紫菜納豆菌發(fā)酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黃鶯鶯, 董煥煥, 楊苗苗, 矯麗萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西

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紫菜納豆菌發(fā)酵物中醇提物和多糖生物活性的初步研究

黃鶯鶯, 董煥煥, 楊苗苗, 矯麗萍, 邵 霜, 岳 琪, 魏玉西

(青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 青島 266071)

納豆菌()發(fā)酵后的條斑紫菜經(jīng)稀釋、離心后上清液用一定濃度的乙醇處理獲得醇沉物和醇溶液。將醇沉物去蛋白得到粗多糖, 進(jìn)行抗氧化活性的研究; 將醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏, 將浸膏按極性大小分相萃取分別得到石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相浸膏, 探討分相浸膏對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、四聯(lián)微球菌的抑菌效果。通過測(cè)定多糖和分相浸膏對(duì)羥自由基(·OH)和DPPH自由基的清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化能力。結(jié)果表明: 醇溶物對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用, 且隨著濃度的升高各相浸膏對(duì)羥基自由基的清除率隨之升高, 其中, 正丁醇相浸膏在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到91.6%, 說明條斑紫菜經(jīng)納豆菌發(fā)酵可能產(chǎn)生了活性化合物; 與對(duì)照組相比, 利用納豆菌發(fā)酵紫菜發(fā)酵物中多糖提取率增加了0.24%, 發(fā)酵得到的多糖在質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基的清除率達(dá)到了95.7%。

條斑紫菜(); 納豆菌(); 多糖; 醇提物; 抗氧化性; 抑菌活性

納豆菌, 別名納豆芽孢桿菌(), 是一種革蘭氏陽(yáng)性菌。既具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力, 又能產(chǎn)生多種抗菌素和酶, 而且納豆菌分泌酶的能力比其他枯草芽孢桿菌高幾十倍[1-2]。納豆激酶是在納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶, 具有溶解血栓、降低血黏度、改善血液循環(huán)、軟化和增加血管彈性等作用[3-4]。納豆菌發(fā)酵技術(shù)于2000多年前起源于我國(guó), 目前在日本納豆作為一種傳統(tǒng)發(fā)酵食品, 一直是日本國(guó)民膳食結(jié)構(gòu)的主要組成部分[5]。納豆菌發(fā)酵原料除大豆外, 還被用來(lái)與乳酸菌共同發(fā)酵制備酸奶, 以果渣為底物發(fā)酵剩余豆渣等[6], 發(fā)酵高檔水產(chǎn)品加工廢棄物和低值水產(chǎn)品, 并帶來(lái)較好的經(jīng)濟(jì)效益[7-8]。

紫菜屬海洋紅藻, 其中含豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、各種維生素和礦物質(zhì)。同時(shí)紫菜還可以入藥, 具有化痰軟堅(jiān)、清熱利水、補(bǔ)腎養(yǎng)心之功效[9]。紫菜在我國(guó)各地人工養(yǎng)殖產(chǎn)量大, 資源相當(dāng)豐富, 其應(yīng)用前景廣闊。

國(guó)內(nèi)已有學(xué)者研究以納豆菌發(fā)酵紫菜, 再添加木瓜蛋白酶酶解的方法從中提取紫菜蛋白多肽以及研究該法對(duì)蛋白提取率的影響[10]。但是, 關(guān)于納豆菌發(fā)酵物中多糖和醇溶物的生物活性均未見報(bào)道。本文利用納豆菌對(duì)條斑紫菜進(jìn)行發(fā)酵, 以未發(fā)酵的條斑紫菜作對(duì)照, 研究條斑紫菜納豆菌發(fā)酵物中多糖和醇溶物的抗氧化和抑菌活性, 預(yù)期研究結(jié)果對(duì)充分利用紫菜資源提供重要基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

條斑紫菜(干), 2014年12月購(gòu)自江蘇連云港和潤(rùn)紫菜加工有限公司。

1.1.2 菌株

納豆芽孢桿菌()菌粉購(gòu)自中山市納豆微生物制品有限公司; 枯草芽孢桿菌()、金黃色葡萄球菌()、四聯(lián)微球菌), 由青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要儀器與設(shè)備

DXF-10A型多功能搖擺式粉碎機(jī)(廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司); YXQ-LS-50SII立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠); CR21G高速冷凍離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器有限公司); RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠); SW-OJ-IFD潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司); 721G可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司); 冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 醇提物和多糖的制備

參考文獻(xiàn)[11]并作適當(dāng)改進(jìn)。選取條斑紫菜(干)于40℃恒溫干燥箱中干燥12?h, 研磨成粉末后稱取兩份等量的紫菜粉末, 一份為實(shí)驗(yàn)組, 另一份為對(duì)照組, 均按照料液比為1︰16加入蒸餾水, 攪拌均勻后放入高壓濕熱滅菌鍋中滅菌20?min。實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵條件為: 溫度43℃, 發(fā)酵時(shí)間24?h, 接種量為每3?g條斑紫菜樣品加0.01?g納豆菌。對(duì)照組除不加納豆菌外, 其余條件均與實(shí)驗(yàn)組相同。發(fā)酵結(jié)束, 兩組同時(shí)按照料液比1︰40加蒸餾水, 常溫水提5?h, 冷凍離心(8?000?r/min)10?min。上清液加入95%乙醇并調(diào)至終濃度為80%, 于4℃的冰箱中靜置過夜后再次離心, 收集醇不溶物。上清液即為醇提物, 經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后依次用等體積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取12?h, 相同溶劑萃取兩次。合并萃取液經(jīng)旋蒸得石油醚相浸膏(實(shí)驗(yàn)組A, 對(duì)照組A)、乙酸乙酯相浸膏(實(shí)驗(yàn)組B, 對(duì)照組B′)和正丁醇相浸膏(實(shí)驗(yàn)組C, 對(duì)照組C′)。第一次醇沉得到的醇不溶物冷凍干燥后研磨, 按照水料比30︰1 (/)加水于80℃恒溫水浴鍋中放置1?h, 取出后冷卻至室溫, 離心(8?000?r/min) 20?min, 沉淀即為雜蛋白(棄去), 上清液加95%乙醇至體積分?jǐn)?shù)為80%, 在4℃冰箱中靜置過夜, 離心(5?000?r/min) 10?min, 取沉淀物冷凍干燥即得粗多糖。

1.3.2 多糖含量的分析方法

總糖含量測(cè)定: 選用苯酚—硫酸法, 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物, 在490?nm處測(cè)定多糖含量[12]。

紫菜多糖提取率(%)=紫菜多糖提取量/紫菜原料質(zhì)量×100 %

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的分析方法

蛋白質(zhì)的測(cè)定: 選用考馬斯亮藍(lán)比色法。

1.3.4 醇提物對(duì)三種菌的抑制作用

參考文獻(xiàn)[13-15]并作適當(dāng)改進(jìn)。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的各相浸膏均用二甲基亞砜作溶劑溶解, 分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏樣品配制20?g/L的溶液, 對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、四聯(lián)微球菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。用生理鹽水分別配制菌懸液。待培養(yǎng)皿濕熱滅菌冷卻后加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL, 搖勻, 置水平位置待其凝固。將三種菌分別接入培養(yǎng)皿中, 用打孔器在培養(yǎng)基中等距離打7個(gè)孔, 向每個(gè)孔中加20?μL樣品溶液, 分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組不同相的6種溶液, 同時(shí)以二甲基亞砜作為空白對(duì)照。每種細(xì)菌設(shè)3個(gè)平行樣, 于37℃恒溫培養(yǎng)16~24 h后, 測(cè)量抑菌圈直徑, 找出抑菌效果最好的細(xì)菌作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的指示菌。

分別取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相浸膏樣品, 采用二倍稀釋法配制濃度為20, 10和5 g/L溶液。采用稀釋涂布平板法接種指示菌, 在每個(gè)培養(yǎng)皿上均勻地打7個(gè)孔, 每個(gè)孔中加樣20?μL, 以二甲基亞砜作為空白對(duì)照。于37℃恒溫培養(yǎng)16~24 h后, 測(cè)量、記錄結(jié)果。每個(gè)濃度梯度做3次平行實(shí)驗(yàn)[16], 結(jié)果取平均值。

1.3.5 醇提物和多糖抗氧化活性的研究

1.3.5.1 對(duì)羥自由基的清除率

參考文獻(xiàn)[17]方法進(jìn)行。多糖和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的各相浸膏均用去離子水溶解, 在Fenton體系下, 進(jìn)行清除羥基自由基作用的研究。取標(biāo)記好空白管、對(duì)照管以及不同濃度的樣品管, 先分別向試管中加入0.15?mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液0.5?mL, 6?mmol/L的EDTA二鈉亞鐵溶液0.5?mL, 520 μg/mL的番紅溶液0.1?mL, 再分別向不同濃度的樣品管中加入3.5?mL樣品的去離子水溶液, 最后再加入0.3%(/)的H2O20.4?mL?？瞻坠軐悠啡芤河玫润w積去離子水代替, 對(duì)照管將樣品溶液和H2O2溶液用等體積去離子水代替?；靹蚝蠓胖糜?0℃恒溫水浴中保溫30?min, 然后在520?nm處測(cè)其吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)操作3次, 取三次結(jié)果的平均值。實(shí)驗(yàn)中將Vc作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)。

清除率的計(jì)算公式: 清除率(%)=(樣品–空白)/ (對(duì)照–空白)×100%

式中:樣品為樣品管吸光度;空白為空白管吸光度;對(duì)照為對(duì)照管吸光度。

1.3.5.2 對(duì)DPPH自由基的清除率

參照文獻(xiàn)[18]方法進(jìn)行。多糖和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的各相浸膏均用去離子水溶解, 分別向試管中加入不同濃度的樣品溶液2.0?mL, 然后分別加入0.2?mmol/L的DPPH溶液2.0?mL, 混勻后靜置30?min, 測(cè)定反應(yīng)液在517?nm處的吸光度i; 以無(wú)水乙醇作參比, 測(cè)定2.0?mL DPPH溶液與2.0?mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度0; 測(cè)定2.0?mL的樣品溶液與2.0?mL無(wú)水乙醇混合后的吸光度j。實(shí)驗(yàn)以Vc作為對(duì)照。

清除率的計(jì)算公式: 清除率(%)=[1–(i–j)/0]×100%

式中:i-樣品管吸光度;j-空白管吸光度;0-背景吸收。

1.3.5.3 對(duì)超氧陰離子的清除率

參照文獻(xiàn)[19]方法進(jìn)行。用去離子水將紫菜多糖溶解, 采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)其對(duì)超氧陰離子清除率。取4.5?mL Tris-HCl緩沖溶液(50?mmol/L, pH8.2)于25?mL試管中, 加入4.2?mL重蒸水混勻, 再放入37℃水浴中保溫, 20?min后取出并立即加入在37℃預(yù)熱過的0.5?mL 3?mmol/L鄰苯三酚溶液(以10?mmol/L HCl配制), 空白管用0.5?mL 10?mmol/L HCl代替鄰苯三酚的HCl溶液, 迅速搖勻, 倒入比色皿, 于325?nm波長(zhǎng)處每隔30?s測(cè)定吸光度(a)及空白管吸光度(b)。實(shí)驗(yàn)組先加入2?mL各質(zhì)量濃度的紫菜多糖溶液, 再加入鄰苯三酚溶液, 重蒸水相應(yīng)減少, 再根據(jù)鄰苯三酚自氧化測(cè)定的方法操作, 測(cè)各樣品吸光度(i)。以10?mmol/L HCl溶液配制空白管作為空白, 測(cè)定其本底吸光度(j), 每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值。以Vc做陽(yáng)性對(duì)照。

清除率的計(jì)算公式: 清除率(%)=[(a–b)–(i–j)]/(a–b)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組提取物旋蒸后各相浸膏的質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均稱取150?g紫菜粉末, 經(jīng)浸提、醇沉、分相萃取、旋蒸后, 最終得到各相浸膏的質(zhì)量如表1所示。實(shí)驗(yàn)組最終得到的各相浸膏質(zhì)量均高于對(duì)照組, 推測(cè)紫菜經(jīng)納豆菌發(fā)酵后其乙醇可溶性物質(zhì)組成及含量發(fā)生了變化。