茶與油茶花蜜糖類物質研究

徐細建　盧曉欣　梁勤　陳大福（福建農(nóng)林大學蜂學學院，福州350002）

茶與油茶花蜜糖類物質研究

徐細建盧曉欣梁勤陳大福
（福建農(nóng)林大學蜂學學院，福州350002）

采用薄層層析法、液相色譜示差折光檢測法對茶花蜜和油茶花蜜中的糖類物質進行定性定量的測定，對比分析薄層色譜圖譜，了解茶和油茶花蜜中糖類物質的組分、含量。研究結果表明：茶花蜜與油茶花蜜含有較多的寡聚糖，有蔗糖、葡萄糖、果糖、還原糖等。兩種花蜜中所含糖類物質成分相似，但油茶花蜜中含有的寡糖的含量要比茶花蜜中的多。

茶；油茶；花蜜；糖類物質；檢測

植物花蜜來源于植物體外分泌組織分泌的甜味黏稠液體，主要以多種糖類物質組成，其中含有豐富的糖類物質、揮發(fā)性油、礦物質、色素、氨基酸、生物堿等成分[1]，是蜜蜂釀造蜂蜜的原料。但蜜蜂并不可以取食所有的植物花蜜，油茶和茶屬于山茶科的冬季蜜源植物，蜜多粉足，花期長，蜜蜂取食后會導致中毒。研究油茶花蜜與茶花蜜的糖類物質的成分、含量的差異，對于分析蜜蜂采集茶花蜜、油茶花蜜導致不同程度中毒，充分利用茶、油茶蜜源植物，具有重要的現(xiàn)實意義。

不同的蜜源植物，其花蜜中含有的可溶性糖、寡糖、礦物質的成分以及含量是有區(qū)別的[2]。Heil研究表明，花蜜一般含有糖類、氨基酸、蛋白質、脂類、無機離子等，有些花蜜中還含有生物堿、萜類以及一些揮發(fā)性物質。花蜜中含有大量糖，糖類物質占干物質重量的15～75%[3]。Wykes和Percival用紙層析法對多種花蜜中糖分進行分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)花蜜中都有葡萄糖、果糖、蔗糖，少數(shù)含有寡糖[4-5]。Baker研究也發(fā)現(xiàn)花蜜中除了含有常見的糖之外，還有單糖、二糖、寡糖[6]。Bake報道花蜜中存在纖維二糖、龍膽二糖、乳糖、海藻糖等多糖物質[7]。國內(nèi)研究人員徐萬林等從花蜜中檢測出有毒性的糖苷和生物堿等，花蜜中還含有芳香類物質[8]。

茶花蜜和油茶花蜜中的寡聚糖對蜜蜂有毒性，會造成大幼蟲或已封蓋的幼蟲中毒死亡、腐爛尸體呈現(xiàn)灰白色或乳白色，并散發(fā)出酸臭味，油茶花蜜還會造成成年蜂中毒，其中對中華蜜蜂（Apis cerana cerana）毒性大于意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）[9-11]，這種中毒現(xiàn)象在干旱時更為嚴重。

康冬雪對油茶蜜化學成分的研究表明，油茶蜜中含有較高的棉籽糖和水蘇糖，并證明它們是引起蜜蜂中毒的主要成分，隨著棉籽糖濃度增加，蜜蜂的死亡率也隨之增加[12]。曾志將等人研究進一步得出油茶花蜜中還原糖、葡萄糖，蔗糖、半乳糖的含量分別為73.95%、34.46%、3.17%、2.69%，游離氨基酸中脯氨酸含量最高，礦物質中鉀含量最高[13]?？琢钊氐热送ㄟ^測定半乳糖對東方蜜蜂存活率時發(fā)現(xiàn)半乳糖對東方蜜蜂有明顯的毒害作用,進而可以推測油茶花蜜對東方蜜蜂的毒害作用至少部分是由于半乳糖寡聚糖水解產(chǎn)物引起的[14]。

本研究采用薄層層析法、液相色譜示差折光檢測法（GB/T18932.22-2003）[15]，研究茶和油茶花蜜的糖物質成分，對比二者糖成分、含量的差異，進一步分析蜜蜂花蜜中毒原因。可以推斷出影響蜜蜂中毒的物質以及中毒程度的深淺，為診斷蜜蜂花蜜中毒提供新的合理依據(jù)，為研究預防中毒措施提供思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣本

（1）茶花花蜜（新鮮）；油茶花花蜜（新鮮）

（2）茶花花蜜（儲存6個月）；油茶花花蜜（儲存6個月）

1.1.2試劑

1.1.2.1薄層色譜法試劑：0.2 m的過濾膜；乙醇∶水=3∶7；乙醇∶水=1∶1；薄層展開劑（分析純）：正丁醇∶乙酸∶水=1∶1∶1；顯色劑

1.1.2.2液相色譜法試劑：乙腈色譜純；水GB/T 6682規(guī)定的一級水

果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標準物質:純度99%

果糖、葡萄糖標準儲備溶液:準確稱取5 g果糖標準物質和4 g葡萄糖標準物質，精確至0.0001 g，放入同一容量瓶中，加入60 ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

蔗糖、麥芽糖標準儲備溶液:分別稱取蔗糖和麥芽糖標準物質各2 g，精確至0.0001 g，放入同一容量瓶中，加入60 ml水溶解，用乙腈定容至體積，搖勻。

四種糖物質的標準工作溶液待用。

1.1.3儀器

移液器

活性炭柱：Inertsep GC柱

真空泵；分析天平、薄層色譜展開槽；真空干燥箱；恒溫干燥箱

玻璃噴霧器；點吹風機；10 μl微量注射器

高效液相色譜儀:配有示差折光檢測器

分析天平:感量0.1 mg和0.001 g各一臺

有機相過濾膜:0.45 μm

樣品瓶:1.5 ml

容量瓶:10 ml 25 ml 50 ml 100 ml

1.2方法

1.2.1薄層層析法定性測定茶花蜜與油茶花蜜的成分

1.2.1.1樣品前處理：稱取茶花蜜、油茶花蜜各2.0 g，溶于20 ml水，攪拌均勻后通過0.2 m的過濾膜，收集好濾液，量取10 ml濾液加入到活性炭柱，同時打開活塞，濾液在真空泵真空抽氣作用下通過柱子，直至液面下降到柱面上端的時候及時關閉活塞，之后量取10 ml乙醇（3∶7）加入到Inertsep GC柱，打開活塞，抽氣掉流出液，之后量取10 ml乙醇（1∶1）溶液在相同條件下進行洗脫，用干燥至恒重的茄形瓶收集所有洗脫液，80℃水浴下蒸干，真空干燥箱（65℃、26kPa～33kPa）干燥30 min，取出放置于干燥器至室溫，加入300μl水溶解，作為薄層層析點樣液。

1.2.1.2薄層層析：點樣：用10微量注射器在距離薄層板下端20 cm的位置點樣，花蜜點樣20 μl，直徑一般為2～4 mm，點間距離一般為1.5～2.0 cm，點間距離根據(jù)點的擴散狀況，對檢出結果不產(chǎn)生影響。點樣時，勿損壞薄層表面。

展開：將點好的樣品的薄層板放在展開槽中，以傾斜上行方式展開，注意薄層板浸入展開劑中5～10 mm，樣品不可浸入其中，將展開劑前端達到薄層板頂端時，取出薄層板，將展開劑用電吹風吹干后，在薄層板上均勻的噴灑顯色劑，顯色劑完全蒸發(fā)后在恒溫箱（90～95℃）中烘干使其顯色，之后進行掃描進而保存圖譜。

1.2.2液相色譜法定量測定各種糖類物質含量

1.2.2.1提取:精確稱取5 g試樣，精確到0.001 g。將稱后試樣放于100 ml燒杯中，加入30 ml水，用玻璃棒不斷攪拌使試樣完全溶解，然后轉移到100 ml容量瓶中，然后再用10 ml水洗燒杯3次并轉移至上述100 ml容量瓶中，用乙腈定容至體積，混勻。將樣液用0.45μm濾膜進行過濾，將濾液倒入樣品瓶中供液相色譜測定。

1.2.2.2測定：用配制的果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖標準工作溶液繪制標準工作曲線，要求曲線縱坐標是峰高，橫坐標是工作溶液濃度。確保樣品溶液中測定糖物質的響應值全部在標準工作曲線的線性范圍內(nèi)，樣品溶液與標準工作溶液等體積進樣進行測定。

1.2.2.3液相色譜條件：

（1）色譜柱:碳水化合物分析柱10 pm，300 mm×

3.9 mm(I，d)

（2）流動相:乙腈+水(77+23)

（3）流速:1.0 ml/min

（4）柱溫：25℃

（5）檢測器池溫度：35℃

（6）進樣量：15 μl

2　結果與分析

2.1薄層層析法定性測定新鮮茶花花蜜與新鮮油茶花花蜜的成分

薄層色譜法用于定性分析花蜜中糖類物質組分。樣品為新鮮茶花蜜（1a）和油茶花蜜(1b)，通過運用薄層色譜法對兩種花蜜進行檢測，以純還原糖作為陰性對照，以多糖標樣、摻入高果糖漿的蜂蜜作為陽性對照。結果顯示（如圖1）：在泳道1上，只有一個明顯斑點，說明陰性對照中只含有單糖；在泳道2、泳道3上，與純還原糖陰性對照相比，均有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，說明陽性對照中除了含有單糖外，還包括其他少數(shù)果糖存在；在茶花蜜泳道上（泳道4），出現(xiàn)明顯的藍帶，對比泳道2、3，泳道4中拖尾現(xiàn)象較嚴重，說明茶花花蜜中存在極少數(shù)的單糖，存在很多的多糖；在油茶花蜜泳道上（泳道5），出現(xiàn)明顯的藍帶，與陰性對照圖譜比較，出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，說明花蜜中含有少量的單糖，油茶花花蜜中存在很多的二糖、三糖、四糖甚至含有四糖以上糖成分。

對比泳道4與泳道5的藍帶可知，油茶花蜜泳道上的斑點位置與茶花蜜相差不大，但其顏色要深很多，這說明兩種花蜜中糖類組分相差不大，但油茶花蜜糖類物質的含量要高于茶花蜜。

圖1　茶和油茶花蜜中糖類物質的薄層色譜圖

2.2薄層層析法定性測定儲存后的茶花蜜與油茶花蜜的成分

用儲存一段時間后(6個月)的樣品茶花蜜（2a）和油茶花蜜(2b)再次用薄層色譜法定性分析花蜜中糖類物質組分，結果如下表1所示，檢測結果成陰性，說明此時花蜜中均只含有還原性糖，異構化糖全部轉換成還原糖。

表1　儲存后茶花蜜和油茶花蜜的糖類物質組分

2.3液相色譜法定量測定各種糖類物質含量

茶花蜜和油茶花蜜在薄層色譜法定性檢測基礎的條件下，進行液相色譜定量分析，通過多次進行檢測，得出的平均結果如表2所示。茶花蜜和油茶花蜜中存在少量的寡糖，此條件下無法準確檢測出具體數(shù)值。茶花蜜中可能存在少量的葡萄糖、麥芽糖，但用此方法不能準確檢測出具體含量。茶花蜜中蔗糖的含量比果糖高，果糖占還原糖的60.6%。油茶花蜜中除了麥芽糖以外，能檢測出葡萄糖、果糖、蔗糖的含量，其中蔗糖的含量高于葡萄糖和果糖，果糖占還原糖含量的51.2%。

從茶花與油茶花蜜糖物質成分含量檢測表（表2）中可以看出，油茶花蜜糖類物質成分果糖、葡萄糖、還原糖含量高于茶花蜜，與薄層色譜法測的圖譜相一致。而且在油茶花蜜中檢測到葡萄糖含量，而茶花蜜中幾乎檢測不到。此茶花蜜中蔗糖含量超過油茶花蜜，果糖占還原糖的比重也高于油茶花蜜9.4%。

表2　茶花與油茶花蜜糖物質成分含量

3　討論

結合薄層色譜法和液相色譜法定性定量測定可知：在油茶和茶花蜜中檢測出少量的單糖，含有大量的二糖、三糖、四糖。茶花蜜中蔗糖含量高于油茶花蜜，可能是造成茶花蜜中多糖的含量較油茶花蜜中要少的原因。油茶和茶花蜜中除了含有還原糖以外，還會含有大量的二糖、三糖等鏈較長的多糖。眾多研究者通過試驗發(fā)現(xiàn)導致蜜蜂中毒的因素之一是茶和油茶花蜜中含有蜜蜂不能消化分解的多糖物質，而本實驗結果顯示油茶花蜜中含有的寡聚糖含量可能比茶花蜜更高，蜜蜂取食時造成的中毒更嚴重。當干旱時期，花蜜水分減少，糖濃度增加，相應的寡糖濃度就會增加，有可能就會造成蜜蜂嚴重中毒。茶花蜜中果糖含量占還原糖比重大，王春華研究表示果糖含量高，蜂蜜不容易結晶[16]張金振[17]表示影響蜂蜜結晶的因素是果糖和葡萄糖含量，果糖含量相對高于葡萄糖，則不易結晶。由實驗結果可知，茶花蜜中果糖含量相對葡萄糖較高，茶花蜜更不容易結晶，相比容易結晶的油茶花蜜，有可能造成蜜蜂取食后不能消化，從而導致蜜蜂中毒。但是否有這方面的原因，還需要進一步的研究。

當放置一段時間后，再次測得茶花蜜和油茶花蜜中不再含有異構化糖。劉秋意在研究中也表明蜂蜜在儲存過程中蔗糖含量是在降低的[18]，推斷出在儲存過程中花蜜中可能含有某種酶，使二糖、二糖以上的糖類水解至單糖，由此將蜜蜂采集后的茶花蜜或油茶花蜜放置一段時間后再飼喂蜜蜂，也有可能就不會造成蜜蜂中毒，為以后研究解決蜜蜂花蜜中毒提供新的思路。

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Study on the Saccharides in Nectar Derived from Plants Camellia Sinensis and Camellia Oleifera

Xu XijianLu XiaoxinChen Dafu
（1 College of Bee Science of Fujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

The saccharides in Camellia sinensis and Camellia oleifera nectars are qualitatively and quantitatively determined by Thin Layer Chromatography(TLC)and High Performance Liquid Chromatography differential Refractive Index Detection(HPLC-RID).By a comparative analysis of TLC chromatogram,the composition and content of carbohydrate were known.The results showed that:Camellia sinensis and Camellia oleifera nectars had some oligosaccharide, such as sucrose,glucose,fructose,reducing sugar,etc.Both of them had a similar sport on the chromatogram,So two nectars contain similar carbohydrate,but the content of carbohydrate in the nectar of Camellia sinensis was more than that in the nectar of Camellia oleifera.

Camellia sinensis，Camellia oleifera，nectar，Saccharide，Detection

福建省自然科學基金（2013J01070）資助

徐細建（1987年-），男，碩士，主要從事蜜蜂保護學研究，E-mail：xxjlhj2006@163.corn。．

陳大福（1973年-），男，博士，副教授，碩導，主要從事蜜蜂保護學研究，E-mail：dfchen826@163.com。