野生毛葡萄皮渣花色苷提取工藝研究

管敬喜，楊　瑩，張　勁，成　果，韋芳齊，謝林君，謝太理，文仁德

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

野生毛葡萄皮渣花色苷提取工藝研究

管敬喜，楊瑩，張勁，成果，韋芳齊，謝林君，謝太理，文仁德

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄與葡萄酒研究所，廣西南寧530007）

以野生毛葡萄發(fā)酵后的皮渣為原料，采用溶劑浸提法提取花色苷。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了毛葡萄皮渣花色苷提取的最佳條件：pH1.0，料液比為1∶30，乙醇濃度60%vol，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間60 min。獲得的毛葡萄皮花色苷粗品色價(jià)為5.96。

毛葡萄； 皮渣； 花色苷； 提取

毛葡萄（V.quinquangularis Rehd）別名為絨毛葡萄、五角葉葡萄，是我國(guó)分布最廣的野生葡萄種類之一，主要分布在長(zhǎng)江以南地區(qū)［1］。在廣西，毛葡萄較集中分布在桂中、桂北、桂西的喀斯特地貌地區(qū)，野生資源蘊(yùn)藏量十分豐富［2］。毛葡萄果實(shí)糖低、酸高、色深，單寧較高，含多種維生素，各種氨基酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，具有良好的釀造加工性狀，可以釀造優(yōu)質(zhì)的干紅葡萄酒、利口酒，也用作其他葡萄酒的調(diào)色、調(diào)酸［3-4］。

葡萄酒釀造之后的葡萄皮渣中含有大量的花色苷類物質(zhì)，其不僅色澤鮮艷，染色優(yōu)良，還具有改善肝臟、防御身體過氧化、防止動(dòng)脈硬化以及提高視力等生理功能，是一種重要的天然食用色素和理想的食品添加劑，因而受到越來越多的關(guān)注［5-6］。

本實(shí)驗(yàn)以野生毛葡萄皮渣為原料，通過單因素及正交試驗(yàn)，對(duì)毛葡萄皮渣花色苷提取工藝進(jìn)行了初步研究，以期為野生毛葡萄的綜合開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

野生毛葡萄皮渣：廣西羅城葡萄酒廠。

野生毛葡萄皮渣粉制備：將收集的野生毛葡萄皮渣在60℃烘干，粉碎，過80目篩，得到毛葡萄皮渣粉，置于-20℃下低溫保存。

1.2試劑

蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、檸檬酸、鹽酸等試劑，均為分析純。

1.3主要儀器及設(shè)備

UV-1801紫外/可見分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司），HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡醫(yī)療儀器廠），F(xiàn)A1104N萬分之一電子分析天平（上海明橋精密科學(xué)儀器有限公司），SHZ-（Ⅲ）型循環(huán)水真空泵（河南予華儀器有限責(zé)任公司），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司），ALPHA1-2 LD真空冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Martin Christ公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1毛葡萄皮花色苷的提取工藝

稱取2 g干燥的毛葡萄皮粉末，加入適量的提取溶劑，在一定條件下于水浴鍋中恒溫提取，真空抽濾，離心（3000 r/min、10 min），得到提取液，再用pH示差法進(jìn)行花色苷含量的測(cè)定。

1.4.2花色苷含量的測(cè)定［7］

采用pH示差法。取2.5 mL花色苷色素粗提液，分別用pH1.0、pH4.5的緩沖溶液定容至25 mL，平衡20 min后以緩沖液為對(duì)照，在520 nm及700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，根據(jù)以下公式計(jì)算出花色苷含量：

A=（A520-A700）pH 1.0-（A520-A700）pH 4.5；

花色苷含量（mg/g）=（A×449.29×DF×V）/（26900×m×1）。

式中：449.29是矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量（g/mol）；DF是稀釋倍數(shù)；V是提取液的體積（mL）；26900是矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)（L·mol/ cm）；m是毛葡萄皮粉末質(zhì)量（g）；1是比色皿的光路長(zhǎng)度（cm）。

1.4.3提取率的計(jì)算［8］

稱取5 g毛葡萄皮粉于錐形瓶中，用試驗(yàn)確定的最佳條件進(jìn)行提取，減壓濃縮，初步純化，然后進(jìn)行冷凍干燥，稱取干燥后的樣品，計(jì)算提取率，產(chǎn)品的提取率按下式計(jì)算：

W=花色苷粉質(zhì)量（g）/毛葡萄皮粉末質(zhì)量（g）×100%。

1.4.4花色苷粉末色價(jià)的測(cè)定［9-10］

準(zhǔn)確稱取1 g純化后的花色苷粉末，用pH3.0的檸檬酸緩沖液溶解并定容到100 mL的容量瓶中，再用緩沖溶液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，使ABS在0.2～0.8之間。用1 cm的比色皿以緩沖液做空白，在520 nm處測(cè)定吸光值。

產(chǎn)品的色價(jià)Ecm%=A×稀釋倍數(shù)。

1.4.5毛葡萄皮渣花色苷提取單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）料液比對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。在提取液乙醇濃度40%vol，提取液pH1.0，提取時(shí)間60 min，提取溫度50℃的條件下，料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（2）pH值對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。在提取液乙醇濃度40%vol，提取時(shí)間60 min，料液比1∶30，提取溫度50℃的條件下，于pH0.5、pH1.0、pH2.0、pH3.0、pH4.0下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（3）乙醇濃度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。在提取液pH1.0，提取時(shí)間60 min，料液比1∶30，提取溫度50℃的條件下，用乙醇濃度0%vol、20%vol、40%vol、60%vol、80%vol、95%vol的提取液提取毛葡萄皮中的花色苷。

（4）溫度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。在提取液乙醇濃度40%vol，提取液pH1.0，提取時(shí)間60 min，料液比1∶30的條件下，提取溫度分別為35℃、50℃、65℃、80℃下提取毛葡萄皮中的花色苷。

（5）提取時(shí)間對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。在提取液乙醇濃度40%vol，提取液pH1.0，料液比1∶30，提取溫度50℃的條件下，于提取時(shí)間30 min、60 min、90 min、120 min、150 min下提取毛葡萄皮中的花色苷。

1.4.6毛葡萄皮渣花色苷提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素為研究對(duì)象，分別設(shè)3個(gè)水平，按L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化野生毛葡萄皮花色苷的提取工藝，確定最佳提取工藝參數(shù)。正交因素水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)的因素水平

1.4.7數(shù)據(jù)處理

利用DPS7.05和Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定（圖1）

圖1　毛葡萄皮花色苷光譜圖

取少量花色苷提取溶液在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，得其吸收光譜（見圖1），結(jié)果顯示，提取液在可見光區(qū)520 nm處有最大吸收峰，因此選定520 nm作為測(cè)定毛葡萄皮花色苷的最大吸收波長(zhǎng)。

2.2毛葡萄皮花色苷提取單因素結(jié)果分析

2.2.1料液比對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響（圖2）

圖2　料液比對(duì)毛葡萄皮花色苷提取的影響

從圖2可知，隨著料液比的增大，提取液中花色苷的含量逐漸增加。料液比的增加能提高分子擴(kuò)散速率、縮短濃度平衡時(shí)間，使溶解在提取液中的花色苷增多，因而增加了提取量［11］。同時(shí)從圖2還可以看出，當(dāng)料液比大于1∶30時(shí)，花色苷含量增加的幅度相對(duì)來說不明顯，考慮到成本和經(jīng)濟(jì)性，因此選擇1∶30為提取液的最佳料液比。

2.2.2pH值對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響（圖3）

圖3　pH值對(duì)毛葡萄皮花色苷提取的影響

由圖3可知，隨著提取液pH值的逐漸上升，提取液中花色苷的含量逐漸降低，當(dāng)提取液pH0.5時(shí)，花色苷的含量最大。pH值對(duì)色素提取率的影響很大，在強(qiáng)酸性介質(zhì)中，色素的提取率較高，色澤鮮艷、純正，說明提取液中較強(qiáng)的酸性有利于毛葡萄皮渣中花色苷物質(zhì)的浸出。隨著pH值上升，花色苷結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，裂解為花色素基元及糖基兩部分，導(dǎo)致花色苷穩(wěn)定性下降；而提取劑的pH值過低可能使花色苷的糖基水解，也會(huì)導(dǎo)致花色苷的穩(wěn)定性下降而發(fā)生降解［12-13］，因此綜合考慮提取液的適宜pH1.0。

2.2.3乙醇濃度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響（圖4）

圖4　乙醇濃度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取的影響

從圖4可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果影響較為顯著，隨著乙醇濃度的增加，提取液中花色苷的含量也逐漸增加，乙醇濃度為60%vol時(shí)，花色苷含量達(dá)到最大值，但伴隨著乙醇濃度的繼續(xù)增加，花色苷的含量反而逐漸下降，這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增加，提取劑的極性發(fā)生了變化［14］，因此選擇提取液乙醇濃度控制在60%vol。

2.2.4提取溫度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響（圖5）

圖5　溫度對(duì)毛葡萄皮花色苷提取的影響

從圖5可以看出，在65℃時(shí)，隨著提取溫度的升高，提取液中花色苷的含量逐漸增加，但在80℃時(shí)，花色苷的含量下降許多。適當(dāng)升高提取溫度有助于提高提取液中毛葡萄花色苷的含量，但由于花色苷耐熱性較差，高溫易分解，因而提取溫度過高時(shí)，花色苷提取率反而降低?？紤]到升高溫度會(huì)增加能耗，使得生產(chǎn)成本提高，不利于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用［15］，因此選擇50～65℃為宜。

2.2.5提取時(shí)間對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響（圖6）

圖6　提取時(shí)間對(duì)毛葡萄皮花色苷提取的影響

從圖6可知，在120 min內(nèi)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取液中花色苷的含量逐漸增加，120 min提取液中花色苷含量達(dá)到最大值，150 min時(shí)花色苷含量反而降低，60 min、90 min、120 min與30 min、150 min在花色苷含量上相比，具有顯著的差異。隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率不斷提高，然后提取率平穩(wěn)下降。原因是色素不穩(wěn)定，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，花色苷會(huì)因氧化反應(yīng)導(dǎo)致分解而退色，生成無色的查爾酮結(jié)構(gòu)，使其含量降低［16］，因此時(shí)間范圍選擇60～120 min。

2.3毛葡萄皮渣花色苷提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及分析（表2、表3）

根據(jù)表2的計(jì)算結(jié)果可知，乙醇濃度、提取溫度、提取時(shí)間的極差分別為0.2374、0.1048、0.1905，各因素對(duì)毛葡萄皮渣中花色苷提取的影響主次順序?yàn)橐掖紳舛龋咎崛r(shí)間＞提取溫度；由試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析得出的最佳工藝條件為B2C2D1，即料液比為1∶30，提取液pH1.0，乙醇濃度60% vol，提取溫度60℃，提取時(shí)間60 min。在該提取條件下通過驗(yàn)證試驗(yàn)，提取液中花色苷含量平均為1.9044 mg/g。

2.4毛葡萄皮花色苷初步純化及其提取率計(jì)算

為了能夠進(jìn)一步獲得提取的毛葡萄皮花色苷制品，對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，然后向花色苷濃縮液中加入2倍體積的乙酸乙酯，分層后收集水相部分，以相同方法將水相部分萃取2次，得到初步純化的花色苷水溶液，再使用AB-8大孔樹脂對(duì)花色苷溶液進(jìn)行純化［17］（濕法裝柱（15 mm×400 nm），柱高30 cm，以流速1 mL/min進(jìn)樣，待達(dá)到吸附飽和時(shí)（即流出液濃度與上樣液濃度相同時(shí)），用2BV蒸餾水洗去雜質(zhì)，再用9BVpH值2.0、體積分?jǐn)?shù)為70%vol的乙醇溶液以相同流速洗脫，收集洗脫液），將上述洗脫液置于冷凍干燥機(jī)，凍干24 h，得到純化后的花色苷粉末。

表2　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果和分析

表3　驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

用該方法得到的花色苷粉產(chǎn)品提取率為5.84%～6.24%，獲得的花色苷粉制品色價(jià)為5.96（表4）。

表4　提取率結(jié)果

3　結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)探討了料液比、pH值、乙醇濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間等因素對(duì)毛葡萄皮花色苷提取效果的影響。并在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定了毛葡萄皮花色苷提取工藝的最佳條件，即pH1.0，料液比為1∶30，乙醇濃度60%vol，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間60 min。通過乙酸乙酯萃取，大孔樹脂初步純化及冷凍干燥獲得粗花色苷粉，色價(jià)為5.96。

毛葡萄屬于東亞種群，不同于歐亞種釀酒葡萄，毛葡萄果皮中含有較多的花色素雙糖苷［2-3，18］。本試驗(yàn)僅對(duì)野生毛葡萄皮花色苷提取方法進(jìn)行了研究，對(duì)其穩(wěn)定性和生理活性尚需進(jìn)一步研究。

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Extraction of Anthocyanins from Wild V.quinquangularis Rehd Skin Residues

GUAN Jingxi，YANG Ying，ZHANG Jin，CHENG Guo，WEI Fangqi，XIE Linjun，XIE Taili and WEN Rende
（Viticulture and Wine Research Institute，GuangxiAcademy ofAgricultural Sciences，Nanning，Guangxi 530007，China）

Wild V.quinquangularis Rehd skin residues after the fermentation was used as the raw materials for anthocyanin extraction by solvent extraction method.Through single factor and orthogonal experiments，the optimum extraction conditions were determined as follows: pH1.0，the ratio of raw materials and solution was 1∶30，the concentration of ethanol was 60%vol，extraction temperature was at 60℃，and extraction time was 60 min.The color value of the obtained rude anthocyanin powder was 5.96.

wild V.quinquangularis Rehd；skin residue；anthocyanin；extraction

TS261.9

A

1001-9286（2016）08-0040-04

10.13746/j.njkj.2016112

廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金項(xiàng)目（桂農(nóng)科2014JQ05）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（桂農(nóng)科2015YT85）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)（桂農(nóng)科2015YM05）。

2016-04-05

管敬喜（1981-），男，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槠咸丫漆勗旒夹g(shù)。

文仁德（1957-），男，研究員，學(xué)士，研究方向?yàn)槠咸言耘嗯c管理。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-05-26；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160526.0951.001.html。