外源性雌激素對人牙周膜干細(xì)胞骨分化能力影響的實驗研究

潘峰　丁寅　李寶勇

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·論著·

外源性雌激素對人牙周膜干細(xì)胞骨分化能力影響的實驗研究

潘峰丁寅李寶勇

目的檢測外源性雌激素對人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)骨分化能力的影響。方法將體外培養(yǎng)的PDLSCs加入無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液和不同濃度的17β-E2[分為E10-7、E10-8、E10-9組和對照組(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+無水乙醇(0.01%)]-雌二醇[分為E10-7、E10-8、E10-9組、ICI組(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+ICI182780)、E10-7+ICI組(成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+1×10-717β-E2+1×10-7ICI182780)]，觀察各組細(xì)胞形態(tài)、測定其增值水平、堿性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型膠原合成能力。結(jié)果添加外源性雌激素后，細(xì)胞增殖加快，生長密集，呈螺旋狀排列。PDLSCs的增殖發(fā)生變化，與對照組相比，第3、5天雌激素干擾組細(xì)胞增殖受到抑制(P<0.05)，此后雌激素干擾組細(xì)胞增殖高于對照組(P<0.05)，在不同藥物濃度組間，E10-7組對細(xì)胞增殖影響最為明顯，其細(xì)胞增殖水平高于E10-8、E10-9組(P<0.05)。ALP表達(dá)顯示動態(tài)變化，自第3天開始，各組ALP表達(dá)均升高，而雌激素干擾組ALP表達(dá)量高于對照組(P<0.05)，在不同藥物濃度組間E10-7組ALP表達(dá)增加高于E10-8、E10-9組(P<0.05)，與ICI組、E10-7+ICI組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05); PDLSCsⅠ型膠原合成表達(dá)與對照組相比有增加趨勢，且與藥物濃度有劑量依賴關(guān)系。結(jié)論雌激素對PDLSCs成骨分化過程有促進(jìn)作用，該作用與雌激素濃度密切相關(guān)。

干細(xì)胞；人牙周膜干細(xì)胞；雌激素；成骨分化

近年來，作為研究熱點的干細(xì)胞，為牙周疾病的治療提供了新思路?，F(xiàn)已有研究證實人牙周膜內(nèi)存在干細(xì)胞[1]，具備多向分化及增殖潛能，在牙周疾病及骨質(zhì)疏松的患者牙周組織改建中承擔(dān)重要角色。而牙周疾病及骨質(zhì)疏松的發(fā)生與體內(nèi)雌激素水平低下密切相關(guān)[2-5]，牙周膜干細(xì)胞(periodotal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周改建和修復(fù)中主要的細(xì)胞類型，發(fā)揮重要作用，其在體內(nèi)增殖及成骨分化時會受到雌激素怎樣的影響，日益受到臨床關(guān)注。本研究通過觀察PDLSCs成骨分化過程中，雌激素對其增殖和堿性磷酸酶活性的影響，從而明確雌激素對牙周改建及再生產(chǎn)生影響的生理作用機(jī)制，為牙周病的臨床治療提供一定的實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1儀器與材料膠原酶，胰蛋白酶，Dispase酶，1%PBS，基質(zhì)蛋白-l單克隆抗體(STRO-1，R&D，美國)，α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)，地塞米松、維生素C(Sigma，美國)，β-甘油磷酸鈉、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程有限公司，中國),羊抗小鼠磁珠試劑盒(Dynalbiotech，美國)， 70 μm細(xì)胞篩網(wǎng)(Falcon，美國)，YJ-875型超靜工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠，中國)，CO2孵箱(Heraeus，德國)，倒置相差顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus，日本)。17β雌二醇(17β-E2)，MTT，ICI182780(Sigma，美國)，無酚紅α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO，美國)，羥脯氨酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)，DMSO(AMRESCO，美國)，活性炭及葡聚糖處理過的胎牛血清(杭州四季青公司)，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒(北京中山生物技術(shù)公司)，酶聯(lián)免疫檢測儀(DG3022A)

1.2實驗方法

1.2.1PDLSCs的篩選及培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[6]。

1.2.2PDLSCs增殖的測定(MTT):應(yīng)用無水乙醇+粉劑17β-E2醇配制原液，濃度為1×104mol/L，-20℃冰箱保存待用。使用時取1×104mol/L原液10 ml，按濃度梯度稀釋法用無水乙醇依次配成1×10-7、1×10-8、1×109mol/L 3個試驗藥物濃度，將不同濃度17β-E2工作液按照0.01%比例加入無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(無酚紅α-MEM+100 U/ml青霉素+5%活性炭及葡聚糖處理過的胎牛血清+100 μg/ml 鏈霉素+10 nmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉松+50 μg/ml抗壞血酸)，對照組加入濃度0.01%的無水乙醇，分組如下：①E10-7組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-7mol/L)；②E10-8組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-7mol/L)；③E10-9組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-9mol/L)；④對照組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+無水乙醇(0.01%)；取第三代生長良好的PDLSCs及牙周膜細(xì)胞，胰酶消化，離心收集后加入普通培養(yǎng)液吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×103cells/ml，每孔200 μl接種于96孔塑料板，24 h后細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入對照及不同濃度17β-E2無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每組設(shè)6個重復(fù)孔，每孔180 μl。4組每2天加1次藥，同時換液。MTT法測定藥物作用后第1、3、5、8、11天的細(xì)胞增殖情況：每孔加入5%MTT 20 μl, 置入CO2孵箱繼續(xù)孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液及MTT，加入DMSO 150 μl，置于水平震蕩儀充分震蕩5 min后分光光度儀 (波長:490 nm)測光吸收值(OD值)，以時間為橫軸、OD值為縱軸繪制生長曲線，反映其對細(xì)胞增殖的影響。

1.2.3堿性磷酸酶(ALP)活性測定:雌激素濃度設(shè)定同前，將不同濃度17β-E2工作液按照0.01%比例加入無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(無酚紅α-MEM+100 U/ml青霉素+5%活性炭及葡聚糖處理過的胎牛血清+100 μg/ml 鏈霉素+10 nmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉松+50 μg/ml抗壞血酸)，對照組加入濃度0.01%的無水乙醇，分組如下：①對照組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+無水乙醇(0.01%)；②E10-7組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-7mol/L)；③E10-8組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-8mol/L)；④E10-9組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-9mol/L)；⑤ICI組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+ICI182780(1×10-7mol/L)；⑥E10-7+ICI組：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液+17β-E2(1×10-7mol/L)+ICI182780(1×10-7mol/L)。取第三代生長良好的PDLSCs及牙周膜細(xì)胞，胰酶消化，離心收集后加入普通培養(yǎng)液吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×104cells/ml，每孔200 μl接種于96孔塑料板，24 h后細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入對照及不同濃度17β-E2的無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每孔180 μl，每組設(shè)8個重復(fù)孔。6組每2天加藥1次，并同時換液。測定藥物作用后各組第1、3、5、8、11、14天堿性磷酸酶活性。具體步驟為：吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再加入0.2% TritonX-100 50 μl，4℃環(huán)境溫度下過夜，按試劑盒說明先后加入緩沖液、基質(zhì)液各50 μl，充分混勻，37℃孵育15 min，加入顯色劑150 μl，置于分光光度計(520 nm波長)測OD值，確定其對細(xì)胞分化的影響。

1.2.4Ⅰ型膠原合成能力測定(羥脯氨酸含量的測定):雌激素濃度設(shè)定及分組同前，取第三代生長良好的PDLSCs及牙周膜細(xì)胞，胰酶消化，離心收集后加入普通培養(yǎng)液吹打混勻，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度5×104cells/ml，每孔100 μl接種于96孔塑料板，24 h后細(xì)胞貼壁，吸棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，加入對照及不同濃度17β-E2的無酚紅成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液，每組設(shè)8個重復(fù)孔，每孔180 μl，隔日換液加藥1次。細(xì)胞培養(yǎng)3 d 后,按照羥脯氨酸試劑盒進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果

2.1雌激素作用下PDLSCs形態(tài)學(xué)觀察添加外源性雌激素后，細(xì)胞增殖加快，生長密集，呈螺旋狀排列。見圖1。

E2干擾前(HE×40)E2干擾后(HE×40)

圖1雌激素干擾前后PDLSCs形態(tài)學(xué)觀察

2.2PDLSCs增殖水平測定在生理濃度17β-E2作用下，PDLSCs的增殖發(fā)生變化，與對照組相比，前3 d雌激素干擾組細(xì)胞增殖受到抑制，此后雌激素干擾組細(xì)胞增殖高于對照組，在不同藥物濃度組間，1×10-7mol/L組對細(xì)胞增殖影響最為明顯，其細(xì)胞增殖水平高于其余2組。見圖2，表1。

2.3堿性磷酸酶(ALP)活性測定生理濃度17β-E2醇作用下，PDLSCs ALP的表達(dá)發(fā)生動態(tài)變化，自第3天開始，各組ALP表達(dá)均升高，而雌激素干擾組ALP表達(dá)量高于對照組，在不同藥物濃度組間E10-7組ALP表達(dá)增加高于其余2組。見圖3，表2。

2.4Ⅰ型膠原合成能力測定在不同生理濃度17β-E2作用下，PDLSCsⅠ型膠原合成表達(dá)與對照組相比有增加趨勢，且與藥物濃度有劑量依賴關(guān)系，在不同藥物濃度組間1×10-7組作用最為明顯。見圖4。

圖2　不同濃度雌激素作用下PDLSCs的增殖效應(yīng)

±s

圖3　不同濃度雌激素作用下PDLSCs的ALP表達(dá)變化

表2　不同濃度雌激素作用下PDLSCs的ALP表達(dá)變化　±s

注:不同濃度組間方差分析F=5.21,P=0.0231

圖4　不同濃度雌激素作用下PDLSCs膠原合成的變化

3　討論

牙周膜內(nèi)含有多種細(xì)胞，其中成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞是其主要功能細(xì)胞，負(fù)責(zé)生成牙骨質(zhì)、牙槽骨及牙周韌帶，完成牙周組織結(jié)構(gòu)的更新及再生。牙周膜內(nèi)存在少量未分化間充質(zhì)細(xì)胞PDLSCs，是上述功能細(xì)胞的前體細(xì)胞，Seo等[1]的研究證實牙周膜干細(xì)胞具有橫向分化能力，可分化為牙髓母細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及纖維母細(xì)胞，在體外微環(huán)境下，可分化成為成牙骨質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞，把牙周膜干細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)后可形成牙骨質(zhì)-牙周膜樣結(jié)構(gòu)。在明確PDLSCs在牙周改建及再生過程中的重要性之后，雌激素在牙周改建和牙周疾病的發(fā)病及治療過程中，對PDLSCs有何影響是雌激素對牙周組織功能作用機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。由此，在本實驗中我們以不同濃度的外源性雌激素17β-E2對處于成骨分化誘導(dǎo)中的PDLSCs進(jìn)行干擾，以MTT法測定細(xì)胞增殖變化，并檢測ALP的表達(dá)變化，以明確在成骨過程中不同生理濃度的雌激素對PDLSCs的增殖及成骨活性的影響。在前述實驗中，我們證實了在PDLSCs中有ER的兩種亞型：ERα及ERβ表達(dá)，而且在雌激素作用下，兩種受體的表達(dá)量均增加，雌激素對雌激素受體的表達(dá)有上調(diào)作用，據(jù)此，在本研究的堿性磷酸酶測定中，我們設(shè)立了ER抑制劑ICI182780及ICI182780+17-βE2 2組對照，以此進(jìn)一步明確在成骨過程中ER的功能作用。結(jié)果顯示：(1)在生理濃度17β-E2作用下，PDLSCs的增殖發(fā)生變化，與對照組相比，第3天雌激素干擾組細(xì)胞增殖受到抑制，此后雌激素干擾組細(xì)胞增殖高于對照組，各組在第8天進(jìn)入平臺期。在不同藥物濃度組間，E10-7組對細(xì)胞增殖影響最為明顯，其細(xì)胞增殖水平高于其余2組，在第1天各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，在第3天、第5天、第8天、第11天各組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(2)在生理濃度17β-E2作用下，PDLSCs ALP的表達(dá)發(fā)生動態(tài)變化，自第3天開始，各組ALP表達(dá)均升高，而雌激素干擾組ALP表達(dá)量高于空白對照、ICI182780及ICI182780+17β-E2組，第8天達(dá)到峰值，在不同藥物濃度組間E10-7組ALP表達(dá)增加高于其余2組。空白對照、ICI組及E10-7+ICI組在各時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，說明在PDLSCs成骨過程中，ER發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

雌激素在人體內(nèi)作用廣泛，除全身作用外，雌激素對正常牙周組織及其細(xì)胞成分也有重要的功能作用，Tanaka等[7]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠去卵巢組切除雙側(cè)卵巢60 d 后，與對照組相比，骨小梁體積和數(shù)量減少明顯，同時，密度明顯下降，牙槽骨變薄，骨吸收及形成參數(shù)明顯高于對照組，在骨吸收表面可見大量破骨細(xì)胞，這一結(jié)果提示雌激素水平的降低將誘發(fā)牙槽骨呈骨質(zhì)疏松化，并加重骨組織的破壞。還有學(xué)者用免疫組化染色方法觀察不同條件下雌性SD大鼠在第一磨牙牙周組織中的骨形成蛋白(BMP) 染色陽性強(qiáng)度[8]，與正常對照組比較,雌激素治療組在牙周組織中的BMP染色增強(qiáng),其中張力區(qū)染色改變最為明顯,而骨質(zhì)疏松組的染色減弱。另外，破骨細(xì)胞染色在骨質(zhì)疏松組明顯增強(qiáng)，在雌激素治療組減弱，說明雌激素能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞分泌BMP,從而增強(qiáng)成骨作用,并同時抑制破骨細(xì)胞的活性。Morishita等[9]在體外培養(yǎng)的人牙周膜細(xì)胞中加入雌激素，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的骨鈣素分泌增多, 在進(jìn)一步的研究中，還發(fā)現(xiàn)雌激素可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)以及礦化結(jié)節(jié)的形成[10]，提示雌激素有影響牙周組織的再生能力。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)雌激素對牙周膜細(xì)胞的增殖，以及其胞外基質(zhì)的合成不起作用[11]。在本研究中，17β-E2呈劑量依賴性促進(jìn)PDLSCs的增殖，由于PDLSCs在牙周再生和改建中有重要作用，提示對于絕經(jīng)后女性，由于雌激素水平降低，不僅導(dǎo)致骨丟失增加，而且可能會影響到牙周干細(xì)胞的增殖，進(jìn)而影響牙周組織改建，牙周附著喪失風(fēng)險加大。

ALP分布于體內(nèi)幾乎所有器官,其作用機(jī)制為通過水解磷酸酶、破壞礦化抑制劑，并作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基轉(zhuǎn)運(yùn)子，從而促進(jìn)礦化。ALP是生物礦化和成骨樣細(xì)胞的特征性標(biāo)記,因此，其活性的高低能夠反映相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢[12-14]。已有研究顯示:在牙周膜細(xì)胞前體細(xì)胞中ALP陽性細(xì)胞比率與礦化組織形成量成正比[15]。因而ALP活性已成為觀察牙周膜細(xì)胞分化功能的一項重要指征。羥脯氨酸是前膠原、膠原蛋白合成所必需的前體氨基酸，在膠原蛋白中羥脯氨酸占13.4%，在彈性蛋白中含量極少，而在其他蛋白中均不存在，因此，羥脯氨酸可較為靈敏地反映Ⅰ型膠原的分泌情況[16]。Plant等[17]對雌性小鼠成骨細(xì)胞在雌激素作用下的膠原表達(dá)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)雌激素可明顯促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原的分泌。由于ALP和Ⅰ型膠原分別是成骨細(xì)胞早期及晚期分化的重要指標(biāo)[18，19],本研究結(jié)果顯示17-β雌二醇表現(xiàn)為劑量依賴性增加ALP活性及Ⅰ型膠原的分泌，說明雌激素可促進(jìn)PDLSCs向成骨細(xì)胞的分化，以及基質(zhì)礦化的形成。在本研究中我們還設(shè)立了ER抑制劑ICI182780及ICI182780+17β-E2對照組，以此探討ER在雌激素促進(jìn)PDLSCs成骨分化過程中的作用，結(jié)果表明，抑制劑組與空白對照組在各檢測時間點差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，提示雌激素對PDLSCs的成骨分化的促進(jìn)作用依賴于ER。在前述實驗中我們證實PDLSCs表達(dá)ER兩種亞型：ERα及ERβ，且ERα表達(dá)高于ERβ，兩種受體在PDLSCs成骨分化中的作用有何差異尚不清楚，需要在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

綜上所述，雌激素能夠促進(jìn)PDLSCs的成骨分化過程，這一促進(jìn)作用和ER及雌激素濃度密切相關(guān)。

提示我們，絕經(jīng)后女性易患牙周疾病可能不僅與雌激素缺乏導(dǎo)致的骨丟失相關(guān)，而且與雌激素缺乏引發(fā)的局部牙周組織代謝及改建功能障礙有密切聯(lián)系，前者是全身因素，后者為局部因素，而在局部因素中，PDLSCs的相關(guān)研究可能會為牙周病和正畸臨床及基礎(chǔ)研究提供一種新的思路。

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Experimental study on the effects of exogenetic estrogen on the ability of human periodontal ligament stem cell osteogenic differentiation

PANFeng*,DINGYin,LIBaoyong.

*DepartmentofStomatology,Xi’anTrafficUniversityStomatologicalHospital,Xi’an710004,China

ObjectiveTo investigate the effects of exogenetic estrogen on the differentiation ability of human periodontal ligament stem cell (PDLSCs) in vitro.MethodsThe PDLSCs were cultured in non-phenol red osteogenesis induction medium with different concentrations of 17β-E2 (E10-7,E10-8,E10-9),moreover, which were cultured in osteogenesis induction medium+0.01% dehydrated alcohol (control group), besides,-which were cultured in the medium with different concentrations of estradiol (E10-7,E10-8,E10-9) and were cultured in osteogenesis induction medium+ICI182780 (ICI group), and osteogenesis induction medium+ 10-7β-E2+10-7ICI182780 (10-7+ICI group),respectively.The cell shape, cell proliferation activity,alkaline phosphatase (ALP) activity,the synthesis ability of typeⅠcollagen were detected in every group.ResultsAfter treated by exogenetic estrogen,the cell proliferation was speeded up,cell growth was intensived,with spiral arrangement. As compared with that in control group, the cell proliferation on 3 days,5 days in estrogen intervention group was obviously inhibited (P<0.05),moreover, the cell proliferation in estrogen intervention group was higher than that in control group (P<0.05). Among difeerent drug concentration groups, the effects in E10-7group on cell proliferation were the most obvious,and the cell proliferation levels in E10-7group were significantly higher than those in E10-8group and E10-9group (P<0.05). The espression of ALP showed dynamic changes, the levels of ALP from the third day in all the groups were increased,however,which in estrogen intervention group were significantly higher than those in control group (P<0.05). Among different drug concentration groups, the levels of ALP in E10-7group were significantly higher than those in E10-8group and in E10-9group (P<0.05). However there were no significant differences between ICI group and E10-7+ICI group (P>0.05). As compared with that in control group,the type Ⅰ collagen synthesis of PDLSCs had an enhancement trend,moreover,with a drug dose-dependent way.ConclusionThe estrogen can promote osteogenic differentiation process in PDLSCs,moreover, its action is closely correlated to estrogen concentration.

stem cell;human periodontal ligament stem cell;estrogen;osteogenic differentiation

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.17.015

710004西安市，西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科(潘峰)；中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院正畸科(丁寅)；中國人民解放軍第401醫(yī)院口腔科(李寶勇)

R 781.4

A

1002-7386(2016)17-2611-05

2016-02-15)