生孢梭菌半固體培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)方法的研究

劉曉菲（華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北藁城 052165）

生孢梭菌半固體培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)方法的研究

劉曉菲
（華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北藁城 052165）

目的：建立使用半固體培養(yǎng)基進(jìn)行生孢梭菌菌落計(jì)數(shù)的方法，使菌落計(jì)數(shù)結(jié)果能夠接近最大活菌數(shù)。方法：接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋生孢梭菌菌液至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相同的濃度，用10倍稀釋法分別稀釋至1×10-6、1×10-7、1×10-8三個(gè)稀釋級(jí)備用。分別配制瓊脂濃度為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%的6種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，分別取三個(gè)稀釋級(jí)的菌液1mL接種至配制好的上述6種硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上接種等量菌液，并放入?yún)捬醮?，將接種好的上述培養(yǎng)基至35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并比較結(jié)果。結(jié)果：半固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法比厭氧袋計(jì)數(shù)法效果好，使用瓊脂濃度為0.5%的硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18小時(shí)，菌落計(jì)數(shù)最多，最接近最大活菌數(shù)。結(jié)論：生孢梭菌半固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法適用于生孢梭菌計(jì)數(shù)。

生孢梭菌；半固體培養(yǎng)基；菌落計(jì)數(shù)

藥品無菌檢查所用的培養(yǎng)基質(zhì)量是影響其試驗(yàn)結(jié)果的一個(gè)重要因素，因此應(yīng)嚴(yán)格控制無菌試驗(yàn)所用培養(yǎng)基質(zhì)量[1]。我國現(xiàn)行《中華人民共和國藥典》（2015年版）[2]規(guī)定無菌檢查所用培養(yǎng)基需進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)，采用接種小于100CFU（菌落形成單位）靈敏度檢查用菌的方法。生孢梭菌是無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基靈敏度檢查的質(zhì)控菌之一，但是其計(jì)數(shù)方法缺乏可操作性。

無菌檢查是檢查藥典要求無菌的生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料及其他品種是否無菌的一種方法，對藥品和生物制品的質(zhì)量保證起著相當(dāng)關(guān)鍵的作用，而無菌試驗(yàn)培養(yǎng)基靈敏度試驗(yàn)中生孢梭菌難以計(jì)數(shù)，阻礙了無菌試驗(yàn)正常進(jìn)行，因此我們針對這一問題進(jìn)行研究，研制出用半固體培養(yǎng)基進(jìn)行生孢梭菌計(jì)數(shù)的新方法[3]。

1　材料和方法

1.1菌種

生孢梭菌（ATCC19404）購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心，0代菌，包裝形式為凍干管。2～8℃保存。

1.2培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)：422374 廠家：美國BD公司）配制方法：稱取培養(yǎng)基干粉40g加入1000mL純化水，加入攪拌均勻，煮沸，121℃滅菌20min。硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（批號(hào)：225630廠家：美國BD公司）配制方法：稱取培養(yǎng)基干粉29.8g加入1000mL純化水，加入攪拌均勻，煮沸，121℃滅菌20min。瓊脂粉（批號(hào)：120702廠家：北京三藥）。

不同瓊脂濃度的半固體培養(yǎng)基按照表1配方配制，攪拌均勻，煮沸，121℃滅菌20min。

1.3厭氧袋

梅里埃公司提供，批號(hào)：1002010230。

表1　不同瓊脂濃度半固體培養(yǎng)基配方

1.4方法

1.4.1菌種活化

在生物安全柜中開啟凍干管，加入3mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，將菌種凍干粉溶解，轉(zhuǎn)移到同種培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。

1.4.2菌種傳代

取1mL上述活化后的新鮮培養(yǎng)物加至9mL硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，在30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。

1.4.3制備工作菌溶

將上述傳代后的菌溶用漩渦混合器混勻，用0.9%無菌氯化鈉溶溶稀釋至1個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?，與標(biāo)準(zhǔn)比濁管相同濁度后，再用0.9%無菌氯化鈉溶溶作10倍稀釋至1×10-6、1×10-7、1× 10-8三個(gè)稀釋級(jí)。

表2　麥?zhǔn)媳葷峁芗?xì)菌濃度表

1.4.4不同瓊脂濃度半固體培養(yǎng)基配制

半固體培養(yǎng)基瓊脂濃度范圍是0.2%～0.7%（g/mL），按照不同的瓊脂濃度0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%，分別在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基干粉中加入相應(yīng)比例的瓊脂粉，加熱煮沸，并高溫滅菌，分裝在大試管中，30mL/支，配制成6種半固體培養(yǎng)基。

1.4.5菌落計(jì)數(shù)

分別取1×10-6、1×10-7、1×10-8三個(gè)稀釋級(jí)的菌溶，接種到冷卻至45℃的6種半固體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基加入菌溶1mL，接種后立即混勻至少10s，每種培養(yǎng)基接種2個(gè)試管。同時(shí)，在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基[4]平皿加入等量菌溶，接種2只平皿，用涂布棒涂布均勻，放入?yún)捬醮?，加入?yún)捬醢蛥捬踔甘緱l，封好厭氧袋。

將接種好的半固體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，置于30～35℃培養(yǎng)18小時(shí)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并觀察菌落形態(tài)，記錄結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1.1相同稀釋級(jí)生孢梭菌菌溶在不同瓊脂濃度半固體培養(yǎng)基上計(jì)數(shù)結(jié)果

在不同瓊脂濃度的半固體培養(yǎng)基中接種1×10-7稀釋級(jí)菌溶1mL，30～35℃培養(yǎng)18～24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并觀察菌落形態(tài)。瓊脂濃度為0.2%，0.3%，0.4%的培養(yǎng)基，凝膠強(qiáng)度小，菌落生長成片狀，無法計(jì)數(shù)；瓊脂濃度為0.7%的培養(yǎng)基，凝固太快，生孢梭菌接種后，不能分散生長，菌落聚集，不適宜計(jì)數(shù)；瓊脂濃度為0.5%，0.6%的培養(yǎng)基中菌落分散，適于計(jì)數(shù)，瓊脂濃度為0.5%的培養(yǎng)基菌落計(jì)數(shù)結(jié)果大于瓊脂濃度0.6%的培養(yǎng)基，因此，瓊脂濃度0.5%的培養(yǎng)基計(jì)數(shù)效果優(yōu)于其他濃度的培養(yǎng)基。接種生孢梭菌培養(yǎng)18小時(shí)后，菌落呈單個(gè)典型形態(tài)，24小時(shí)后出現(xiàn)菌落擴(kuò)散現(xiàn)象，不適宜計(jì)數(shù)，因此，用瓊脂濃度為0.5%的硫乙醇酸鹽半固體培養(yǎng)基接種生孢梭菌，30～35℃培養(yǎng)18小時(shí)后，最適宜計(jì)數(shù)，結(jié)果見表3。

表3　不同瓊脂濃度的培養(yǎng)基的計(jì)數(shù)結(jié)果

2.2相同稀釋級(jí)生孢梭菌菌液在半固體和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)結(jié)果

將1×10-6、1×10-7、1×10-8三個(gè)稀釋級(jí)的生孢梭菌同時(shí)接種1mL在瓊脂濃度為0.5%硫乙醇酸鹽半固體和胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上，胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿置于厭氧袋中，兩種培養(yǎng)基在30～35℃培養(yǎng)18小時(shí)后，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并觀察菌落形態(tài)，結(jié)果見表4。

表4　不同稀釋級(jí)的生孢梭菌在兩種培養(yǎng)基上的計(jì)數(shù)結(jié)果

結(jié)果表明：硫乙醇酸鹽半固體培養(yǎng)基生孢梭菌菌落計(jì)數(shù)明顯多于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（P＜0.05）。

2　結(jié)束語

2015年版中國藥典無菌試驗(yàn)培養(yǎng)靈敏度檢查法采用接種＜100CFU的方法，將質(zhì)控菌用0.9%無菌氯化鈉溶溶稀釋到＜100CFU/mL的菌懸溶，取1mL接種到培養(yǎng)基上，培養(yǎng)并計(jì)數(shù)。但是平板計(jì)數(shù)誤差較大，難以得到準(zhǔn)確的生孢梭菌活菌數(shù)，且生孢梭菌是嚴(yán)格厭氧菌，要求苛刻的厭氧環(huán)境，也給靈敏度試驗(yàn)造成了困難，因此研制一種適合生孢梭菌菌落計(jì)數(shù)方法具有重要的意義。

硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基具有氧化還原電勢，可提供厭氧環(huán)境，適合于厭氧菌生長。在硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中加入少量瓊脂，配制成半固體培養(yǎng)基，可減少溶體的流動(dòng)性，生孢梭菌接種在該培養(yǎng)基中，混勻后，可均勻分布在培養(yǎng)基中，形成單個(gè)菌落，清晰可見，便于計(jì)數(shù)。經(jīng)過對6種不同瓊脂濃度的半固體培養(yǎng)基的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)瓊脂濃度為0.5%的半固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)效果最佳，因此確定0.5%瓊脂的半固體培養(yǎng)基，30～35℃培養(yǎng)18h，最適合生孢梭菌菌落計(jì)數(shù)。我們將半固體計(jì)數(shù)方法的結(jié)果與用厭氧袋計(jì)數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行比較，試驗(yàn)結(jié)果表明半固體培養(yǎng)基的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果明顯超過厭氧袋計(jì)數(shù)法，比較接近最大活菌數(shù)。因此，半固體培養(yǎng)基計(jì)數(shù)法更適合于生孢梭菌計(jì)數(shù)。

[1] Compiled by the Committee for Standardization of Biologics of the People's Republic of China（中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）. Requrements for Biologics of the People's Republic of China（中國生物制品規(guī)程）.Beijing（北京）：Chemical Industry Press（化學(xué)工業(yè)出版社），2000.6.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典.2015年版.四部.中國醫(yī)藥科技出版社.2015.6：1101無菌檢查法.137.

Study Sporogenes Semi-Solid Medium Colony Counting Method

Liu Xiao-fei

Objective：To establish a semi-solid media were sporogenes colony counting method，so that the results can be close to the maximum colony count the number of viable cells.Methods：Fresh culture was inoculated sporogenes to thioglycollate medium，30 ～ 35 ℃ for 18 to 24 hours，with sterile 0.9% sodium chloride solution was diluted sporogenes bacteria to the standard ratio the same concentration turbidity tube with a 10-fold dilution were diluted to 1×10-6，1×10-7，1×10-8diluted three-level backup.Agar were prepared at a concentration of 0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%，0.7% of the six kinds of thioglycollate medium were taken three stages diluted broth was inoculated into 1mL above six kinds of the prepared thioglycollate medium，while in the pancreatic casein peptone soy broth agar medium was inoculated the same amount and placed in an anaerobic bag the inoculated medium to above 35 ℃cultured 18 to 24 hours.colony count and compare the results.Results：The semi-solid medium count better than anaerobic bags counting results，use agar concentration of 0.5% thioglycollate medium，30 ～ 35 ℃ 18 hours，colony counts most，closest to the maximum number of viable cells.Conclusion：sporogenes semi-solid medium suitable for counting sporogenes count.

sporogenes；semi-solid medium；colony count

R927

A

1003-6490（2016）03-0173-02

2016-03-06

劉曉菲（1987—），女，河北石家莊人，助理工程師，主要從事藥品微生物檢驗(yàn)、菌種傳代與保藏、微生物鑒定等工作。