dá)，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。我們前期研究[4]表明，BINP3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。本研究觀察了甲基化抑制劑5-氮雜脫氧胞苷對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87增殖的影響，并探討其可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞、藥物及試劑U87細(xì)胞購(gòu)于中科院細(xì)胞所；5-氮雜脫氧胞苷、瓊脂糖、二甲基亞砜(DMSO)、噻唑藍(lán)購(gòu)于Sigma公司，進(jìn)口胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司，Boc-D-FMK購(gòu)于上海玉搏公司，總RNA提取劑(TRIzol Reagent)購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，PCR反應(yīng)體系購(gòu)自上海Promega公司，DNA Marker，6×loading buffer購(gòu)自TaKaRa公司，BNIP3引物及內(nèi)參引物由上海生工公司設(shè)計(jì)。

1.2U87細(xì)胞培養(yǎng)U87細(xì)胞按照1×103/mL接種于25 mL培養(yǎng)瓶，5%CO2飽和濕度，37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況。細(xì)胞離心，用營(yíng)養(yǎng)液吹打均勻后分裝進(jìn)行傳代培養(yǎng)，備用。

1.35-氮雜脫氧胞苷對(duì)U87細(xì)胞增殖影響觀察采用MTT法。將1×103/mL的U87細(xì)胞懸液接種于96孔板；培養(yǎng)48 h后，分別以0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L的5-氮雜脫氧胞苷進(jìn)行干預(yù)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。3 d后每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，使用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度值(OD值)。根據(jù)結(jié)果取5-氮雜脫氧胞苷最強(qiáng)作用濃度(5 μmol/L)，分別干預(yù)0、1、2、3、4、5、6 d，終止培養(yǎng)，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀540 nm波長(zhǎng)比色。取5-氮雜脫氧胞苷最強(qiáng)作用濃度(5 μmol/L)、最佳作用時(shí)間(4 d)，分別添加和不添加Boc-D-FMK 20 μM，繼續(xù)孵育4 h，離心后吸去上清，每孔加150 μL的DMSO，振蕩混勻10 min，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度值(OD值)。細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.45-氮雜脫氧胞苷對(duì)U87細(xì)胞BNIP3 mRNA表達(dá)影響觀察實(shí)驗(yàn)采取的5-氮雜脫氧胞苷劑量及干預(yù)時(shí)間同1.3。用TRIzol抽提液提取RNA，RNA以紫外分光光度計(jì)重復(fù)測(cè)量3次濃度和純度，按樣品260～280 nm的OD值確定RNA的質(zhì)量，A260 nm/A280 nm在1.8～2.0視為總RNA純度高。逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板25 μL反應(yīng)體系；Go Taq Green Master Mix 12.5 μL，Nuclease-Free Water 8.5 μL，上下游引物各1 μL，逆轉(zhuǎn)錄cDNA模板2 μL，在冰上操作。引物設(shè)計(jì)：BNIP3：5′-GGTCAAGTCGGCCGGAAAATAT-3′，5′-CGCCTTCCAATATAGATCCCCAA -3′，198 bp；擴(kuò)增內(nèi)參照磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)：5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，5′-ATGAGCCC-AGCCTTCTCCAT-3′。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、5 min，94 ℃、30 s，61 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃、10 min。GAPDH反應(yīng)條件同前。反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取6 μL的PCR產(chǎn)物，在1.0 g/100 mL瓊脂糖凝膠90 V恒壓電泳30 min，在紫外燈照射下利用凝膠成像系統(tǒng)和捷達(dá)凝膠分析軟件4.0進(jìn)行拍照和灰度值測(cè)定，各實(shí)驗(yàn)組呈現(xiàn)出來(lái)的BNIP3基因PCR產(chǎn)物灰度值分別除以相對(duì)應(yīng)內(nèi)參GAPDH基因PCR產(chǎn)物灰度值，從而得到BNIP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制率比較0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)后，細(xì)胞增殖抑制率分別為0、1.20%±0.56%、8.62%±1.56%、15.91%±2.59%、21.43%±3.24%、19.33%±3.86%，0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷分別與0 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷比較，P均<0.05。5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)0、1、2、3、4、5、6 d，細(xì)胞增殖抑制率分別為0、7.51%±1.62%、10.04%±2.63%、15.74%±3.46%、18.26%±3.23%、17.63%±2.87%、16.42%±3.16%，1、2、3、4、5、6 d分別與0 d比較，P均<0.05。添加和不添加Boc-D-FMK的細(xì)胞增殖抑制率分別為16.38%±3.12%、15.97%±2.93%，兩者比較，P>0.05。

2.2各組細(xì)胞BNIP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較0、0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)后，BNIP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.12±0.03、0.23±0.05、0.302±0.06、0.518±0.09、0.735±.011、0.187±0.02，0.1、0.5、1.0、5、10 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷分別與0 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷比較，P均<0.05。5 μmol/L 5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)0、1、2、3、4、5、6 d，BNIP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.451±0.07、0.487±0.07、0.596±0.11、0.782±0.13、0.814±0.15、0.472±0.08、0.563±0.09，1、2、3、4、6 d分別與0 d比較，P均<0.05。

3　討論

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，腫瘤位于皮質(zhì)下，多數(shù)生長(zhǎng)于幕上大腦半球各處，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，常侵犯多個(gè)腦葉，并侵犯深部結(jié)構(gòu)，還可經(jīng)胼胝體波及對(duì)側(cè)大腦半球，發(fā)生部位以額葉最多見(jiàn)。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病程短，術(shù)后易復(fù)發(fā)，且多數(shù)在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，中位生存期僅27周[5]。近年來(lái)，隨著術(shù)后綜合治療方法的提高，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后稍有改善，但其中位生存期也只有12～15個(gè)月[6]，效果仍不理想。

BNIP3表達(dá)升高或沉默均可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，其表達(dá)水平升高可能與非小細(xì)胞型肺癌[7]、乳腺癌[8,9]、前列腺癌[10,11]、膽管癌[12]、唾液腺表性癌[13]及子宮內(nèi)膜癌[14]等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，甚至參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移[15，16]。但有研究[17～19]表明，BNIP3表達(dá)沉默亦可能參與了不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如胰腺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等，主要為消化系統(tǒng)腫瘤。之前我們研究[4]發(fā)現(xiàn)，BNIP3不論在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系還是組織標(biāo)本中，其表達(dá)均明顯升高，這與Burton等[20]的研究結(jié)果一致，而在正常的腦組織中則未檢測(cè)到其表達(dá)。Burton等[21]隨后再次研究,認(rèn)為在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，BNIP3雖然表達(dá)增加，但其主要位于細(xì)胞核內(nèi)，而且下調(diào)了DR5的表達(dá)，這都限制了其正常的促進(jìn)細(xì)胞死亡的功能。Chen等[22]則認(rèn)為在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中，Mcl-1和BNIP3同時(shí)集中存在，而低氧環(huán)境下Mcl-1則正好限制了BNIP3介導(dǎo)細(xì)胞死亡的功能。

BNIP3表達(dá)沉默主要與其啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基化狀態(tài)有關(guān)，如去除啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，則能使其表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[23～25]。Abe等[17]研究表明，在含氧量正常的12種胰腺癌細(xì)胞系中，BNIP3表達(dá)水平各不相同，有50%未檢測(cè)到BNIP3表達(dá)，但采用5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)后，可重建該基因的表達(dá)，并能在低氧情況下介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。Murai等[18]發(fā)現(xiàn)，BNIP3在結(jié)直腸癌、胃癌中表達(dá)沉默，但應(yīng)用5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)后，可使該基因表達(dá)增強(qiáng)，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。BNIP3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中并沒(méi)有表達(dá)沉默，但采用5-氮雜脫氧胞苷干預(yù)后，可使BNIP3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中表達(dá)升高，且呈時(shí)間和劑量依賴性。另外發(fā)現(xiàn)，5-氮雜脫氧胞苷能明顯抑制U87細(xì)胞增殖，雖然沒(méi)有直接檢測(cè)BNIP3啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，但結(jié)合文獻(xiàn)及試驗(yàn)結(jié)果，間接證明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，BNIP3啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)限制了其表達(dá)，去除其甲基化狀態(tài)能抑制U87細(xì)胞增殖而達(dá)到治療效果。目前，對(duì)于BNIP3引起腫瘤細(xì)胞死亡的確切機(jī)制尚不清楚，可能的機(jī)制包括細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和自體吞噬作用[26～28]，其功能的實(shí)現(xiàn)是半胱天冬酶依賴性還是非依賴性也有爭(zhēng)論，我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BNIP3在多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤中發(fā)揮其功能屬于半胱天冬酶非依賴性，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

BNIP3表達(dá)升高還可能會(huì)增加化療與放療的敏感性。Ishiguro等[19]采用5-氮雜脫氧胞苷聯(lián)合依立替康與單用依立替康分別作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)前者BNIP3表達(dá)明顯升高，且其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖效應(yīng)明顯優(yōu)于后者，提示BNIP3可能增加了腫瘤細(xì)胞對(duì)依立替康的敏感性。Wang等[29]將BNIP3轉(zhuǎn)染至人子宮頸癌細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞系凋亡率明顯增加，隨著B(niǎo)NIP3的表達(dá)升高，腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性也逐漸增強(qiáng)。此外，BNIP3可以與bax形成異二聚體共同促進(jìn)細(xì)胞凋亡[2]，同時(shí)有研究[30]表明5-氮雜脫氧胞苷也能通過(guò)其去甲基化作用調(diào)節(jié)p53-bax凋亡通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，也能通過(guò)其去甲基化作用使p14、p16、XAF1等基因表達(dá)升高[14]。結(jié)合前期研究表明，BNIP3在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中呈陽(yáng)性表達(dá)，5-氮雜脫氧胞苷能明顯上調(diào)其表達(dá)水平而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效應(yīng)，BNIP3促進(jìn)細(xì)胞凋亡機(jī)制是通過(guò)Caspase非依賴性。但BNIP3誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制以及5-氮雜脫氧胞苷對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡通路中其他相關(guān)基因的作用機(jī)制尚不清楚，需要我們進(jìn)一步深入研究。

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Effect of 5-aza-deoxycytidine on proliferation of glioblastoma U87 cells and the mechanism

SHEN Jun, SHAO Xuefei, XU Zonghua, JIANG Xiaochun, XU Shanshui

(The First Affiliated Hospital of Wannan Medical College, Wuhu 241001, China)

ObjectiveTo observe the effect of 5-aza-deoxycytidine on the proliferation of glioblastoma U87 cells and to investigate its possible mechanism.MethodsDifferent concentrations of 5-aza-deoxycytidine (5-aza-deo) (0, 0.1, 0.5, 1.0, 5, 10 μmol/L) were used to interfere in the U87 cell line. After 3 days, the inhibition rate of cell proliferation and the BCL2/adenovirus E1B19kDa protein-interacting protein 3 mRNA (BNIP3 mRNA) expression were compared. After 5 μmol/L 5-aza-deo was used to interfere in U87 cell line at variant time (0, 1, 2, 3, 4, 5 and 6 d), the inhibition rate of cell proliferation and the BNIP3 mRNA expression were examined. The inhibition rate of cell proliferation was examined after 5 μmol/L 5-aza-deo was used to treat U87 cells for 4 d with Boc-D-FMK or without Boc-D-FMK. Results5-aza-deo inhibited the U87 cell proliferation which showed a time- and dose-dependent manner (all P<0.05). The concentration with the maximum inhibition was 5 μmol/L. The time of maximum inhibition was the 4th day. Boc-D-FMK did not change the apoptosis of U87 cell induced by BNIP3 (P>0.05). Conclusion5-aza-deo can inhibit the U87 cell proliferation, and its mechanism may be related with the up-regulation of BNIP3 mRNA expression.

5-aza-deoxycytidine; glioblastoma; Bcl-2/adenovirus E1B19kDa protein-interacting protein 3

皖南醫(yī)學(xué)院中青年自然科學(xué)基金(WK2014F05)。

沈軍(1984-),男，碩士，住院醫(yī)師，主要研究方向?yàn)槟z質(zhì)瘤的基礎(chǔ)及臨床。E-mail: shenyuanziyan@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.003

R739.4

A

1002-266X(2016)15-0008-04

2015-11-20)