濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后古菌群落差異分析

于春濤，項(xiàng)　明，王　蕾，許鄭林，劉振江

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001； 2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后古菌群落差異分析

于春濤1，項(xiàng)明1，王蕾1，許鄭林1，劉振江2

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河北滄州061001； 2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

窖泥是濃香型白酒的生命線，窖泥變質(zhì)則為酒廠帶來(lái)巨大損失。采用Illumina Miseq高通量測(cè)序DNA技術(shù)對(duì)窖泥變質(zhì)前后古菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。通過(guò)構(gòu)建古菌16S rDNA基因文庫(kù)，結(jié)果表明，變質(zhì)后窖泥共擴(kuò)增出52876條序列，變質(zhì)前窖泥擴(kuò)增出11703條序列，古菌豐度有明顯提高。對(duì)序列進(jìn)行聚類、測(cè)序、分析，窖泥變質(zhì)前優(yōu)勢(shì)古菌為：甲烷短桿菌屬（35.66%）、甲烷桿菌屬（10.25%）、類芽孢桿菌屬（4.27%）、芽孢桿菌屬（3.39%）、甲烷八疊球菌屬（3.27%）等；窖泥變質(zhì)后優(yōu)勢(shì)菌為：產(chǎn)甲烷袋菌屬（38.18%）、甲烷桿菌屬（34.21%）、甲烷袋狀菌屬（6.90%）等。結(jié)果揭示了甲烷菌是窖泥變質(zhì)前后古菌的優(yōu)勢(shì)菌，為進(jìn)一步研究窖泥微生物全貌及窖泥培養(yǎng)、養(yǎng)護(hù)提供依據(jù)。

窖泥； 變質(zhì)； 古菌群落； 差異分析； 高通量測(cè)序； 白酒

窖泥是濃香型白酒生產(chǎn)的基礎(chǔ)，窖泥微生物通過(guò)復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝，產(chǎn)生具有獨(dú)特風(fēng)味和品質(zhì)的白酒，因此窖泥的好壞直接影響產(chǎn)酒的質(zhì)量。窖泥微生態(tài)中的微生物多樣性十分復(fù)雜，包括細(xì)菌、真菌及古菌，這些微生物群落會(huì)隨著生長(zhǎng)環(huán)境的變化（如溫度、濕度、pH值、C/N等）而變化［1］。較早開(kāi)展?jié)庀阈桶拙莆⑸镅芯康氖欠▏?guó)人A.Calmette的探索性實(shí)驗(yàn)——“阿米露法”［2］。目前我國(guó)學(xué)者在窖泥功能菌研究方面取得了不少可喜成績(jī)，主要以細(xì)菌為主，真菌和古菌研究較少，如鄧依［3］等通過(guò)細(xì)菌rDNA ITS-AFLP結(jié)合聚類分析技術(shù)比較了多糧發(fā)酵新老窖池間的細(xì)菌群落差異，羅惠波［4］通過(guò)PCR-SSCP技術(shù)研究窖池微生物群落等。

由于北方四季溫差大，氣候干燥，窖泥中微生物菌群演替快，再加上管理不善，致使窖泥中微生態(tài)平衡被破壞，代謝出現(xiàn)異常，導(dǎo)致窖泥出現(xiàn)板結(jié)變硬、腐敗氣味等變質(zhì)現(xiàn)象［5］，用于生產(chǎn)致使酒質(zhì)下降，給酒廠帶來(lái)了巨大損失。已有研究表明，一些古菌在濃香型白酒“產(chǎn)香”過(guò)程中起著重要作用［6］。因此弄清窖泥古菌群落的動(dòng)態(tài)變化，檢測(cè)出窖泥變質(zhì)前后的主要優(yōu)勢(shì)古菌，對(duì)人工窖泥培養(yǎng)和提高濃香型白酒質(zhì)量尤為重要。但由于古菌獨(dú)特的生長(zhǎng)方式，窖泥中大部分古菌是未培養(yǎng)的，即使得到了純培養(yǎng)，其形態(tài)和生理也可能發(fā)生了很多變化［7］，因此，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法研究窖泥古菌存在很大的局限性［8-9］。

近幾年發(fā)展起來(lái)一項(xiàng)全新的高通量DNA測(cè)序技術(shù)——Illumina Solexa合成測(cè)序，能檢測(cè)出土壤中80%以上的優(yōu)勢(shì)菌群，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)分析樣本內(nèi)菌群豐度和樣本間菌群豐度差異，已廣泛應(yīng)用于探索土壤、海洋和濕地，以及食品發(fā)酵和廢水處理反應(yīng)器等微生物區(qū)系研究，并取得了豐碩的研究成果［10-11］。目前，利用Illumina Solexa高通量DNA測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥中古菌群落結(jié)構(gòu)的研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Illumina Solexa高通量DNA測(cè)序技術(shù)，分析了濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后古菌群落差異，以期全面、系統(tǒng)認(rèn)識(shí)窖泥微生物群落組成與窖泥質(zhì)量之間的關(guān)系，為揭示窖泥微生態(tài)全貌提供幫助。

1　材料與方法

1.1樣品采集

窖泥樣品取自河北某知名酒廠釀酒車間優(yōu)質(zhì)窖泥（HQ1）和變質(zhì)窖泥（HU1）各100 g。分裝后密封冷凍保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1窖泥預(yù)處理及總DNA提?。?2］

稱取200 mg的樣品，放入滅菌的2 mL離心管中，加入1 mL70%vol乙醇，振蕩混勻，10000 r/min室溫離心3 min，棄置上層液體。加入1 xPBS溶液，振蕩混勻，10000 r/min室溫離心3 min，棄置上層液體。倒置2 mL管于吸水紙上1 min，直至沒(méi)有液體流出。將樣品管放入55℃烘箱中維持10 min，使殘留酒精完全揮發(fā)，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

DNA提取步驟按OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNAKit的試劑盒使用說(shuō)明書(shū)。

1.2.2PCR擴(kuò)增及對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳

利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。古菌引用槽式PCR擴(kuò)增3輪，第1輪使用M-340F，GU1ST-1000R引物擴(kuò)增：古1st-340F CCCTAYGGGGYGCASCAG，古1st-1000R GGCCATGCACYWCYTCTC，PCR體系按照如下進(jìn)行：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mM each）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar PCR primer F（50 μM）0.5 μL，Primer R（50 μM）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，H20 add to 50 μL。配制好的PCR體系按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃變性3 min，接下來(lái)5個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s；再接著20個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，然后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，使用第1輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3—V4通用引物，349F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAGKCGMGAAW，806R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCTAAT，PCR體系和擴(kuò)增條件均同第1輪。第3輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)DNA進(jìn)行回收。

1.2.316S rDNA擴(kuò)增片段的測(cè)序、質(zhì)控和聚類

采用Misep測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)得的基因序列經(jīng)質(zhì)量控制軟件Prinsep處理，去除barcode、兩端primer以及部分低質(zhì)量基因序列，經(jīng)質(zhì)控后的基因序列長(zhǎng)度大部分分布在400～600 bp之間，基本滿足分析需要。

對(duì)測(cè)得的基因序列采用uclust軟件進(jìn)行OUT聚類，通常域值的序列相似性定位0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能屬于屬。

水壓試驗(yàn)應(yīng)注意事項(xiàng)：試壓時(shí)管道內(nèi)不應(yīng)有氣泡，否則當(dāng)管道發(fā)生漏水時(shí)，會(huì)導(dǎo)致壓力下降現(xiàn)象，不易從壓力表上反映出來(lái)；管道升壓過(guò)程中，壓力表?yè)u擺不定，擺幅較大，讀數(shù)不穩(wěn)，且升壓又較慢時(shí)，示意管道內(nèi)氣體沒(méi)有排盡，應(yīng)重新排氣再升壓；管道內(nèi)注水后，必須讓其充分浸泡，才能保證管道試壓準(zhǔn)確；管道頂部土方回填時(shí)，宜留出接口位置，以方便檢查和修理；當(dāng)管道有壓力時(shí)，檢查管道不得用手錘敲打管壁和接口，嚴(yán)禁修理管道缺陷，遇有缺陷，應(yīng)做出標(biāo)志，卸壓后再修補(bǔ)；水壓試驗(yàn)過(guò)程中，管道危險(xiǎn)區(qū)域，例如后背、支撐、管端等嚴(yán)禁站人，確保人員安全。

1.2.4對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類，比較窖泥變質(zhì)前后菌群結(jié)構(gòu)差異

物種分類采用的軟件為RDP classifier，基于OUT聚類的結(jié)果，獲取每一個(gè)OUT聚類的代表序列，分別是長(zhǎng)度最長(zhǎng)序列（length）、豐度最大序列（abundance）和所有序列（ALL）形成3份結(jié)果，并對(duì)各類RDP分析［13-14］。本文所有的展示，均使用OUT_ALL中的數(shù)據(jù)，genus水平進(jìn)行展示，采用柱形圖及表格的形式對(duì)比窖泥變質(zhì)前后群落結(jié)構(gòu)差異。

1.2.5MEGAN分析

使用MEGAN軟件，通過(guò)交互式搜索NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以樹(shù)狀圖形式表現(xiàn)物質(zhì)豐度情況與菌落結(jié)構(gòu)，反應(yīng)窖泥變質(zhì)前后真菌的組成情況。

2　結(jié)果與分析

2.1窖泥變質(zhì)前后古菌16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜（見(jiàn)圖1）

結(jié)合圖1中的3條泳道對(duì)比可知，泳道1和泳道2有較清晰的條帶，條帶大小位于400～600 bp之間，基本能夠滿足分析需要。DNA提取時(shí)一般都通過(guò)試劑盒過(guò)柱提取，這種柱子有固定孔徑，從而決定了基因組片段的大小。

2.2窖泥變質(zhì)前后16S rDNA多樣性分析

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物去除嵌合體和靶區(qū)域序列，得到的基因序列數(shù)見(jiàn)表1。

將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU），通常域值的序列相似性定為0.97，操作分類單元被認(rèn)為屬于屬［15-16］。采用OUT VENN分析圖統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的OUT數(shù)目，直觀展示出窖泥變質(zhì)前后OUT數(shù)目的差異（圖2）。HU1有1218個(gè)OTUs，HQ1有783個(gè)OTUs，兩者共有192個(gè)OTUs。窖泥變質(zhì)后，古菌的種類和豐度有所提高。說(shuō)明窖泥變質(zhì)后的生境更適合一些古菌的生長(zhǎng)。

圖1　古菌16S rDNA電泳圖譜

表1　處理后基因序列統(tǒng)計(jì)表

圖2　窖泥變質(zhì)前后OUT數(shù)

2.3古菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)處理后序列，采用RDP classifier軟件對(duì)每條序列在genus水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類域值。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知樣品在屬分類水平的數(shù)據(jù)，樣本中菌群的reads數(shù)目，也就是菌群的豐度值（表2、表3）。

表2　HQ1古菌種類及豐度值

表3　HU1古菌種類及豐度值

由表2、表3可知，窖泥變質(zhì)前后的古菌群落結(jié)構(gòu)、豐度差異顯著，選擇優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行比較。窖泥變質(zhì)前的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬為甲烷短桿菌屬（35.66%）和甲烷桿菌屬（10.25%），窖泥變質(zhì)后產(chǎn)甲烷袋菌屬（38.18%）和產(chǎn)甲烷桿菌屬（34.21%）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。Thomton［17］認(rèn)為：在原始土壤中，部分優(yōu)勢(shì)菌種的存在都是有特定的有利于其生長(zhǎng)環(huán)境的結(jié)果，這個(gè)結(jié)論普遍被人們所接受。窖泥中古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，歸根結(jié)底是由于窖泥生境的變化導(dǎo)致。Widden［18］認(rèn)為，土壤生境的變化很復(fù)雜，其中包括生物因素和非生物因素，非生物因子如Ca2+、溫度、濕度、K+、窖泥的形成過(guò)程等，可能是少數(shù)或幾個(gè)主要真菌種出現(xiàn)的首要調(diào)節(jié)者。但有更多的證據(jù)證實(shí)生物因子有可能是主要的調(diào)節(jié)者，Gochenaur［19］研究后得出結(jié)論：窖泥中微生物種間競(jìng)爭(zhēng)，將會(huì)導(dǎo)致微生態(tài)群落發(fā)生演替，適者生存。窖泥變質(zhì)后產(chǎn)甲烷袋菌屬及產(chǎn)甲烷桿菌屬更顯示出對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。

已有研究表明［20］，古菌發(fā)酵有促進(jìn)己酸發(fā)酵進(jìn)程多產(chǎn)己酸的作用，從而增加己酸乙酯含量，提高酒質(zhì)。隨著釀造周期的延長(zhǎng)，窖泥中的古菌經(jīng)歷了一個(gè)長(zhǎng)期馴化、變化的過(guò)程，古菌的群落結(jié)構(gòu)會(huì)隨著窖泥生境的改變而發(fā)生改變。甲烷菌作為窖泥古菌域的優(yōu)勢(shì)菌，其以乙酸、H2、CO2作為營(yíng)養(yǎng)，這幾種物質(zhì)窖泥中很豐富，因此，甲烷菌群落結(jié)構(gòu)變化與營(yíng)養(yǎng)關(guān)系不大。許寶孝等［21］研究認(rèn)為，甲烷短桿菌生長(zhǎng)和產(chǎn)甲烷的最適溫度為40℃，最適pH值為7.6。窖泥在變質(zhì)后pH值小于5.5，抑制甲烷短桿菌的生長(zhǎng)，而產(chǎn)甲烷袋狀菌和產(chǎn)甲烷桿菌則表現(xiàn)出適應(yīng)這種酸性環(huán)境。

2.4窖泥變質(zhì)前后古菌分類樹(shù)

使用MEGAN軟件，通過(guò)交互式搜集NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以樹(shù)狀圖形式表現(xiàn)窖泥變質(zhì)前后古菌群落結(jié)構(gòu)（圖3、圖4）。

圖3　HQ1屬水平MEGANF豐度圖

如圖3所示，窖泥變質(zhì)前古菌群落有廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）和泉古菌門(mén)（Crenarchaeota）的各級(jí)菌屬，主要是甲烷菌。甲烷菌在自然界中分布很廣，如人類消化系統(tǒng)、水稻田、湖泊、濕地污泥等［22］。目前大多數(shù)產(chǎn)甲烷古菌依然沒(méi)有被分離，關(guān)于這些菌在窖泥中的生理、微生態(tài)之間的關(guān)系不得而知。甲烷菌在厭氧條件下合成甲烷，形成維持細(xì)胞生存所需的能量，合成甲烷的底物有3種：乙酸占60%以上、H2和CO2占30%，甲基化合物占10%，這些底物在窖泥中很豐富，因此窖泥中還有數(shù)量眾多、種類多樣的甲烷菌。

圖4　HU1屬水平MEGANF豐度圖

如圖4所示，窖泥變質(zhì)后古菌群落主要由廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）構(gòu)成，甲烷菌依然是優(yōu)勢(shì)菌屬，只是種屬間豐度發(fā)生了較大的變化。由于古菌獨(dú)特的代謝方式和極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，使得同一地域的古菌群落種屬多樣性差異較小，但由于溫度、pH值、C/N等因素的影響，種屬之間豐度差異比較顯著。窖泥變質(zhì)前后甲烷微球菌目（Methanomicrobiales）的含量分別為1.78%和45.15%，說(shuō)明甲烷微球菌目更適應(yīng)窖泥變質(zhì)后的環(huán)境。Brauer等研究表明，甲烷微球菌目的一個(gè)種屬最佳生長(zhǎng)pH值在4.5～5之間［23］，而窖泥變質(zhì)后的pH值也在這個(gè)區(qū)間，由此可以得知，pH值可能是引起甲烷菌群落結(jié)構(gòu)變化的主因。

3　討論

窖泥被許多酒廠視為具有獨(dú)特風(fēng)格和酒質(zhì)的基礎(chǔ)，對(duì)窖泥功能菌的研究有助于認(rèn)識(shí)窖泥微生物的代謝過(guò)程。窖泥變質(zhì)后，微生態(tài)群落發(fā)生變化，酒質(zhì)下降，給酒廠帶來(lái)巨大損失。古菌域的產(chǎn)甲烷菌與己酸菌互利共生，對(duì)發(fā)酵濃香型白酒具有重要的作用［24］。因此，了解窖泥變質(zhì)前后古菌群落差異，對(duì)于研究窖泥變質(zhì)有重要意義。由于傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)和顯微鏡觀察方法的局限性，對(duì)窖泥微生物區(qū)系古菌群落組成研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。采用Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)的高通量DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)窖泥變質(zhì)前后古菌群落組成、結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)方面有了更深入的了解，為研究窖泥功能古菌及窖泥變質(zhì)的古菌影響提供有利支持。

通過(guò)16S rDNA序列分析表明，窖泥變質(zhì)前后16S rDNA擴(kuò)增序列為11703條和52876條，聚類結(jié)果為783個(gè)OTUs和1218個(gè)OTUs，說(shuō)明古菌的種類和豐度在窖泥變質(zhì)后均有較大的提高。窖泥的物理環(huán)境條件對(duì)古菌群落產(chǎn)生一定的影響（如土壤質(zhì)地、pH值、C/N、光照、濕度、溫度等），它們或是單個(gè)因子或是多個(gè)因子共同起作用影響著窖泥古菌的群落組成［25］。從擴(kuò)增序列和聚類OUT數(shù)量分析，窖泥變質(zhì)后生境更適合一些古菌的生長(zhǎng)。

采用RDP classifier軟件對(duì)16S rDNA序列分析得知，窖泥變質(zhì)前優(yōu)勢(shì)菌屬甲烷短桿菌屬（35.66%）和甲烷桿菌屬（10.25%），窖泥變質(zhì)后優(yōu)勢(shì)菌屬為產(chǎn)甲烷袋菌屬（38.18%）和產(chǎn)甲烷桿菌屬（34.21%）。產(chǎn)甲烷袋菌屬和產(chǎn)甲烷桿菌屬是否在窖泥變質(zhì)過(guò)程中起到直接或間接作用，有待于認(rèn)識(shí)窖泥微生物全貌后再作綜合分析。

濃香型白酒窖泥微生物的研究有很高的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)高通量DNA測(cè)序技術(shù)可以快速直觀地得到窖泥古菌的多樣性并且獲得大量未知種類，為我們了解窖泥古菌群落組成提供技術(shù)保障。然而，要真正了解窖泥古菌群落及其生理生化特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)必須將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法結(jié)合起來(lái)。

［1］Widden P.Fungal communities in soils along an elevationgradient in northern England［J］.Mycologia，1987，79：298-309.

［2］陳憲儀.生物與中國(guó)釀造文化［J］.中國(guó)釀造，2001（3）：33-35.

［3］鄧依，唐云容，張文學(xué).16S-23S rRNAITS-AFLP指紋圖譜分析在白酒窖泥原核微生物多樣性分析中的應(yīng)用［J］.釀酒科技，2010（3）：46-48.

［4］羅惠波，甄攀，黃治國(guó).濃香型白酒窖池細(xì)菌群落［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（11）：1621-1627.

［5］吳三多，賴凳燡，溫寬和，等.北方地區(qū)窖泥退化原因及管理養(yǎng)護(hù)的研究［J］.釀酒科技，2014（9）：71-74.

［6］吳衍庸，盧世珩.利用窖泥甲烷菌與己酸菌二元發(fā)酵技術(shù)提高瀘型曲酒質(zhì)量的研究［J］.釀酒科技，2011（5）：38-41.

［7］Amann R I，Ludwig W，Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation［J］.Microbiol Rev，1995，59（1）：143-169.

［8］易彬，任道群，唐玉明，等.不同窖齡窖泥微生態(tài)變化研究［J］.釀酒科技，2011（6）：32-34.

［9］陶勇，芮俊鵬，李家寶，等.濃香型白酒窖泥中細(xì)菌和古菌的組成與多樣性［J］.化工學(xué)報(bào)，2014，65（5）：1800-1804.

［10］Lauber C L，Hamady M，Knight R，et al.Pyrosequencingbased assessment of soil pH as a predictor of soil bacterial community structure at the continental scale［J］.Appl Environ Microbio，2009，75（15）：5111-5120.

［11］曾祥勇，董雅舒，胡貝，等.不同年份窖泥細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2014（9）：71-74.

［12］黃永光，黃平，涂華彬.窖泥微生物總DNA的提取純化研究［J］.釀酒科技，2004（3）:41-42.

［13］Lee S H，Kang H J，Lee Y H，et al.Monitoring bacterial community structure and variability in time scale in full-scale anaerobic digesters［J］.Environ Monit，2012，14（7）：1893-1905.

［14］YannarellAC，Triplett E W.Geographic and environmental sources of variation in lake bacterial community composition ［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71（1）：227-239.

［15］Sun Y Z，Mao S Y，Zhu WY.Rumen chemical and bacterial changes during stepwise adaptation to a high-concentrate diet in goats［J］.Animal，2010，4（2）：210-217.

［16］Good I J.The population frequencies of species and the estimation of population parameters［J］.Biometrika，1953，40：237-264.

［17］Thomton R H.Fungi occurring in mixed oakwood and heath soil profiles［J］.Trans Brit Mycol Soc，1956，39：484--494.

［18］Gochenaur S E.Fungi of a Long Island oak-birch forest II. Population dynamics and hydrolase patterns for the soil penicillia［J］.Mycologia，1984，76：218-231.

［19］吳衍庸.論甲烷發(fā)酵在傳統(tǒng)釀制瀘型曲酒中的特殊意義［J］.釀酒科技，2000（5）：33-34.

［20］許寶孝，奚明權(quán)，金秀其.甲烷短桿菌屬HX菌株的分離和特性［J］.微生物學(xué)報(bào)，1985，25（4）：283-288.

［21］朱晨光，許政暟，宋任濤.產(chǎn)甲烷古菌［J］.生命的化學(xué)，2009，29 （1）：129-133.

［22］Brauer S L，Cadillo-Quiroz H，Yashiro E，et al.Isolation of a novel acidiphilic methanogen from an acidic peat bog［J］. Nature，2006，442：192-194.

［23］羅青春，劉超蘭.不同年份窖泥中主要產(chǎn)甲烷菌的熒光定量PCR研究［J］.釀酒科技，2013（12）：17-19.

［24］Kobayashi T，Yan F，Takahashi S，et al.Effect of starch addition on the biological conversion and microbial community in a methanol-fed UASB reactor during long-term continuous operation［J］.Bioresource technol，2011，102：7713-7719.

Analysis of the Difference in Archaea Communities in Pit Mud of Nongxiang Baijiu before and after Mud Deterioration

YU Chuntao1，XIANG Ming1，WANG Lei1，XU Zhenglin1and LIU Zhenjiang2
（1.Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei 061001；2.Nikeng Distillery Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 054000，China）

Pit mud is the lifeline of Nongxiang Baijiu and its deterioration might bring huge loss for distilleries.The structure of archaea communities in pit mud before and after mud deterioration was analyzed by Illumina Miseq high throughput sequencing DNA technology.By constructing 16S rDNA gene bank of archaea，the results showed that there were 52876 sequences amplified in pit mud after the deterioration，11703 sequences had amplified in pit mud before the deterioration，and the abundance of archaea increased evidently.The clustering，sequencing and analysis of the sequence suggested that the dominant archaea before mud deterioration included Methanobrevibacter（35.66%），Methanobacterium（10.25%），Paenibacillus（4.27%），Bacillus（3.39%），Methanosarcina（3.27%），etc；and the dominant archaea after mud deterioration included Methanofollis（38.18%），Methanobacterium（34.21%），Methanoculleus（6.90%），etc.The results revealed that methane-producing bacteria was the dominant bacteria of archaea before and after mud deterioration.This study provided scientific evidence for pit mud culture/ maintenance and further research on pit mud microbes.

pit mud；deterioration；archaea community；analysis of the difference；high throughput sequencing；Baijiu

TS262.3；TS261.4；TS261.1；Q93-3

A

1001-9286（2016）08-0060-05

10.13746/j.njkj.2016114

2016-04-06

于春濤（1979-），男，研究生，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵，E-mail：aimiao818@163.com。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.1007.003.html。