內(nèi)源微生物驅(qū)油功能菌定量化分析技術(shù)

胡　婧，吳曉玲

（1.中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司石油工程技術(shù)研究院，山東東營257000）

內(nèi)源微生物驅(qū)油功能菌定量化分析技術(shù)

胡婧，吳曉玲

（1.中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司石油工程技術(shù)研究院，山東東營257000）

為了解決培養(yǎng)法無法對油藏內(nèi)驅(qū)油功能菌進行定量檢測的難題，利用熒光定量PCR技術(shù)，通過對功能基因進行定量實現(xiàn)了油藏內(nèi)產(chǎn)脂肽菌、產(chǎn)甲烷菌的定量化檢測，其中產(chǎn)脂肽菌選擇srfA基因、產(chǎn)甲烷菌選擇mcrA基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法具有很好的特異性和重復性，標準曲線的相關(guān)系數(shù)達到0.99以上，擴增效率達到100%。在檢測未知樣品時，證實該方法的檢測下限可以達到10拷貝/μL。利用該技術(shù)監(jiān)測了勝利油田沾三區(qū)塊驅(qū)油一口油井（Z3-X24）在內(nèi)源微生物驅(qū)油過程中2種功能菌的定量化變化，數(shù)據(jù)表明:內(nèi)源激活前期，產(chǎn)脂肽菌密度快速升高到104拷貝/μL，內(nèi)源激活后期，厭氧的產(chǎn)甲烷古菌密度升高到104拷貝/μL，該數(shù)據(jù)表明微生物驅(qū)油過程中存在好、厭氧菌的演替規(guī)律，將2種菌的定量檢測結(jié)果與現(xiàn)場油井的產(chǎn)量進行對比，發(fā)現(xiàn)油井日油水平的動態(tài)變化與這2種菌的動態(tài)變化存在明顯對應關(guān)系。該研究建立的功能菌定量化檢測技術(shù)為內(nèi)源微生物驅(qū)油現(xiàn)場實施效果的準確預測及驅(qū)油機理分析提供了一個有效的分析手段，可以進一步提高微生物驅(qū)油工藝措施的針對性和有效性。

產(chǎn)脂肽菌；產(chǎn)甲烷菌；定量化檢測

油藏內(nèi)的微生物是微生物驅(qū)油技術(shù)的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過激活或注入油藏內(nèi)具有特定功能的細菌，通過它們自身及產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物來提高原油采收率，所以定量檢測驅(qū)油功能菌的密度變化是微生物驅(qū)油效果預測及現(xiàn)場實施方案調(diào)整的基礎(chǔ)［1-4］。油藏中大部分的細菌在室內(nèi)都是不可培養(yǎng)的，利用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法只能定量檢測油藏中小于1%的細菌，故急需建立一種快速、準確的油藏功能菌定量檢測方法［5-6］。

熒光定量PCR技術(shù)（real-time quantivative polymerase chain reaction，RT-PCR）是在普通PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)，在PCR反應體系中添加熒光基團，通過熒光信號的累積來實時監(jiān)控PCR的進程，最后通過熒光閾值的循環(huán)數(shù)和已知標準質(zhì)粒的濃度與循環(huán)閾值構(gòu)建的標準曲線對未知樣品的其實濃度進行定量［7-10］。目前，該方法是定量檢測環(huán)境樣品中不同細菌的最準確和最靈敏的方法，已廣泛應用于腸道、食品、土壤中特定類群細菌的定量檢測［11-15］。該方法在油藏微生物上的應用不多，Li等［16］利用該技術(shù)檢測了油藏中的厭氧氨氧化菌，發(fā)現(xiàn)檢測的17個油藏樣品中有9個含有豐富的氨氧化菌。司風彬［17］利用RT- PCR技術(shù)構(gòu)建了油藏嗜烴菌的定量檢測技術(shù)，分析了新疆六口區(qū)4口油井在采油過程中該菌密度變化，并與傳統(tǒng)的最大或然數(shù)（MPN）計數(shù)進行比較，確定了RTPCR技術(shù)在進行油藏功能菌檢測時的可行度。

本文中，筆者利用RT-PCR技術(shù)構(gòu)建了油藏產(chǎn)甲烷菌以及產(chǎn)脂肽菌的定量檢測方法，并將該方法應用到勝利油田沾3區(qū)塊內(nèi)源微生物驅(qū)油的油水井監(jiān)測中，通過檢測數(shù)據(jù)的分析明確這兩種功能菌與現(xiàn)場生產(chǎn)動態(tài)之間的關(guān)系，以期為沾3區(qū)塊微生物驅(qū)油效果的分析提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

1　材料與方法

1.1標準質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)產(chǎn)脂肽菌及產(chǎn)甲烷菌的代謝功能，選擇相應的功能基因為檢測目標，產(chǎn)脂肽菌選擇srfA基因，產(chǎn)甲烷菌選擇mcrA基因。選取普遍存在于勝利油藏的芽胞桿菌屬和甲烷嗜熱桿菌屬的細菌［18］作為構(gòu)建標準質(zhì)粒的細菌，分別為本實驗室在勝利油藏篩選的枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）和熱自養(yǎng)甲烷桿菌（Methanothermobacter thermautotrophicus），其中SrfA基因的擴增引物為srfA- F-5′CAAAAKCGCAKCATACCACKTTGAG3′和srfA-R 5-′TCATARAGCGGCAYATATTGATGC-3′，mcrA的擴增引物為mcrAF -5′RCGTTCATBGCGTAGTTVGGRT- 3′和mcrAR -5′GGTGGTGTMGGDTTCACMCARTA-3′，所有引物委托TaKaRa公司合成。擴增程序:預變性98℃5 min；98℃15 s、60℃30 s、72℃30 s，該步驟循環(huán)35次；72℃延伸10 min。擴增后的標準質(zhì)粒構(gòu)建委托TaKaRa公司進行。

1.2現(xiàn)場樣品處理及DNA提取

實驗所用油藏水樣來自勝利油田沾3區(qū)塊的1口油井（Z3-X24），油水樣從井口直接采集到無菌的樣品桶中。為了減低井口的污染，每次取樣前排掉2 L左右的油水樣后再進行水樣采集，每個樣品采集10 L油水樣，當天運回實驗室，樣品處理前保存在-4℃。

油藏油水樣中的菌體通過高速離心（12 000 r/min、15 min）進行收集，為了減少原油對菌體的吸附，每次離心前在離心杯中加入50 mL石油醚，離心后油水分離，細菌沉淀于離心杯底。為了收集足夠多的菌體，每個樣品都重復離心6 L液體。菌體DNA的提取利用AxyPrep基因組提取試劑盒。提取后的DNA溶解在100 μL的TE緩沖液中，利用nanodrop進行濃度檢測后置于-70℃保存，作為后期功能菌基因RT PCR反應的模板［19］。

1.3熒光定量PCR反應

RT- PCR反應利用的儀器為Bio-Rad公司的IQ5。反應試劑為Bio-Rad公司的SYBR?Green supermix，反應體系為未知樣品模板以及標準質(zhì)粒，樣品都為1 μL，引物終濃度為1 pmol/L，10 μL supermix，最后用滅菌的去離子水調(diào)整體系到20 μL。反應程序:95℃3 min；95℃10 s，60℃30 s，收集熒光，擴增40個循環(huán)；溶解曲線分析，60℃逐漸升溫到95℃，每隔0.5℃收集一次熒光。標準質(zhì)粒與未知樣品同時進行反應，濃度梯度選擇1×108、1×106、1× 104和1×102拷貝/μL。熒光定量PCR反應后數(shù)據(jù)分析由Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀自帶的分析軟件完成，現(xiàn)場檢測樣品可以根據(jù)其Ct值（每個反應管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）在生成的標準曲線上查到對應的基因拷貝數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1標準曲線構(gòu)建

利用熒光定量PCR技術(shù)構(gòu)建了油藏水樣中產(chǎn)脂肽菌及產(chǎn)甲烷菌的定量化檢測方法，利用2種微生物構(gòu)建的標準曲線見圖1。由圖1可以看出，構(gòu)建的產(chǎn)脂肽菌和產(chǎn)甲烷菌的基因定量標準曲線具有很好的線性關(guān)系，R2均大于0.99，熒光定量PCR的反應效率很高，都在100%以上。

圖1　srfA和mcrA基因的標準曲線Fig.1 Standard curve for srfA and mcrA

2.2定量方法評價

2.2.1特異性檢測

利用反應過程中的溶解曲線考察了2個基因檢測引物的特異性，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，2個功能基因熒光定量擴增的溶解曲線都是單一峰，說明所用的擴增引物產(chǎn)生的擴增條帶單一，沒有非特異性擴增，而且2個反應的擴增溶解（TM）值都在80～90℃之間，排除了擴增的片段是引物二聚體的可能性。從該結(jié)果可以看出，擴增用引物具有很好的擴增特異性，保證了檢測結(jié)果的準確性。

圖2　srfA和mcrA引物擴增的溶解曲線Fig.2 Melting curves for srfA and mcrA

2.2.2重復性檢測

取檢測用標準質(zhì)粒高、中、低3個密度梯度（1× 106、1×104和1×102拷貝/μL）各1 μL做模板進行PCR反應，每個梯度做3個平行樣，通過軟件計算Ct值，結(jié)果見表1和表2。由表1和表2可知:隨著質(zhì)粒密度的降低，Ct值逐漸增大，低濃度重復實驗間的Ct值較大，但都小于2%，在誤差允許范圍內(nèi)，說明建立的熒光定量PCR檢測方法對高、中、低3種不同密度的產(chǎn)脂肽菌和產(chǎn)甲烷菌的檢測結(jié)果均具有很好的重復性。

2.3現(xiàn)場油藏水樣分析

利用該方法檢測了沾3區(qū)塊內(nèi)源微生物驅(qū)油過程中產(chǎn)甲烷菌及產(chǎn)脂肽菌的變化趨勢，現(xiàn)場樣品提取DNA后進行熒光定量PCR的反應曲線見圖3。從圖3可以看出，該方法可以滿足現(xiàn)場油藏水樣中的2種功能菌的定量檢測，最低檢測下限達到了10拷貝/μL，說明該方法具有很高的靈敏性。實施內(nèi)源微生物激活前，Z3-X24的產(chǎn)出液中產(chǎn)甲烷菌功能基因mcrA的密度很低，只有102拷貝/μL，SrfA基因在初始樣中檢測不到。激活劑注入后檢測發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)脂肽菌的密度快速升高，到2013年4月份升高到104拷貝/μL，而產(chǎn)甲烷菌升高的幅度較產(chǎn)脂肽菌小，2013年4月份密度接近103拷貝/μL。隨著這2種菌密度的升高，該井日油水平從2011年的2 t/d升高到2013年7月的6.6 t/d，產(chǎn)量有了明顯的改善。2013年10月份，由于激活劑注入量的降低，造成2013年11月份srfA和mcrA的密度明顯降低，現(xiàn)場日油水平減低到1.3 t/d。隨著后期恢復正常的激活劑注入，srfA和mcrA呈現(xiàn)明顯的升高趨勢，該階段mcrA的增長幅度大于srfA，到2014年10月，mcrA密度接近104拷貝/uL。srfA密度在后期呈現(xiàn)波動，較之前有所降低。隨著產(chǎn)甲烷古菌密度的升高，X24日油水平也逐漸升高，到2014年7月，日油水平升高到8.5 t/d?？梢钥闯霈F(xiàn)場油井產(chǎn)出液中srfA和mcrA基因的變化與原油產(chǎn)量之間存在一定的對應關(guān)系，這也證實了該油井產(chǎn)量的改善確實與現(xiàn)場激活劑注入后內(nèi)源菌的激活有關(guān)。通過以上2種功能菌與現(xiàn)場生產(chǎn)動態(tài)之間的關(guān)系可以有效預測現(xiàn)場實施效果并開展針對性的方案調(diào)整。

表1　srfA重復性實驗結(jié)果Table 1 Results of srfA reproducibility evaluation

表2　mcrA重復性實驗結(jié)果Table 2 Results of mcrA reproducibility evaluation

圖3　沾3-X24油井產(chǎn)出液中功能基因與日油的變化Fig.3 Relationship between two functional bacteria changes and field production performance

檢測過程中，這2種功能菌的變化與內(nèi)源激活的好、厭氧菌接替規(guī)律吻合，前期好氧類的產(chǎn)脂肽菌被快速激活，產(chǎn)生生物類表面活性劑以及小分子酸等代謝產(chǎn)物來乳化原油，提高原油采收率；當好氧類細菌的代謝產(chǎn)物積累到一定程度后會激活油藏內(nèi)的厭氧類功能菌，如產(chǎn)甲烷古菌，這些厭氧細菌利用好氧階段產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，產(chǎn)生甲烷等生物氣體，改善原油流動性，提高原油采收率。

3　結(jié)論

利用RT-PCR技術(shù)實現(xiàn)了油藏樣品中產(chǎn)甲烷菌和產(chǎn)脂肽菌的定量檢測，檢測下限達到了10拷貝/μL，而且具有快速、特異性強和重復性好的優(yōu)勢。利用所建立方法分析了勝利油田沾3區(qū)塊實施內(nèi)源微生物驅(qū)油前后2種功能菌的動態(tài)變化，通過分析發(fā)現(xiàn):實施前2種菌的濃度都很低，激活劑注入后好氧類產(chǎn)脂肽菌首先被激活，到后期厭氧類產(chǎn)甲烷菌被激活，符合微生物驅(qū)油好厭氧菌接替的規(guī)律。同時分析發(fā)現(xiàn)，沾3區(qū)塊油井原油產(chǎn)量的動態(tài)變化與功能菌的變化有明顯的對應關(guān)系，利用這種關(guān)系可以對微生物現(xiàn)場實施的效果進行預測并為后期實施方案的調(diào)整提供理論依據(jù)。

［1］ 谷峻，石成芳，吳曉磊，等.油藏微生物群落研究的方法學［J］.生態(tài)學報，2007，1（1）:323-328.

［2］ 劉金峰，牟伯中.油藏極端環(huán)境中的微生物［J］.微生物學雜志，2004，24（4）:31-34.

［3］ 高配科，馬挺，劉如林.油藏微生物的代謝特征和生態(tài)結(jié)構(gòu)調(diào)控［J］.微生物學報，2011，51（6）:711-717.

［4］ 高彩霞.油藏環(huán)境微生物組成及功能特征的研究［D］.上海:華東理工大學，2011.

［5］ 李輝，牟伯中.油藏微生物多樣性的分子生態(tài)學研究進展［J］.微生物學通報，2008，35（5）:803-808.

［6］ 李輝，林匡飛，牟伯中，等.培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法聯(lián)合檢測油藏環(huán)境烴降解菌和產(chǎn)甲烷菌群多樣性［J］.微生物學通報，2011，38（1）:21-28.

［7］ 陳旭，齊鳳坤，康立功，等.實時熒光定量PCR技術(shù)研究進展及其應用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2010，41（8）:148-155.

［8］ 袁亞男，劉文忠.實時熒光定量PCR技術(shù)的類型、特點與應用［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2008，35（3）:27-30.

［9］ 李安，謝金文，魏加貴，等.熒光定量PCR技術(shù)在分子檢測上的研究進展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2009，4（4）:73-76.

［10］ 陳英劍，胡成進，趙苗青.SYBR Green實時熒光定量PCR技術(shù)平臺的建立［J］.實用醫(yī)藥雜志，2004，21（11）:997-999.

［11］ 魏春花，曾文爐，周啟星，等.熒光定量PCR技術(shù)在環(huán)境領(lǐng)域的應用［J］.中國環(huán)境監(jiān)測，2012，28（4）:48-53.

［12］ 徐娜娜.實時熒光定量PCR技術(shù)用于土壤中小麥紋枯病菌的定量檢測及動態(tài)分析［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學，2014.

［13］ 趙潔，馬晨，席曉敏，等.實時熒光定量PCR技術(shù)在腸道微生物領(lǐng)域中的研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2014（12）:61-66.

［14］ 楊美芬，王玉明，黃永坤，等.用細菌16S rRNA熒光定量PCR法檢測腸道菌群的變化［J］.中國微生態(tài)學雜志，2006，18（4）:266-269.

［15］ TUBNER S.Enumeration of 16S rDNA of desulfotomaculum lineage 1 in rice field soil by real-time PCR with SybrGreenTMdetection［J］.J Microbiol Methods，2002，50（2）:155-164.

［16］ LI H，CHEN S，MU B Z，et al.，Molecular detection of anaerobic ammonium-oxidizing（anammox）bacteria in high-temperature petroleum reservoirs［J］.Microb Ecol，2010，60（4）:1-13.

［17］ 司風彬.油藏環(huán)境中烷烴單加氧酶基因定性、定量以及轉(zhuǎn)錄水平分析［D］.天津:南開大學，2011.

［18］ 宋智勇，郝濱，趙鳳敏，等.勝利油田水驅(qū)油藏內(nèi)源微生物群落結(jié)構(gòu)及分布規(guī)律［J］.西安石油大學學報（自然科學版），2013，28（4）:44-50.

［19］ 王萍，喬勇升，韓芷玲.豬源性成分檢測中3種DNA提取方法比較［J］.生物加工過程，2015，13（6）:61-64.

（責任編輯 荀志金）

Quantification of bacteria responsible for endogenous microbial enhanced oil recovery

HU Jing，WU Xiaoling
（Research Institute of Petroleum Engineering Technology，Shengli Oilfield Company，Sinopec，Dongying 257000，China）

We used the rapid SYBR?Green fluorescent quantitative real-time PCR technique to detect lipopeptide producing bacteria and methanogenic archaea present in the reservoir.The recombinant plasmid containing srfA and mcrA gene was used as standards to generate a standard curve for lipopeptide producing bacteria and methanogenic archaea.The sensitivity，reproducibility and specificity of the technique were evaluated.The correlation coefficient（R2）of the standard curve was above 0.99 and the amplification efficiency reached 100%.To detect unknown samples，the detection limit of the method reached 10 copies/μL.Water samples collected in the oil well Z3-X24 located in Zhan3 block of Shengli oilfield were detected using the technique.The concentration of lipopeptide producing bacteria increased to 104copies/μL in the early stage of endogenous activation，while the concentration of methanogenic archaea increased to 10 copies/μL in the late stage of endogenous activation.The data confirmed there was a good successive ruler between aerobic and anaerobic bacteria in the process of MEOR.We found a correlatin between these two functional bacteria dynamics and the oil production.These results are essential for understanding oil-displacement mechanism of indigenous MEOR and providing scientificguidance to the performance of MEOR technology in the future.

lipopeptide producing bacteria；methanogenic archaea；quantitative detection

TE357.9

A

1672-3678（2016）03-0023-04

10.3969/j.issn.1672-3678.2016.03.005

2016-02-14

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）（2013AA064401）

胡 婧（1980—），女，河南許昌人，博士，研究方向:微生物采油，E-mail:tomatohu@163.com