308 nm準(zhǔn)分子激光照射兔耳最小紅斑量

岳學(xué)蘋王宏偉

·病例報(bào)告·

308 nm準(zhǔn)分子激光照射兔耳最小紅斑量

岳學(xué)蘋1，2王宏偉1

目的： 明確308 nm準(zhǔn)分子激光照射兔耳最小紅斑量（Minimum Erythema Dose，MED）。方法： 應(yīng)用308 nm準(zhǔn)分子激光照射30只兔子左耳，分別給予單次單劑量150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2，右側(cè)作對照。計(jì)算30只兔耳激光照射24、48、72 h后的MED平均值，并觀察96 h后組織病理和透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）下超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果： 經(jīng)308 nm準(zhǔn)分子激光照射后，24、48和72 h后MED平均值均為（300±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（24只兔）MED值為300 mJ/cm2。照射96 h后MED區(qū)較未照射區(qū)的組織病理：表皮和真皮層增厚，真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，可見紅細(xì)胞外滲。TEM：MED區(qū)照射96 h后膠原纖維變性、排列紊亂，纖維細(xì)胞細(xì)胞器凝聚呈團(tuán)塊狀變性；血管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞外滲；部分血管管腔狹窄，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)異型。96 h后紅斑逐漸消退，10～14天內(nèi)消失，病理和TEM均未見大面積壞死。結(jié)論： 308 nm準(zhǔn)分子激光是一種高效穩(wěn)定和安全的光源。

308 nm準(zhǔn)分子激光； 最小紅斑劑量； 防曬

308 nm準(zhǔn)分子激光是一種新型紫外線激光光源，為氯化氙（XeCl）準(zhǔn)分子激光，其本質(zhì)上是激光，具有激光的高方向性、單色性、高亮度和相干性。308 nm準(zhǔn)分子激光可以在瞬間發(fā)射高強(qiáng)度、高能量、單一波長的308 nm紫外光（Ultraviolet B，UVB），直接照射局部皮損部位，對周圍組織無明顯損傷，因此可以明顯縮短病程和治療次數(shù)。臨床上為了提高308 nm準(zhǔn)分子激光治療各種疾病的有效性，需要預(yù)估或預(yù)測最小紅斑劑量（MED），以決定起始照射劑量，因此我們進(jìn)行最小紅斑量動物實(shí)驗(yàn)的體內(nèi)測定方法的研究。以往研究大多以人體為研究對象，此次我們選擇兔耳為對象研究308 nm準(zhǔn)分子激光照射后MED的測量方法，期待驗(yàn)證該激光在動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的穩(wěn)定性、一致性、高效性和安全性，為該光源的其他應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究。

近年來，308 nm準(zhǔn)分子激光在皮膚科治療白癜風(fēng)、銀屑病、異位性皮炎等疾病中取得了顯著療效［1-7］。應(yīng)用308 nm準(zhǔn)分子激光治療各種皮膚疾病，如果起始照射劑量太低，會延長照射時間，太高又可能造成紅斑甚至水皰，因此預(yù)估MED，選擇從亞紅斑劑量或1～2倍的MED開始照射，可以達(dá)到減少療程、減少副作用、提高療效的目的。關(guān)于308 nm準(zhǔn)分子激光對人體，尤其是對白癜風(fēng)或銀屑病患者M(jìn)ED的測定，相關(guān)報(bào)道很多。Asawanonda等［4］應(yīng)用308 nm準(zhǔn)分子激光治療銀屑病，測得人體 MED為（203.03±57.84）mJ/cm2。Ichihashi等［8］測定的人體曝光部位 MED為 20 mJ/cm2，Waterston等［9］發(fā)現(xiàn)UVB照射人體不同部位皮膚后的紅斑反應(yīng)，結(jié)果最大可有5倍差異。那么308 nm準(zhǔn)分子激光照射皮膚后，MED的測定方法是否穩(wěn)定一致？是否具有可重復(fù)性？測定方法是否方便快捷高效？以及組織病理和TEM下發(fā)生什么改變？對皮膚是否有損傷？該方法是否安全？上述問題的相關(guān)研究不多。鑒于人體實(shí)驗(yàn)的倫理性和安全性很難執(zhí)行，我們選擇兔耳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以規(guī)避人體實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)，來研究308 nm準(zhǔn)分子激光照射后MED的測量方法的穩(wěn)定性、一致性，并通過病理及TEM來判斷該激光照射后超微結(jié)構(gòu)的改變和該方法的安全性。期待驗(yàn)證308 nm準(zhǔn)分子激光作為穩(wěn)定高效安全的UVB光源，進(jìn)行光敏感或防曬霜的防護(hù)性能檢測等方面的研究。

1 對象和方法

1.1 測試對象 測試對象為日本大耳白兔（由北京富龍騰飛實(shí)驗(yàn)動物研究院有限公司提供），研究區(qū)域?yàn)樽髠?cè)兔耳內(nèi)部無毛區(qū)域，共30只，依次編號為1～30號兔子，雌性15只，雄性15只。納入標(biāo)準(zhǔn)：月齡、體重、耳朵大小基本一致，耳朵內(nèi)部要求毛發(fā)稀疏，血管走形規(guī)律，顏色接近正常膚色。排除標(biāo)準(zhǔn)：兔耳內(nèi)部毛發(fā)異常增多，血管異常充血或畸形，顏色異常充血或發(fā)紅。本實(shí)驗(yàn)獲得了首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所動物倫理理論委員會的批準(zhǔn)。1.2 測定儀器 308 nm準(zhǔn)分子激光儀（EX-308，Excimer Laser Phototherapy System，RA Medical Systems. INC.CARLSBAS，CA，USA）；能量計(jì)測定儀（LabMax TO激光能量計(jì)，Coherent，USA）；相機(jī)（佳能500D，鏡頭為18～135 mm f/3.5～5.6 IS）。

1.3 測定方法 第一天，在兔子左耳內(nèi)側(cè)中央無毛區(qū)域選5 cm×3 cm區(qū)域，盡量避開血管。按照左側(cè)縱向3個點(diǎn)（從上往下依次為1～3號），右側(cè)縱向3個點(diǎn)（從上往下為4～6號），彼此間隔1 cm，共選6個點(diǎn)，每個點(diǎn)給予單次單劑量308 nm準(zhǔn)分子激光照射。首先，每次照射前先用激光能量計(jì)測定該次照射的能量，多次測量能量數(shù)據(jù)結(jié)果顯示能量穩(wěn)定持續(xù)，1 s的照射劑量為150 mJ/cm2。選取同一耳朵6點(diǎn)照射區(qū)域，周圍未照射區(qū)為陰性對照；因?yàn)橥枚苷彰娣e有限，開始照射時間按50%遞增，即1～6號依次為1、2、3、4、6、9 s；對應(yīng)的照射劑量依次為150、300、450、600、900、1350 mJ/cm2。照射24、48、72 h后分別測定MED，MED定義為對應(yīng)時間內(nèi)最先出現(xiàn)圓形紅斑所對應(yīng)的最小劑量。結(jié)果判讀時，由3名觀察者同時判斷，至少2名觀察者同時認(rèn)可的劑量為測試結(jié)果。最后每只兔子獲得一個24 h、48 h、72 h后的MED值，然后計(jì)算30只兔子在24 h、48 h和72 h后MED的平均值。96 h后隨機(jī)抽取5只兔子，對左耳未照射區(qū)和96 h后MED區(qū)取活檢，行組織病理和TEM檢查?；顧z時，先用25%烏拉坦按2 mL/kg腹腔注射給予全身麻醉，切除正常未照射部位和MED部位的兔耳全層，每個部位按1∶2分為2份，大份放入4%福爾馬林固定后行組織病理學(xué)檢查，小份切成1 mm×1 mm固定在4%多聚甲醛-2.5%戊二醛中，4℃冰箱固定2 h后進(jìn)行TEM檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)30只兔耳在24 h、48 h和72 h各自的MED值，計(jì)算出其MED的平均值。

2 結(jié)果

2.1 兔子的基本情況 兔子共入選30只，依次編號為1～30號兔子，雌雄各15只，均65天左右，體重分別在2 kg左右。

2.2 MED結(jié)果 MED的判讀標(biāo)準(zhǔn)為對應(yīng)時間內(nèi)最早出現(xiàn)圓形紅斑時對應(yīng)的最小劑量。測得30只兔耳24 h、48 h和72 h的MED結(jié)果非常一致，平均為（300 ±55.39）mJ/cm2，其中86.6%（26只）為300 mJ/cm2，6.7%（2只）為150 mJ/cm2，6.7%（2只）為450 mJ/ cm2。MED區(qū)表現(xiàn)為圓形的充血性紅斑（圖1），第四天開始紅斑逐漸減弱，10～14天徹底消退。

2.3 病理結(jié)果

2.3.1 組織病理 未照射區(qū)（圖2a）：真表皮完整，無增厚，真皮無炎癥細(xì)胞浸潤，無血管擴(kuò)張。MED處照射308 nm準(zhǔn)分子激光后96 h：表皮完整，無角化不全和角化過度，表皮可見日曬傷細(xì)胞（即凋亡的角質(zhì)形成細(xì)胞），表皮和真皮水腫、增厚，真皮全層有毛細(xì)血管擴(kuò)張，紅細(xì)胞外滲，血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤（圖2b）。

2.3.2 TEM 未照射區(qū)：表皮完整，真皮層未見毛細(xì)血管擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤，局部真皮膠原纖維（圖3a）完整、橫向和縱向均排列整齊；纖維細(xì)胞（圖3b）形態(tài)正常，細(xì)胞核和細(xì)胞器清晰可見；毛細(xì)血管管腔無擴(kuò)張，血管周圍無炎癥細(xì)胞浸潤和紅細(xì)胞外滲。MED區(qū)308 nm準(zhǔn)分子激光照射后96 h：可見真皮層膠原纖維變性（圖3c）、排列紊亂，斷裂或扭曲；纖維細(xì)胞（圖3d）變性，細(xì)胞器凝聚呈團(tuán)塊狀變性；部分血管周圍可見炎細(xì)胞浸潤及紅細(xì)胞外滲，個別血管管腔狹窄，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)異型。

圖1 308 nm準(zhǔn)分子激光照射兔耳24 h后的MED，約300 mJ/cm2圖2 2a：未照射區(qū)組織病理：表皮真皮完整，無增厚，真皮無血管擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤（HE，×200）；2b：MED區(qū)96 h后組織病理：表皮完整，無角化不全和角化過度，表皮可見日曬傷細(xì)胞（箭頭所示），表皮和真皮增厚，真皮水腫，真皮全層有毛細(xì)血管擴(kuò)張，紅細(xì)胞外滲，血管周圍有炎癥細(xì)胞浸潤（HE，×200）

圖3 3a：未照射區(qū)TEM：橫線和縱向的真皮膠原纖維排列整齊、結(jié)構(gòu)清晰（TEM，×20000）；3b：正常兔耳TEM：真皮纖維細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞器清晰可見（TEM，×30000）；3c：MED區(qū)96 h后TEM：真皮膠原纖維變性，排列紊亂，斷裂，扭曲（TEM，×20000）；3d：MED區(qū)96 h后兔耳TEM：真皮纖維細(xì)胞變性，細(xì)胞器和細(xì)胞核凝聚呈團(tuán)塊狀（TEM，×30000）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)，我們采用308 nm準(zhǔn)分子激光測得兔耳在24 h、48 h和72 h內(nèi)的MED值均高度一致，平均值為（300±55.39）mJ/cm2。組織病理和TEM顯示：與未照射區(qū)對比，照射96 h后MED區(qū)，表皮和真皮層增厚，真皮水腫、毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管周圍大量炎癥細(xì)胞浸潤，可見紅細(xì)胞外滲。TEM下可具體看到膠原纖維變性、排列紊亂，纖維細(xì)胞細(xì)胞器凝聚呈團(tuán)塊狀變性。96 h后紅斑逐漸消退，10～14天內(nèi)紅斑消失，病理和TEM均未見大面積壞死。

關(guān)于MED值的測定，基于Waterston等［9］發(fā)現(xiàn)人體不同部位照射UVB后皮膚的紅斑反應(yīng)，結(jié)果可以最大有5倍的差異。安全性方面，如果進(jìn)行人體試驗(yàn)，照射后在人體多個部位取活檢，不容易被人體接受，因此我們選擇兔耳進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。選擇兔耳，首先，兔耳內(nèi)側(cè)表皮和真皮的皮膚結(jié)構(gòu)與人體結(jié)構(gòu)大體類似（每層細(xì)胞厚度不同）；其次，兔耳沒有毛發(fā)，不需剃毛，且顏色接近正常膚色，因此可模擬人體進(jìn)行MED的測定和觀察。該特殊部位膚色便于觀察紅斑反應(yīng)和取活檢。因此本實(shí)驗(yàn)選擇兔耳作為實(shí)驗(yàn)對象和部位進(jìn)行308 nm準(zhǔn)分子激光照射測定MED值的測定方法的研究，在國內(nèi)外暫無類似報(bào)道。盡管人的MED值因個體、部位不同而有明顯差異，但針對每一個人同一部位，通過本實(shí)驗(yàn)，我們推測應(yīng)用308 nm準(zhǔn)分子激光照射后結(jié)果可能會穩(wěn)定一致，但有待進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

測定MED時，因?yàn)槊看握丈淝皽y量激光能量都很穩(wěn)定呈直線分布，能保證給予的照射劑量穩(wěn)定。我們選擇24 h、48 h和72 h三個時間點(diǎn)觀察MED結(jié)果，高度一致穩(wěn)定，且86.6%的MED均為300 mJ/ cm2，足以證明308 nm準(zhǔn)分子激光這一激光光源的穩(wěn)定性和一致性。因此也證明用于治療白癜風(fēng)等疾病時，發(fā)射劑量的穩(wěn)定性。

應(yīng)用此激光光源照射時，激光可以瞬間在局部發(fā)出很高的能量，使達(dá)到MED的照射時間大大壓縮至數(shù)秒，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率。

縱觀組織病理和TEM，均未見到組織壞死。臨床上紅斑從第四天開始紅斑逐漸消退，最終10～14天徹底消退。臨床和病理及TEM結(jié)果均證明308 nm準(zhǔn)分子激光照射的安全性。因?yàn)橹委熑梭w疾病時，產(chǎn)生MED的劑量，是比較好的治療劑量，過高，會造成水皰、色素沉著等不良反應(yīng)，過低，會降低治療效果。此次，我們通過動物實(shí)驗(yàn)，證明了MED劑量下產(chǎn)生的紅斑是安全的，可逆的。因此可以指導(dǎo)臨床醫(yī)師對治療劑量的把握。

同時，308 nm準(zhǔn)分子激光照射后，組織病理下我們發(fā)現(xiàn)表皮和真皮水腫、增厚，表皮可見日曬傷細(xì)胞；真皮全層毛細(xì)血管擴(kuò)張，血管周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤。這一點(diǎn)與Koller等［10］和Ulrich等［11］利用紫外線（UltraViolet，UV）照射皮膚后通過反射性共聚焦顯微鏡（reflectance confocal microscopy，RCM）觀察到的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Ulrich等［11］認(rèn)為日曬傷細(xì)胞，小血管和毛細(xì)血管擴(kuò)張取決于照射的UVB劑量，這一點(diǎn)有待于我們將來對比不同倍數(shù)的MED照射下組織病理改變以進(jìn)一步驗(yàn)證。除此之外，Xu等［12］研究低劑量UVB（200 mJ/cm2UVB，F(xiàn)Ll20SE燈）照射rf2基因正常和缺陷小鼠耳朵背側(cè)，36 h后活檢在rf2基因正常小鼠耳背也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，而血管充血水腫等在第三天達(dá)到高峰，第四天后開始消退。我們在該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)72～96 h兔耳的紅斑充血反應(yīng)最重，因此選擇96 h后取活檢。

另外，Avila Acevedo等［13］以SKH-1無毛裸鼠為研究對照，測試 6 mJ/cm2的UVB燈（302 nm，26.6 W）照射裸鼠10 min后造成急性光損傷；24 h后病理結(jié)果證明，未經(jīng)保護(hù)的無毛裸鼠出現(xiàn)日曬傷細(xì)胞，上皮變薄，真皮血管充血，此實(shí)驗(yàn)與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似，但我們觀察到表皮充血增厚，與其結(jié)果不同。同時UVB光源、照射劑量與MED的相關(guān)性，都與我們的實(shí)驗(yàn)不同。為了進(jìn)一步了解308 nm準(zhǔn)分子激光照射后超微結(jié)構(gòu)改變，除了組織病理，我們還進(jìn)行了TEM的研究，除了發(fā)現(xiàn)真皮血管擴(kuò)張，血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞外滲；還進(jìn)一步觀察到有的毛細(xì)血管腔狹窄，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)異型，關(guān)于TEM下的各種表現(xiàn)，未在其他相關(guān)文章中報(bào)道。

因此，通過本實(shí)驗(yàn)，證明了308 nm準(zhǔn)分子激光作為新的UVB光源，具有操作迅速簡單、高效準(zhǔn)確、穩(wěn)定性、可重復(fù)、安全的特點(diǎn)，本研究的結(jié)果，除了補(bǔ)充308 nm準(zhǔn)分子激光照射人體產(chǎn)生的MED研究不足之外，將來主要是打算采用308 nm準(zhǔn)分子激光作為新的UVB光源進(jìn)行光敏感相關(guān)實(shí)驗(yàn)，或作為高效穩(wěn)定的光源，進(jìn)行防曬產(chǎn)品防護(hù)性能的測定等研究，此研究結(jié)果只是這些實(shí)驗(yàn)前期的基礎(chǔ)研究。

［1］Alhowaish AK，Dietrich N，Onder M，et al.Effectiveness of a 308-nm excimer laser in treatment of vitiligo：a review［J］. Lasers Med Sci，2013，28（3）：1035-1041.

［2］Nicolaidou E，Antoniou C，Stratigos A，et al.Narrowband ultraviolet B phototherapy and 308-nm excimer laser in the treatment of vitiligo：a review［J］.J Am Acad Dermatol，2009，60（3）：470-477.

［3］Nisticò SP，Saraceno R，Capriotti E，et al.Efficacy of monochromatic excimer light（308 nm）in the treatment of atopic dermatitis in adults and children［J］.Photomed Laser Surg，2008，26（1）：14-18.

［4］Asawanonda P，Anderson R，Chang YC，et al.308-nm excimer laser for the treatment of psoriasis：a dose-response study［J］.Arch Dermatol，2000，136（5）：619-624.

［5］Gerber W，Arheilger B，Ha TA，et al.Ultraviolet B 308-nm excimer laser treatment of psoriasis：a new phototherapeutic approach［J］.Br J Dermatol，2003，149（6）：1250-1258.

［6］Trehan M，Taylor CR.High-dose 308-nm excimer laser for the treatment of psoriasis［J］.J Am Acad Dermatol，2002，46 （5）：732-737.

［7］K?llner K，Wimmershoff MB，Hintz C.Comparison of the 308-nm excimer laser and a 308-nm excimer lamp with 311 -nm narrowband ultraviolet B in the treatment of psoriasis ［J］.Br J Dermatol，2005，152（4）：750-754.

［8］Ichihashi M，Ando H.The maximal cumulative solar UVB dose allowed to maintain healthy and young skin and prevent premature photoaging［J］.Exp Dermatol，2014，23（Suppl 1）：43-46.

［9］Waterston K，Naysmith L，Rees JL.Physiological variation in the erythemal response to ultraviolet radiation and photoadaptation［J］.J Invest Dermatol，2004，123（5）：958-964.

［10］Koller S，Inzinger M，Rothmund M，et al.UV-induced alterations of the skin evaluated over time by reflectance confocal microscopy［J］.J Eur Acad Dermatol Venereol，2014，28（8）：1061-1068.

［11］Ulrich M，Rüter C，Astner S，et al.Comparison of UV-induced skin changes in sun-exposed vs.sun-protected skinpreliminary evaluation by reflectance confocal microscopy ［J］.Br J Dermatol，2009，161（Suppl 3）：46-53.

［12］Xu XZ，Li XL，Shang AM，et al.Low-dose ultraviolet B induces sunburn reaction in Nfir2 gene-deficient mice［J］. Chin J Dermatol，2012，45（7）：463-465.

［13］Avila Acevedo JG，Espinosa González AM，De Mariay Campos DM，et al.Photoprotection of Buddleja cordata extract against UVB-induced skin damage in SKH-1 hairless mice ［J］.BMC Complement Altern Med，2014，3（14）：281.

（收稿：2016-03-15 修回：2016-04-15）

Determination of minimum erythema dose on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser

YUE Xueping1，2，WANG Hongwei2.
1.Department of Dermatology and Venereology，Beijing Tiantan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100050，China；2.Department of Dermatology and Venereology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China
Corresponding author：WANG Hongwei，E-mail：wanghw@pumch.cn

Objective：To determine the minimum erythema dose（MED）on rabbit ear irradiated by 308 nm excimer laser.Methods：The left ears of 30 rabbits were irradiated with the 308 nm eximer laser and the right ears were taken as the negative controls.The irradiation doses of the eximer laser on the left ears were 150，300，450，600，900 and 1350 mJ/cm2.Then the average MED after 24 h，48 h and 72 h in 30 rabbitswas calculated，and the micro-structure was observed under transmission electron microscopy（TEM），at 96 h after irradiation.Results：The average MED after 24 h，48 h and 72 h was 300±55.39 mJ/cm2.Compared with non-irradiated areas，the MED area after 96 h irradiation showed that the epidermis and dermis were thick，edema，and angiotelectasis.The blood vessels were infiltrated with lots of inflammatory cells.Under TEM，in the MED area irradiated after 96 h，there were degeneration and disorganization of collagen fibres，and fibrocyte organelle was coalesced presenting as crumby degeneration.Around blood vessels there was infiltration with inflammatory cells and erythrocyte exosmosis.Erythema gradually regressed in 96 h and disappeared in 10-14 days，without any large area of necrosis in pathology and TEM.Conclusion：308 nm eximer laser is highly stability and safety.

308 nm excimer laser；MED；sunscreen

1中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院皮膚性病科，北京，100050

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院皮膚性病科，北京，100730

王宏偉，E-mail：wanghw@pumch.cn