聚丙烯酰胺凝膠低毒性替代材料研究

王國瑀，楊美娟，王俊秀，王　磊，楊志偉，喻長遠（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 0009）

聚丙烯酰胺凝膠低毒性替代材料研究

王國瑀1，楊美娟2，王俊秀2，王磊2，楊志偉2，喻長遠2
（北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

聚丙烯酰胺凝膠電泳廣泛用于分子生物學(xué)實驗。但是丙烯酰胺具有潛在神經(jīng)毒性。我們采用N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）和N-（2-羥乙基）丙烯酰胺（HEA）兩種單體材料代替丙烯酰胺制備蛋白質(zhì)凝膠。通過測定聚合反應(yīng)體系的溫度變化，優(yōu)化了體系中催化劑TEMED的加入量；通過實際的電泳實驗確定了單體與交聯(lián)劑與N，N-甲叉雙丙烯酰胺的配比，使其得到孔徑大小適宜的凝膠，并對這兩種凝膠的性能做出初步的評價。最后，將優(yōu)化好條件的凝膠應(yīng)用于Western Blot技術(shù)分析檢測BSA蛋白，蛋白條帶明亮清晰。

聚丙烯酰胺凝膠；低毒；材料

聚丙烯酰胺凝膠電泳以其低廉的分析成本、簡單的操作、良好的重復(fù)性、較短的分析時間等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、食品、農(nóng)學(xué)等諸多學(xué)科領(lǐng)域蛋白質(zhì)以及多肽類化合物的分離鑒定。其分離機制是在電場的作用下，蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠所形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中發(fā)生遷移，其遷移的距離與電泳條件以及蛋白質(zhì)分子的分子量大小、形狀及電荷量有關(guān)。而SDS-PAGE是在電泳緩沖溶和蛋白樣品溶中分別加入了離子去污劑（SDS）和強還原劑（β-巰基乙醇），使得蛋白質(zhì)的遷移距離主要取決于蛋白質(zhì)分子量的大小而忽略了蛋白質(zhì)自身所帶電荷帶來的影響。

然而，丙烯酰胺潛在的毒性限制了它在生物凝膠領(lǐng)域使用。丙烯酰胺屬中等毒性化合物，丙烯酰胺可以損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)。長時間暴露于丙烯酰胺的職業(yè)工人或者是實驗的動物，會出現(xiàn)共濟失調(diào)、骨骼肌肉萎軟無力、體重減輕等癥狀[1-2]。Mehris S等人在體外實驗中證實，丙烯酰胺能夠誘導(dǎo)PC12細胞產(chǎn)生一系列活性氧簇（ROS），以及誘導(dǎo)細胞出現(xiàn)凋亡。自由基的產(chǎn)生與清除的不平衡以及活性氧簇的共同作用，會增加細胞氧化應(yīng)激的出現(xiàn)，而氧化應(yīng)激與一些神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病有關(guān)聯(lián)。此外，丙烯酰胺還有明顯的生殖毒性，在雄性小鼠的急性毒性試驗中，給與小鼠高劑量的丙烯酰胺，小鼠精子的數(shù)量和質(zhì)量顯著降低，DNA鏈出現(xiàn)斷裂的情況增多，致死性后代出現(xiàn)增多，使其生殖能力低下。以上這些癥狀的出現(xiàn)與Cyp2e1誘導(dǎo)丙烯酰胺向環(huán)氧丙烯酰胺代謝轉(zhuǎn)化相關(guān)，而環(huán)氧丙烯酰胺作為一個生物活性更強的物質(zhì)，可以與細胞的DNA發(fā)生共價結(jié)合，這是丙烯酰胺的致畸和致突變的機理。丙烯酰胺還對視覺系統(tǒng)造成損害，大量的神經(jīng)節(jié)細胞層的細胞發(fā)生變性并伴有空泡形成和細胞丟失，視網(wǎng)膜也出現(xiàn)了明顯的縮小，長期暴露于丙烯酰胺的環(huán)境中，會使視野中心的視野感光度降低，對色覺的組成造成不良影響。最新的研究發(fā)現(xiàn)，丙烯酰胺還會引發(fā)肝細胞損傷。Enayatollah Seydi等人將正常肝細胞與丙烯酰胺一起培養(yǎng)，肝細胞內(nèi)的谷胱甘肽快速出現(xiàn)耗竭，這是肝細胞發(fā)生氧化應(yīng)激的重要標志；在細胞結(jié)構(gòu)方面，丙烯酰胺會導(dǎo)致肝細胞線粒體和溶酶體的破壞，線粒體的膜電位下降；另外丙烯酰胺還可激活caspase-3這一誘導(dǎo)細胞凋亡的最終中介，導(dǎo)致肝細胞死亡。丙烯酰胺在常溫下為白色粉末化合物，可經(jīng)消化道和呼吸道進入人體，在丙烯酰胺溶溶和凝膠的制備過程中對實驗員的健康造成威脅，因此，尋找一列丙烯酰胺的替代品顯得極為必要。我們在試驗中嘗試了兩種低毒的酰胺類化合物作為單體代替丙烯酰胺發(fā)生聚合反應(yīng)，調(diào)整了體系中聚合反應(yīng)增速劑TEMED的加入性以及單體與交聯(lián)劑的配比，使之在室溫條件下形成性質(zhì)穩(wěn)定、質(zhì)量可控的凝膠。

1　實驗部分

1.1 主要原料

丙烯酰胺（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、N，N-甲叉雙丙烯酰胺（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、N，N-二甲基丙烯酰胺（瑞士Adamas公司）、N-（2-羥乙基）丙烯酰胺（日本TCI公司）、十二烷基硫酸鈉（SDS）（美國Amresco公司）、過硫酸銨（美國Amresco公司）、三羥甲基氨基甲烷（美國Amresco公司）、胎牛血清蛋白（美國MP公司）、甘氨酸（天津市福晨化學(xué)試劑廠）、凝膠制備試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）、預(yù)染蛋白分子量標準（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2丙烯酰胺凝膠聚合過程的研究

建立500μL微縮反應(yīng)體系：向1.5mLEP管內(nèi)按照試劑盒說明書標注的10%分離膠各物質(zhì)的配比依次加入：蒸餾水130μL，30%Acr-Bis（Acr∶Bis=29∶1）170μL，1M Tris（pH=8.8）190μL，10%SDS 5μL，10%過硫酸銨5μL。最后加入不同量的TEMED（推薦量為0.2μL）加入上述試劑后，渦旋混勻5s，立即插入普通溫度計監(jiān)測反應(yīng)體系的溫度，每30s讀數(shù)一次并記錄，連續(xù)記錄12min。反應(yīng)室溫控制在26-30℃，以減少環(huán)境溫度的變動引發(fā)的實驗誤差。最后以時間為橫軸，體系溫度為縱軸作圖。

1.3N，N-二甲基丙烯酰胺（DMA）聚合過程的研究

1.3.1DMA-Bis聚合反應(yīng)體系中TEMED加入量的優(yōu)化

按照1.2的方法建立500μL微縮反應(yīng)體系，只是將30%Acr-Bis換成DMA-Bis（DMA∶Bis=29∶0.6、29∶0.8、29∶1.0）三種溶溶，對體系中TEMED的加入量進行逐步優(yōu)化。

1.3.2DMA與Bis的配比對凝膠孔徑的影響

配制分離膠：在15mL離心管內(nèi)依次加入1 300μL蒸餾水，1 700μL30%DMA-Bis（29∶0.6）混合溶，1 900μL 1MTris pH8.8溶，50μL10%SDS溶，50μL10%過硫酸銨溶，以及優(yōu)化好劑量的TEMED溶后，立即渦旋混勻，混勻后將其灌注到兩塊玻璃板的縫隙中，最后加入1-2mL異丙醇消除氣泡，等待膠的凝固。約15min后，分離膠凝固完全，倒掉上層的異丙醇并用濾紙吸凈溶體，等待加入濃縮膠。

配制濃縮膠：在15mL離心管中依次加入1 400μL蒸餾水，330μL30%DMA-Bis（29∶0.6）混合溶，250μL 1M Tris pH6.8溶，20μL10%SDS溶，20μL10%過硫酸銨溶，以及優(yōu)化好劑量的TEMED溶后，立即渦旋混勻，混勻后將其灌注到兩塊玻璃板的縫隙中，注意不要產(chǎn)生氣泡。灌滿后，立即插入梳子，等待分離膠凝固。

按照如上的方法，將DMA：Bis=29∶0.6混合溶換成DMA：Bis=29∶0.8和29∶1.0的混合溶，一共制成三種不同配比的凝膠并對上樣量為7.5μg和1.5μg的BSA蛋白進行電泳。電泳條件：濃縮膠60V 30min，分離膠120V 100min。電泳結(jié)束后計算BSA的Rf值。

1.4N-（2-羥乙基）丙烯酰胺（HEA）聚合過程的研究

1.4.1HEA-Bis聚合反應(yīng)體系中TEMED加入量的優(yōu)化

按照1.2的方法建立500μL微縮反應(yīng)體系，只是將30% Acr-Bis換成HEA-Bis（HEA：Bis=29∶0.6、29∶0.8、29∶1.0）三種溶溶，對體系中TEMED的加入量進行逐步優(yōu)化。

1.4.2HEA與Bis的配比對凝膠孔徑的影響

按照1.3.2的方法制備HEA凝膠，只是將單體溶溶換成HEA：Bis=29∶0.6、29∶0.8和29∶1.0的混合溶，一共制成三種不同配比的凝膠并對上樣量為7.5μg和1.5μg的BSA蛋白進行電泳。電泳條件：濃縮膠60V 30min，分離膠120V 90min。電泳結(jié)束后計算BSA的Rf值。

1.5將優(yōu)化好的凝膠應(yīng)用于Western Blot技術(shù)分析檢測蛋白

將采用凝膠制備試劑盒制備的聚丙烯酰胺凝膠以及按照優(yōu)化好的條件制備的HEA聚合物凝膠對7.5μg和1.5μg的BSA蛋白進行檢測，一抗選擇兔抗BSA抗體，二抗選擇山羊抗兔IgG，并調(diào)整好適當(dāng)?shù)钠毓庖约帮@影定影時間。

2　結(jié)果與討論

2.1丙烯酰胺聚合過程溫度的變化

催化劑TEMED加入量的不同對丙烯酰胺凝膠聚合體系溫度變化的影響如圖1所示：

圖1　TEMED加入量對Acr-Bis聚合過程溫度變化的影響

我們認為，說明書給出的Acr和Bis的配比以及體系中的TEMED的量應(yīng)該為制備該種凝膠的最優(yōu)方案，可以使凝膠的各種配方混勻后平穩(wěn)有速地發(fā)生聚合。從體系的溫度變化可以看出，在500μL反應(yīng)體系中TEMED量為0.2μL時，反應(yīng)體系溫度變化相對平穩(wěn)，在渦旋混勻后6min體系溫度達到峰值，此時有利于制膠且凝膠時間較為合適。TEMED量為0.1μL時，反應(yīng)體系在12min內(nèi)未發(fā)生凝固，成膠效果差；而TEMED量大于等于0.4μL時，體系反應(yīng)相對較快，溫度變化劇烈，不利于制膠。結(jié)合如上實驗結(jié)果，我們推測，在選用新材料時，要使聚合反應(yīng)溫度的達峰時間控制在4-6min以內(nèi)，且體系溫度變化相對較小時，原料溶溶才會在室溫條件下平穩(wěn)有速地發(fā)生聚合，得到令人滿意的聚合物凝膠。

2.2.1DMA-Bis聚合反應(yīng)體系中TEMED加入量的優(yōu)化

分別采用DMA-Bis配比為29∶0.6、29∶0.8、29∶1.0的原料，測得的結(jié)果如圖2-2所示：

圖2　TEMED加入量對DMA-Bis聚合過程溫度變化的影響（第1，2幅圖為29∶0.6，第3幅圖為29∶0.8，第4幅圖為29∶1.0）

DMA組成的500μL DMA∶Bis=29∶0.6的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量分別為0.1μL和0.3μL時，該反應(yīng)體系在12min內(nèi)未檢測到明顯的溫度變化，而且凝膠未凝固，故排除這兩組實驗組；TEMED加入量分別為0.5μL、0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.75μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間在7.5-4min以內(nèi)，令人滿意，但TEMED加入量為1.75μL時，體系的溫度變化過于劇烈，難以控制，因此排除TEMED量為1.75μL的實驗組，其余實驗組在下一輪采用DMA：Bis=29：0.8的凝膠繼續(xù)考察。

在DMA組成的500μL DMA∶Bis=29∶0.8的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量為0.5μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間為7min，稍長于其他實驗組；而TEMED加入量分別為0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間很好地控制在4-6min以內(nèi)，故排除TEMED的量為0.5μL的實驗組，其余實驗組在下一輪采用DMA∶Bis=29∶1.0的凝膠繼續(xù)考察。

在DMA組成的500μL DMA∶Bis=29∶1.0的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量為0.75μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間為8min，稍長于其他實驗組；TEMED加入量為1.5μL時，體系在3.5min時溫度即達到峰值，溫度變化過于劇烈，因此排除TEMED量為1.5μL的實驗組；TEMED加入量為1.0和1.25μL時，反應(yīng)溫度的峰值很好地控制在4-6min以內(nèi)，但為盡量縮短凝膠時間，500μL體系中TEMED的加入量為1.25μL被選為最合適加入量。經(jīng)折算，5mL分離膠中TEMED的加入量為12.5μL，2mL濃縮膠中TEMED加入量為5μL。

2.2.2DMA-Bis配比對電泳結(jié)果的影響

6)相關(guān)教育部門需要進一步落實與完善體教結(jié)合機制，讓有潛力的學(xué)生在大學(xué)校園里，能夠接受高水平、系統(tǒng)的訓(xùn)練，以為我國女籃在未來的發(fā)展輸送更多的人才。

圖3　DMA-Bis聚合物凝膠電泳結(jié)果圖

計算Rf值：DMA∶Bis=29∶0.6，Rf=0.41

DMA∶Bis=29∶0.8，Rf=0.25

DMA∶Bis=29∶1.0，Rf=0.12

三種不同配比的DMA-Bis聚合物凝膠均可把蛋白marker清晰分開，蛋白marker指示BSA蛋白分子量正確，BSA的條帶染色后清晰度良好。三張圖片進行比較，DMA∶Bis=29∶0.8的凝膠中BSA蛋白的位置相對較好。

N，N-二甲基丙烯酰胺代替丙烯酰胺作為凝膠電泳的材料，可以很好地分離不同分子量的蛋白，用于凝膠的時間也較短，但依然存在以下問題：

1）DMA聚合物凝膠的質(zhì)地較差，洗膠及染色過程易破碎；

2）DMA聚合物凝膠在制備DMA-Bis混合溶及灌膠過程中均有刺激性氣味產(chǎn)生；

3）DMA聚合物凝膠分離膠電泳時間長于聚丙烯酰胺凝膠，約需要60 min，可能與凝膠的孔徑稍小有關(guān)；

4）DMA聚合物凝膠粘度較大，梳子難以從膠孔拔出，且拔出后膠孔常常變形。

考慮到如上缺點，N，N-二甲基丙烯酰胺不是一個較好的聚丙烯酰胺凝膠的替代材料，膠塊粘度較大的原因我們分析是由于該化合物的極性較弱，弱于丙烯酰胺的極性。因此，我們需要尋找一些毒性較弱、極性稍強的候選材料再次進行考察。

2.3N-（2-羥乙基）丙烯酰胺（HEA）聚合過程的研究

2.3.1HEA-Bis聚合反應(yīng)體系中TEMED加入量的優(yōu)化

分別采用HEA-Bis配比為29∶0.6、29∶0.8、29∶1.0的原料，測得的結(jié)果如圖4所示：

圖4　TEMED加入量對HEA-Bis聚合過程溫度變化的影響（第1，2幅圖為29∶0.6，第3幅圖為29∶0.8，第4幅圖為29∶1.0）

在HEA組成的500μL HEA：Bis=29∶0.6的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量分別為0.1μL、0.3μL和0.5μL時，該反應(yīng)體系在12min內(nèi)未檢測到明顯的溫度變化，而且凝膠未凝固或凝固效果差，故排除這三組實驗組；TEMED加入量為0.75μL是體系溫度的達峰時間為9.5min，略高于6min，暫不排除此配比的實驗組。TEMED加入量為0.75μL、1.0μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL的實驗組在下一輪采用HEA∶Bis=29∶0.8的凝膠繼續(xù)考察。

在HEA組成的500μL HEA：Bis=29∶0.8的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量為0.75μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間為9min，依然長于其他實驗組；而TEMED加入量分別為1.0μL、1.25μL、1.5μL、1.75μL時，反應(yīng)體系溫度的達峰時間很好地控制在4-6min左右，故排除TEMED的量為0.75μL的實驗組，其余實驗組在下一輪采用HEA∶Bis=29∶1.0的凝膠繼續(xù)考察。

在HEA組成的500μL HEA∶Bis=29∶1.0的微縮反應(yīng)體系中，TEMED加入量為1.75μL時，體系在4min時溫度即達到峰值，達峰時間稍早，能在凝膠灌注之前提前發(fā)生凝固，因此排除TEMED量為1.75μL的實驗組；其余各實驗組反應(yīng)溫度的峰值很好地控制在4-6min以內(nèi)，但為在條件允許的條件下盡量縮短凝膠時間，該體系中TEMED的加入量為1.25μL被選為最合適加入量。經(jīng)折算，5mL分離膠中TEMED的加入量為12.5μL，2mL濃縮膠中TEMED加入量為5μL。

2.3.2HEA-Bis配比對電泳結(jié)果的影響

圖5　HEA-Bis聚合物凝膠電泳結(jié)果圖（HEA∶Bis由左至右依次為29∶0.6、29∶0.8、29∶1.0）

計算Rf值：HEA∶Bis=29∶0.6，Rf=0.40

HEA∶Bis=29∶0.8，Rf=0.30

HEA∶Bis=29∶1.0，Rf=0.24

三種不同配比的HEA-Bis凝膠均可把蛋白marker清晰分開，蛋白marker指示BSA蛋白分子量正確，BSA的條帶染色后清晰度良好。3張圖片進行比較，HEA∶Bis=29∶0.8的凝膠中BSA蛋白的位置相對較好，令人滿意。在5mL濃縮膠中加入的TEMED的量為12.5μL，2mL分離膠中加入的TEMED的量為5μL較為適宜。溶溶配制過程中，無明顯氣味產(chǎn)生，且該凝膠具有較好的力學(xué)性能，不易碎膠，膠孔筆直整潔，是一種較好的丙烯酰胺替代材料，但仍有待于用Western Blot技術(shù)進行驗證。

2.4將優(yōu)化好的HEA凝膠與聚丙烯酰胺凝膠應(yīng)用于Western Blot技術(shù)Western Blot結(jié)果如圖6所示：

圖6　聚丙烯酰胺凝膠與N-（2-羥乙基）聚丙烯酰胺凝膠通過Western Blot技術(shù)檢測蛋白

經(jīng)照膠儀掃描后的結(jié)果如圖6所示，聚丙烯酰胺凝膠和N-（2-羥乙基）聚丙烯酰胺凝膠對7.5μg和1.5μg的BSA蛋白均有很好的顯示作用，7.5μg的蛋白條帶深且寬，1.5μg的蛋白淺且窄。兩種凝膠相比較而言，聚丙烯酰胺凝膠的條帶更深更寬大，而N-（2-羥乙基）丙烯酰胺形成的凝膠對蛋白的富集作用更好，有望成為丙烯酰胺的替代材料。

3　結(jié)論

N-（2-羥乙基）丙烯酰胺（HEA）可代替丙烯酰胺作為凝膠聚合的單體原料，且原料溶中HEA與Bis的配比為29∶0.8時凝膠孔徑較為適宜，可將蛋白質(zhì)指示至合適位置；5mL分離膠體系中加入50 μL10%過硫酸銨溶溶，12.5μLTEMED溶；2mL濃縮膠體系中加入50μL10%過硫酸銨溶溶，5 μL TEMED溶可使凝膠在室溫條件下平穩(wěn)有速聚合。

[1] LoPachin RM.Acrylamide neurotoxicity：Neurological，morphological and molecular endpoints in animal models[J].Adv Exp Med Biol，2005；（561）：21-37.

[2] e-response analyses for cancer and noncancer effects[J].Crit Rev Toxicol 2006；（36）：481-608.

Study on Low Toxic Substitute Materials of Polyacrylamide Gel

Wang Guo-yu，Yang Mei-juan，Wang Jun-xiu，Wang Lei，Yang Zhi-wei，Yu Chang-yuan

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Polyacrylamide gel electrophoresis is widely used in molecular biology experiments.But acrylamide has potential neurotoxicity.We used n，N-dimethylacrylamide（DMA）and N-（2-hydroxyethyl）acrylamide（HEA）two monomer material instead of acrylamide by protein gel.Through the determination of polymerization temperature changes in the reaction system，optimization of the added amount of catalyst TEMED system；through the actual electrophoresis experiments to determine the monomer and crosslinking agent with N，N-methylene bis acrylamide ratio of the proper pore size of the gel，and make preliminary evaluation of the performance of the two gels.Finally，the optimization of the good conditions of the gel is applied to Blot Western technical analysis and detection of BSA protein，protein bands bright and clear.

polyacrylamide gel；low toxicity；material

TE39

B

1003-6490（2016）03-0055-03

2016-03-09

感謝國家自然科學(xué)基金（81273631，31400915）和中央高校業(yè)務(wù)經(jīng)費（12060070031，12060090029，12060026025）對本研究提供的資金支持。

王國瑀（1989—），男，天津人，碩士在讀，主要從事聚丙烯酰胺凝膠替代材料研究的工作。