尋常型銀屑病患者外周血中微粒子的表達(dá)

李　林　聶建軍　張力文　王文菊　張大維　劉　艷　陳　濤

尋常型銀屑病患者外周血中微粒子的表達(dá)

李林聶建軍張力文王文菊張大維劉艷陳濤

目的：檢測微粒子在尋常型銀屑病外周血中的表達(dá)。方法：高速離心法分離33例尋常型銀屑病患者和33名正常對照外周血T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞來源的微粒子，分別進(jìn)行細(xì)胞特異性單克隆抗體標(biāo)記，采用流式細(xì)胞儀檢測三種細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量。結(jié)果： 銀屑病組患者血漿中T細(xì)胞（CD3+）來源的微粒子、單核細(xì)胞（CD14+）來源的微粒子和B細(xì)胞（CD19+）來源的微粒子數(shù)量分別為（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105和（4.1±0.2）×105高于正常對照組（2.0±0.3）×105、（1.6±0.3）×105和（1.1±0.2）×105。治療后銀屑病組患者微粒子的總數(shù)量較治療前明顯減少（P＜0.01）。此外，銀屑病患者血漿中微粒子水平與PASI評(píng)分呈正相關(guān)性。結(jié)論：微粒子的數(shù)量在尋常型銀屑病外周血中明顯升高，可能在銀屑病的發(fā)病中起重要作用。

尋常型銀屑病； 微粒子； PASI評(píng)分

微粒子（microparticles，MPs）是細(xì)胞在激活、損傷或凋亡狀態(tài)下從質(zhì)膜釋放的直徑＜1 μm的微小囊泡狀物質(zhì)。幾乎所有種類細(xì)胞都能產(chǎn)生MPs，常見的有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等，在這些細(xì)胞受到激活或者凋亡時(shí)MPs的產(chǎn)生顯著增加。MPs擁有其母細(xì)胞的特征，含有細(xì)胞受體、胞漿蛋白、核酸和細(xì)胞因子。MPs曾被認(rèn)為是細(xì)胞塵片，僅僅是細(xì)胞活化或損傷的標(biāo)志物；但現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明MPs能與鄰近或遠(yuǎn)處的細(xì)胞相互作用，傳遞生物信息，廣泛參與體內(nèi)的病理生理過程，如炎癥反應(yīng)、血栓形成及腫瘤的增殖等［1，2］。目前已經(jīng)證實(shí)，MPs在許多疾病中表達(dá)均增加，包括血管炎、系統(tǒng)性硬皮病、皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抗磷脂綜合征及多發(fā)性硬化癥等多種自身免疫性疾病，以及急性冠脈綜合征、膿毒血癥、1型糖尿病、HIV等［3，4］。

銀屑病是由遺傳因素、環(huán)境因素共同作用、免疫介導(dǎo)的共同通路引起的角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，目前病因不清，特征為角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化異常，伴有顯著的炎性細(xì)胞浸潤，其中主要為T細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和分化調(diào)節(jié)異常、分泌細(xì)胞因子和黏附分子的改變及其與T細(xì)胞的相互作用等方面在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用［5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者外周血中血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及單核巨噬細(xì)胞來源的MPs明顯升高，和傳統(tǒng)的心血管代謝危險(xiǎn)因子一樣，參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程［6］。使用抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）藥物改善銀屑病患者癥狀后，其外周血中血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板來源的MPs數(shù)量明顯減少［7］。而銀屑病患者外周血中T細(xì)胞和B細(xì)胞來源的MPs數(shù)量文獻(xiàn)中少有報(bào)道，本研究旨在測定銀屑病患者血漿中淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞來源的微粒子的表達(dá)水平，以及不同病情的銀屑病患者體內(nèi)血漿微粒子的表達(dá)是否有差異，從一個(gè)新的視野和角度進(jìn)一步探討銀屑病的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也為治療銀屑病開辟新的道路。

1　材料與方法

1.1病例選擇 經(jīng)成都市第二人民醫(yī)院皮膚科住院部臨床及組織病理確診的33例尋常型銀屑病患者，男20例，女13例，年齡16～65歲，平均（41.8±2.6）歲。初發(fā)或復(fù)發(fā)病程1周至40年，平均13.7±2.3年。初診患者或近2個(gè)月未系統(tǒng)使用維A酸、免疫抑制劑、激素等藥物，近2周未使用外用藥患者，并且除外妊娠、肝腎功能異常、心腦血管疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡＜16歲或＞65歲；有嚴(yán)重心腦血管疾病、肺、肝、腎功能異常者；妊娠及哺乳期女性；近2個(gè)月系統(tǒng)使用過維A酸、免疫抑制劑、激素等藥物；近2周內(nèi)使用過外用藥患者。治療方法:予復(fù)方甘草酸苷注射液靜脈滴注（60 mL/天），外用鹵米松乳膏及我院自制尿素乳膏（均兩次/天），隔日照射NB-UVB，療程兩周。治療前后分別根據(jù)銀屑病部位、面積、嚴(yán)重程度進(jìn)行PASI評(píng)分（psoriasis area and severity index）。對照組:33例年齡、性別相匹配的、無系統(tǒng)性疾病、無吸煙史及無任何皮膚病病史的健康體檢者。兩組研究人員均簽訂書面知情同意書，實(shí)驗(yàn)組治療前后進(jìn)行PASI評(píng)分。兩組性別、年齡差異無顯著性（P＞0.05）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1分離微粒子 采清晨空腹受試者靜脈血10 mL，枸櫞酸鈉抗凝，輕輕混勻1500 g離心10 min，取上清液，分裝后液氮中保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)取4 mL血漿，1500 g離心5 min去除懸浮的細(xì)胞，然后100，000 g離心20 min，移除上清液，加入10 mL緩沖液（5 mM KCl，1 mM MgCl2，以及136 mM NaCl，pH 7.4）洗滌兩次［4］。

圖1　尋常型銀屑病患者血漿中T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量與PASI評(píng)分的相關(guān)性

1.2.2標(biāo)記微粒子和流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 加入2.5 mM CaCl2緩沖液和1%胎牛血清至500 μL，再分別加入FITC、PE及R-PE標(biāo)記的鼠抗人CD3、CD19、CD14和陰性對照的抗體（Becton Dickinson，Basel，Switzerland），避光孵育30 min。100，000 g離心20 min洗滌兩次，除去未結(jié)合的抗體。最后，各加入200 μL PBS。1.2.3 流式細(xì)胞學(xué)檢測 用散射光設(shè)門（FSC/SSCGating），計(jì)算1 min通過的MPs數(shù)量，Cell Quest軟件（美國Becton Dickinson）分析數(shù)據(jù)，打印出散點(diǎn)圖，分別計(jì)算CD3、CD19、CD14陽性的MPs數(shù)量，與對照組進(jìn)行對比，分析與PASI評(píng)分的相關(guān)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 微粒子的數(shù)量用平均數(shù)±SEM表示。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，MPs和PASI評(píng)分之間的相關(guān)性應(yīng)用Spearmans秩相關(guān)檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)處理分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1尋常型銀屑病患者血漿中微粒子的數(shù)量較正常對照組明顯增加見表1。

表1　兩組血漿中微粒子數(shù)量比較

2.2尋常型銀屑病患者血漿中微粒子的數(shù)量治療后較治療前明顯減少 治療前尋常型銀屑病患者血漿中3種微粒子的平均數(shù)量為（4.91±0.17）×105/mL，治療后尋常型銀屑病患者血漿中3種微粒子的平均數(shù)量為（2.90±0.16）×105/mL，后者較前者明顯減少（t= 16.28，P＜0.01）。其中治療后CD3+、CD14+和CD19+的微粒子數(shù)量較治療前均明顯減少（t分別為11.35、12.67、11.75，均P＜0.01）。

2.3尋常型銀屑病患者的PASI評(píng)分與微粒子數(shù)量的相關(guān)性（圖1） 3種細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量均與銀屑病的PASI評(píng)分正相關(guān)，其中T細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量增加似乎較單核細(xì)胞和B細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量與疾病的嚴(yán)重程度更具有相關(guān)性（r=0.76，P＜0.0001）。

3　討論

微粒子早在20世紀(jì)60年代由Wolf發(fā)現(xiàn)，長期以來，人們認(rèn)為其只是血小板的碎片，但近些年人們才發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細(xì)胞均可產(chǎn)生微粒子［3］。它們在生理和病理過程中作為細(xì)胞間信息交換的一種新的媒介，由細(xì)胞膜脫落后進(jìn)入血液循環(huán)，作用于遠(yuǎn)隔部位的細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息交換，傳遞生物信息，廣泛參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等病理生理過程。目前的一些研究發(fā)現(xiàn)，微粒子能夠促進(jìn)白細(xì)胞的游走和黏附，還能儲(chǔ)存大量的促炎癥性細(xì)胞因子，如IL-1β，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生（IL-6、MCP-1），調(diào)節(jié)B細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白。另一方面，微粒子在抗炎癥方面也發(fā)揮著重要作用，T細(xì)胞來源的微粒子能夠調(diào)節(jié)TGF-β1的產(chǎn)生，通過FasL途徑誘導(dǎo)B細(xì)胞和T細(xì)胞的凋亡；一些中性粒細(xì)胞來源的微粒子攜帶有annexin A1，通過抑制中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用發(fā)揮抗炎作用。因此微粒子在體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等病理生理過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［3］。

由于目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)微粒子在多種疾病中表達(dá)升高，如血管炎、系統(tǒng)性硬皮病、皮肌炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病，以及冠心病、膿毒血癥、1型糖尿病等，因此我們本次研究嚴(yán)格篩選研究對象，任何有以上疾病病史的患者和對照組均被排除在外，以避免對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。目前銀屑病的發(fā)病機(jī)制雖仍不完全清楚，但已經(jīng)證實(shí)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞在其發(fā)病中起到至關(guān)重要的作用。淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞通過分泌多種炎癥性細(xì)胞因子，作用于角質(zhì)形成細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，導(dǎo)致并且加重銀屑病的病情。而微粒子由于其來源和作用的廣泛性，極有可能參與了銀屑病的發(fā)病過程。目前雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板及單核巨噬細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量在銀屑病患者外周血中明顯升高，但T細(xì)胞和B細(xì)胞來源的微粒子在銀屑病外周血中的表達(dá)水平不十分清楚。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們著重研究銀屑病患者血漿中T細(xì)胞（CD3+）、單核細(xì)胞（CD14+）和B細(xì)胞（CD19+）來源的微粒子。同國外的研究一致，我們發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量較正常對照組明顯升高，另外我們也發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞來源和B細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量較對照組也明顯升高，并且治療后3種微粒子數(shù)量較治療前明顯減少。此外，銀屑病患者血漿中T細(xì)胞源性微粒子水平與PASI評(píng)分具有相關(guān)性，這表明銀屑病的炎癥反應(yīng)過程中，除了炎癥性細(xì)胞因子，如TNF-α等，炎癥細(xì)胞來源的微粒子可能同樣起到重要的作用，同時(shí)也從另一個(gè)角度證實(shí)了T細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的關(guān)鍵性作用，這是對國外研究的一個(gè)補(bǔ)充［8］。然而，同國外的研究一樣，本研究也沒有闡明微粒子在銀屑病中的作用機(jī)制。

總之，本研究證實(shí)了不同細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量在尋常型銀屑病患者血漿中明顯增加，其中T細(xì)胞來源的微粒子數(shù)量和銀屑病患者的病情嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，微粒子作為一種細(xì)胞間信息交換的媒介參與了銀屑病的發(fā)病過程。然而，微粒子作用的靶點(diǎn)以及在炎癥反應(yīng)中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿:2015-08-05 修回:2015-08-27）

Expression of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris

LI Lin，NIE Jianjun，ZHANG Liwen，WANG Wenju，ZHANG Dawei，LIU Yan，CHEN Tao.
Department of Dermatology，Chengdu Second People's Hospital，Chengdu 610017，China

Objective:To detect the level of microparticles in peripheral blood of patients with psoriasis vulgaris.Methods:The microparticles from T-cells，B-cells and monocytes in 33 patients with psoriasis vulgaris and 33 healthy controls were isolated by high-speed differential centrifugation.Microparticles from T-cells，B-cells and monocytes were treated with specific labeled monoclonal antibodies respectively and the number of microparticles was detected by flow cytometry.Results:The total number of microparticles derived from T cells，B cells and monocytes in patients was（6.6±0.2）×105，（3.9±0.3）×105and（4.1±0.2）×105and those in healthy controls was（2.0±0.3）×105，（1.6±0.3）×105and（1.1±0.2）×105，with significant difference（P＜0.05）.The number of microparticles in patients decreased after treatment.There was a positive correlation between the level of microparticles and PASI in patients with psoriasis vulgaris.Conclusion:The number of microparticles in patients with psoriasis vulgaris increased significantly，which may play an important role in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

psoriasis vulgaris；microparticles；PASI

四川省衛(wèi)生廳課題（編號(hào):120553）

成都市第二人民醫(yī)院皮膚科，四川成都，610017