慢性鼻-鼻竇炎患者潘蛋白和黏蛋白5AC的表達(dá)特點(diǎn)

楊紅麗　閆娟　薛媛　安麗　馮蓉

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·論著·

慢性鼻-鼻竇炎患者潘蛋白和黏蛋白5AC的表達(dá)特點(diǎn)

楊紅麗閆娟薛媛安麗馮蓉

目的探討潘蛋白(Pendrin)和黏蛋白5AC(MUC5AC)在慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜中的表達(dá)特點(diǎn)。方法選取40例慢性鼻-鼻竇炎患者作為觀察組，另選取同期進(jìn)行健康體檢的40例正常人作為對(duì)照組，采集2組的鼻竇黏膜組織，檢測(cè)MUC5AC、Pendrin表達(dá)水平。結(jié)果觀察組患者的黏液蛋白、Pendrin、MUC5AC陽性表達(dá)率、表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Pendrin與MUC5AC存在顯著正相關(guān)(r=0.598，P<0.05)。結(jié)論慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜中的MUC5AC、Pendrin均呈高表達(dá)，且Pendrin可促使MUC5AC表達(dá)升高，誘導(dǎo)黏液分泌。

黏蛋白5AC；潘蛋白；鼻-鼻竇炎慢性；鼻竇黏膜

目前，醫(yī)學(xué)界對(duì)慢性鼻-鼻竇炎發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚不完全。近期有研究顯示Pendrin(潘蛋白)在氣道疾病的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，Pendrin的過度表達(dá)可增強(qiáng)氣道高反應(yīng)性，增加黏液滲出，促使MUC5AC(黏蛋白5AC)水平升高[1]。但是關(guān)于Pendrin、MUC5AC在CRS發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較為鮮見，本次研究旨在明確Pendrin、MUC5AC在慢性鼻-鼻竇炎鼻竇黏膜中的表達(dá)特點(diǎn)，報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院2014年10月至2015年9月接診的40例慢性鼻-鼻竇炎患者為觀察組。觀察組：男18例，女22例;年齡14～51歲，平均年齡(35.2±4.8)歲；伴息肉16例，不伴息肉24例。本組患者均明確診斷為慢性鼻-鼻竇炎，無支氣管哮喘、過敏性鼻炎等變態(tài)反應(yīng)性病史，近1個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用過類固醇激素藥物。另選取同期在我院進(jìn)行健康體檢的40例正常人作為對(duì)照組，男21例，女19例;年齡17～55歲，平均年齡(37.9±3.8)歲。2組性別比、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集與處理:采集2組研究對(duì)象上頜竇竇口黏膜標(biāo)本，獲取標(biāo)本后，每例研究對(duì)象的標(biāo)本均等分為3份，其中2份保存在-80℃的冰箱中待檢，另1份使用多聚甲醛溶液(4%)進(jìn)行固定后，保存在4℃的冰箱中待檢。

1.2.2儀器與試劑:儀器：包埋機(jī)、攤烤片機(jī)、脫水機(jī)均由湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司提供；切片機(jī)由Leica公司提供；OLYMPUS FSX100型光學(xué)顯微鏡；干燥箱由上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司提供；微量移液器、PL602-S 電子天平、離心機(jī)、水浴鍋、電泳儀、酶標(biāo)儀等。試劑：山羊抗人Pendrin抗體；兔抗人MUC5AC抗體；DAB顯色劑；Mayer蘇木素；鹽酸乙醇；高碘酸等。

1.2.3檢測(cè)方法:①HE染色：梯度乙醇脫水、蠟塊包埋，自然冷卻后使用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片(厚度4 μm)，脫蠟、水化，Mayer蘇木精染色8 min，洗片，鹽酸浸3 s，清洗4次，碳酸呂浸2 s，沖洗15 min，伊紅染色1 min。乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化。②PAS染色：梯度乙醇脫水、蠟塊包埋，自然冷卻后使用切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片(厚度4 μm)，脫蠟、水化。PAS染色后脫水、封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的糖原染色反應(yīng)。③免疫組化染色：梯度乙醇脫水、蠟塊包埋、切片、脫蠟、水化后，進(jìn)行組織化學(xué)染色，然后脫水、封固。最后在光學(xué)顯微鏡下觀察組織的免疫反應(yīng)情況。④實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：提取標(biāo)本中的總RNA，測(cè)定RNA純度、濃度。檢索人類編碼MUC5AC、Pendrin基因的mRNA序列，利用軟件設(shè)計(jì)MUC5AC、Pendrin基因的mRNA引物，RNA逆轉(zhuǎn)錄，熒光定量PCR擴(kuò)增，最后根據(jù)各目的基因擴(kuò)增的Ct閾值，計(jì)算出MUC5AC和Pendrin基因mRNA的表達(dá)量。

1.3染色結(jié)果判斷選取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算染色強(qiáng)度及免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞占比，最終的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞占比取5個(gè)高倍鏡視野下的平均值。根據(jù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞占比的不同，計(jì)0分(不足5%)，1分(5～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4份(>75%)。根據(jù)著色強(qiáng)度的不同計(jì)0分(輕度著色)，1分(輕度著色)，2分(中度著色)，3分(強(qiáng)度著色)。根據(jù)免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞占比評(píng)分與著色強(qiáng)度評(píng)分之和進(jìn)行最終結(jié)果判定：評(píng)分≤2分判定為陰性(-)，評(píng)分3分判定為弱陽性(+)，評(píng)分4～5分判定為中等強(qiáng)度陽性(++)，評(píng)分6～7分判定為強(qiáng)陽性(+++)。陽性=弱陽性+中等強(qiáng)度陽性+強(qiáng)陽性。

2　結(jié)果

2.1HE染色結(jié)果光學(xué)顯微鏡下，可見對(duì)照組的鼻竇黏膜細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，黏膜細(xì)胞以假復(fù)層纖毛柱狀上皮居多，纖毛的長(zhǎng)短、粗細(xì)均勻，排列整齊。觀察組可見黏膜水腫或增厚，杯狀細(xì)胞化生、增生明顯，上皮纖毛不完整或鱗狀上皮化生，腺體增生或水腫，炎性細(xì)胞較多。見圖1、2。

圖1　正常鼻竇黏膜(HE×400)

圖2　慢性鼻-鼻竇炎鼻竇黏膜(HE×400)

2.22組黏液蛋白陽性表達(dá)情況經(jīng)PAS染色，觀察組標(biāo)本中的黏液蛋白在腺體細(xì)胞和上皮杯狀細(xì)胞有明顯的紫紅色著色，對(duì)照組著色較淺或無著色。觀察組患者黏液蛋白陽性表達(dá)率為82.5%，對(duì)照組為20.0%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見表1。

表1　黏液蛋白陽性表達(dá)情況　n=40，例

2.32組Pendrin陽性表達(dá)情況免疫組化染色顯示，觀察組的Pendrin主要由上皮細(xì)胞頂膜表達(dá)，腺體表達(dá)次之，呈明顯的黃棕色著色，對(duì)照組著色較淺或無著色。觀察組患者的Pendrin陽性表達(dá)率為72.5%，顯著高于對(duì)照組的10.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　Pendrin陽性表達(dá)情況　n=40，例

2.42組MUC5AC陽性表達(dá)情況免疫組化染色顯示，MUC5AC主要由假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞表達(dá)，腺體細(xì)胞可有少量表達(dá)，觀察組呈明顯的棕黃色著色，對(duì)照組無著色或呈淺著色。觀察組MUC5AC陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3　2組MUC5AC陽性表達(dá)情況　n=40，例

2.52組Pendrin、MUC5AC表達(dá)水平比較實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示觀察組的Pendrin、MUC5AC表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

組別PendrinMUC5AC對(duì)照組1.002±0.1581.003±0.087觀察組1.692±0.1161.792±0.726t值22.2646.825P值<0.05<0.05

2.6Pendrin與MUC5AC的相關(guān)性分析應(yīng)用Pearson法對(duì)Pendrin和MUC5AC表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，二者存在顯著正相關(guān)(r=0.598，P<0.05)。

3　討論

慢性鼻-鼻竇炎是臨床較為常見的一種耳鼻喉疾病，本病可在任何年齡人群中發(fā)病，并且年齡越大發(fā)病率越高，有調(diào)查顯示成人中約有4.2%會(huì)發(fā)生慢性鼻-鼻竇炎。慢性鼻-鼻竇炎的臨床表現(xiàn)主要為膿涕、鼻塞等，治療效果不佳者還常會(huì)發(fā)展為伴息肉型慢性鼻-鼻竇炎，隨著息肉的生長(zhǎng)，進(jìn)一步使癥狀加劇，給患者的日常生活造成諸多不便，影響患者的生活質(zhì)量[2,3]。

慢性鼻-鼻竇炎的一個(gè)重要病理特征就是鼻腔鼻竇黏膜持續(xù)的炎性反應(yīng)，具體表現(xiàn)為黏液分泌增加、分泌細(xì)胞增生。雖然目前醫(yī)學(xué)界對(duì)慢性鼻-鼻竇炎的病理機(jī)制尚無完全確切的解釋，但大多數(shù)學(xué)者都認(rèn)為具有黏液生成功能的腺體細(xì)胞、杯狀細(xì)胞增生、化生激發(fā)了黏蛋白基因表達(dá)是慢性鼻-鼻竇炎發(fā)生的一個(gè)重要病理機(jī)制[4-6]。本研究中通過對(duì)鼻竇黏膜組織進(jìn)行HE染色發(fā)現(xiàn)，慢性鼻-鼻竇炎患者的黏膜水腫或增厚，杯狀細(xì)胞化生、增生明顯，上皮纖毛不完整或鱗狀上皮化生，腺體增生或水腫，炎性細(xì)胞較多。這一結(jié)果也印證了上述觀點(diǎn)。MUC5AC是主要由呼吸道表面上皮的杯狀細(xì)胞表達(dá)，同時(shí)MUC5AC也是氣道黏液的一個(gè)重要組成成分[7]。本研究結(jié)果顯示，MUC5AC主要由假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞表達(dá)，腺體細(xì)胞可有少量表達(dá)。觀察組MUC5AC陽性表達(dá)率和表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。這提示在慢性鼻-鼻竇炎患者的鼻竇黏膜中，腺體細(xì)胞和杯狀細(xì)胞的增生、化生導(dǎo)致了MUC5AC表達(dá)水平的升高，從而促使黏液分泌增多[8-10]。

Pendrin是一種轉(zhuǎn)運(yùn)陰離子的蛋白，近期有研究證實(shí)Pendrin是碘/氯轉(zhuǎn)運(yùn)子，主要作用為轉(zhuǎn)運(yùn)氯化物、碘化物、碳酸氫鹽等陰離子，其是PDS基因的表達(dá)產(chǎn)物[11]。有研究顯示，Pendrin可在氣道疾病中表達(dá)，如哮喘、變應(yīng)性鼻炎、慢性鼻-鼻竇炎等[12]。本次研究結(jié)果顯示，Pendrin主要由上皮細(xì)胞頂膜表達(dá)，腺體表達(dá)次之。觀察組患者的Pendrin陽性表達(dá)率和表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這表明Pendrin表達(dá)在慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜中的表達(dá)水平異常升高。

有研究顯示，在粘液生成過程中，Pendrin蛋白發(fā)揮著重要作用[13]。粘液分泌過多是慢性阻塞性肺疾病及支氣管哮喘的一個(gè)典型特征，所以推測(cè)Pendrin蛋白表達(dá)與這些呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系。文獻(xiàn)顯示，慢阻肺和支氣管哮喘患者氣道上皮細(xì)胞的中的Pendrin蛋白表達(dá)水平明顯升高，并且Pendrin蛋白表達(dá)的上調(diào)與黏液生成過多有著密切聯(lián)系[14]。既往關(guān)于Pendrin蛋白與粘液生成相關(guān)性的研究多為下呼吸道疾病，較少有人針對(duì)上呼吸道疾病進(jìn)行研究。本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示Pendrin與MUC5AC存在顯著正相關(guān)關(guān)系。這提示Pendrin表達(dá)升高可能促使MUC5AC表達(dá)增加，誘導(dǎo)黏液生成增多[15]。

綜上所述，慢性鼻-鼻竇炎患者鼻竇黏膜中的MUC5AC、Pendrin均呈高表達(dá)，且Pendrin可促使MUC5AC表達(dá)升高，誘導(dǎo)黏液分泌，其在慢性鼻-鼻竇炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著潛在的重要作用。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2016.17.023

716000陜西省延安市人民醫(yī)院耳鼻喉科

R 765.41

A

1002-7386(2016)17-2639-03

2016-03-10)