二甲氧芐啶在雞排泄物中的排泄研究

王嘉鵬，陳　紅，劉海生，權(quán)　丹，周雨卉，潘麗花，曾振靈

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

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二甲氧芐啶在雞排泄物中的排泄研究

王嘉鵬，陳紅，劉海生，權(quán)丹，周雨卉，潘麗花，曾振靈*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/廣東省獸藥研制與安全評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642)

以高效液相色譜法測定雞排泄物中的二甲氧芐啶的濃度，研究雞口服二甲氧芐啶在排泄物中的排泄規(guī)律。選用20只白羽肉雞隨機(jī)分為2組，分別按體重口服10、20 mg·kg-1的二甲氧芐啶，在給藥后的2、4、8、16、24、32、48、72 h收集雞的所有排泄物。采用HPLC法測定雞排泄物中二甲氧芐啶的濃度。給藥后原形藥物很快隨排泄物排出體外，10 mg·kg-1體重劑量組總排泄原形藥物占給藥劑量的21.63%，20 mg·kg-1體重劑量組總排泄原形藥物占給藥劑量的24.13%。由此可知，二甲氧芐啶在雞體內(nèi)原形藥物在排泄物中排泄不完全，可能存在其他代謝物和原形藥物的葡萄糖醛酸結(jié)合物。

二甲氧芐啶；雞；排泄物；排泄

二甲氧芐啶(DVD)，商品名為敵菌凈，化學(xué)名為2，4-二氨基-5-(3′，4′-二甲氧基芐基)嘧啶。二甲氧芐啶為動(dòng)物專用抗菌增效劑，能增強(qiáng)磺胺藥和多種抗生素的療效?？咕V較廣，對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抗菌作用。二甲氧芐啶與磺胺對甲氧嘧啶或磺胺喹噁啉配伍制成預(yù)混劑可用于防治禽、兔球蟲病及畜禽腸道感染等[1]。DVD單獨(dú)應(yīng)用時(shí)也具有防治球蟲的作用[2]?？咕幬镞M(jìn)入畜禽體內(nèi)后，除少部分藥物以原形或代謝產(chǎn)物方式蓄積于組織、器官以及蛋奶等產(chǎn)品中，絕大多數(shù)將以原形化合物或代謝物的形式經(jīng)糞便、尿液等途徑排出，由于這些原形藥物或代謝物仍具有生物效應(yīng)，其可對土壤、水體等環(huán)境產(chǎn)生不良影響[3]，并通過食物鏈對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生毒害作用，影響植物、動(dòng)物和微生物的正常生命活動(dòng)，最終影響人類的健康[4-6]。二甲氧芐啶在雞排泄物中的排泄規(guī)律研究尚未見報(bào)道，本試驗(yàn)建立固相萃取-高效液相色譜檢測雞排泄物中二甲氧芐啶的方法，對二甲氧芐啶在雞排泄物中的排泄進(jìn)行研究，為其臨床合理用藥和生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)的合理評價(jià)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(配備紫外檢測器及自動(dòng)進(jìn)樣器)：美國Waters公司生產(chǎn)，型號Waters2695；高速冷凍離心機(jī)：Thermo Fisher Scientific公司生產(chǎn)；可調(diào)微量移液器：法國Gilson公司；FJ-200漩渦混懸器：上海滬西分析儀器廠；電子分析天平：日本/島津AUW120D型；超純水器：美國Milli2Q公司；固相萃取裝置：Waters PIN WAT 058833，美國Waters公司；固相萃取小柱：Anpelclean MCX 混合型陽離子交換萃取柱(編號為SBEQ-CA3279-10)。

1.2藥物與試劑

二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品(含量100%)，購自中國藥品生物制品檢定所。二甲氧芐啶原料藥(含量90.0%，批號20120101)，由廣東大華農(nóng)動(dòng)物保健股份有限公司提供。乙酸、乙酸乙酯、氨水、磷酸二氫鉀等均為國產(chǎn)分析純試劑。甲醇、乙腈、均為色譜純，Oceanpark公司產(chǎn)品。

二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，密封，置于-20 ℃保存，使用期6個(gè)月。臨用前，以流動(dòng)相稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

供試雞為20日齡體重相近健康狀況良好的白羽肉雞，公母各半，體重在0.9～1.0 kg，購于廣州增城市某雞場，試驗(yàn)前自由飲水，每天飼喂2次，預(yù)飼飼料為不含抗菌藥物的全價(jià)雞飼料。預(yù)飼一周后(收集所有雞排泄物作為空白雞排泄物)用于正式試驗(yàn)。20只雞隨機(jī)分為A、B兩組，每組10只，分別放置單獨(dú)的代謝籠中飼養(yǎng)，每個(gè)籠子下面放置托盤收集排泄物，試驗(yàn)前一天停喂飼料。采用口服(灌胃)給藥方式，A、B兩組分別以10 mg·kg-1、20 mg·kg-1體重單次給藥。每次飼喂飼料以每只雞50 g為標(biāo)準(zhǔn)，自由飲水，在給藥后的2、4、8、16、24、32、48、72 h分別收集所有新鮮排泄物，所采樣品貯存于-20 °C，臨用前室溫解凍。

1.4 樣品前處理

取1 g雞排泄物，加入2 mL 2 mol·L-1的NaOH溶液，渦旋混勻后加入5 mL乙酸乙酯，振蕩超聲15 min，在水平振蕩器300 mot·min-1振蕩20 min，以8 000 r·min-1離心10 min，將上層轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，用5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取殘?jiān)?，合并提取液并向其加? mL乙酸混勻待過柱。

把好人員健康和個(gè)人衛(wèi)生關(guān)。建立并執(zhí)行從業(yè)人員健康管理制度。從業(yè)人員每年必須進(jìn)行健康體檢，患有霍亂、傷寒、甲型病毒性肝炎等消化道傳染病，以及患有活動(dòng)性肺結(jié)核、化膿性或者滲出性皮膚病等有礙食品安全的人員，不得從事接觸直接入口食品的工作。實(shí)行“晨檢制度”，一旦發(fā)現(xiàn)有發(fā)熱、腹瀉、皮膚傷口或感染、咽部炎癥等有礙食品衛(wèi)生病癥的，應(yīng)立即脫離工作崗位，待查明原因、排除有礙食品衛(wèi)生的病癥或治愈后，方可重新上崗[5]。操作時(shí)要穿戴清潔的工作衣、帽，不留長指甲、不涂指甲油，工作前認(rèn)真洗手，加工冷食和生食食品時(shí)最好戴一次性手套、口罩。

過柱：MCX混合陽離子交換柱依次用3 mL甲醇，3 mL 0.1 mol·L-1HCl活化，將提取液過柱，速度不宜過快，過柱后依次用3 mL 0.1 mol·L-1HCl、3 mL甲醇淋洗柱子，淋洗后負(fù)壓抽干。用5 mL 4%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，45 ℃在N2下吹干，以1 mL流動(dòng)相復(fù)溶，離心過膜，待HPLC上機(jī)檢測。

1.5色譜條件

色譜柱：C18柱(150 mm×2 mm，5 μm，Agilent)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(磷酸二氫鉀)=18∶82；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：25 ℃；UV檢測波長：276 nm。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

稱量1 g空白雞排泄物，加入二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)工作液，添加后的線性范圍為0.1～50 mg·kg-1，用上述“1.4”方法對其進(jìn)行處理，并按“1.5”液相條件進(jìn)行測定。每個(gè)樣品做5個(gè)平行，以藥物峰面積平均值為縱坐標(biāo)y，相對應(yīng)的二甲氧芐啶質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x(mg·kg-1)做線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.7檢測限和定量限的確定

稱量1 g空白雞排泄物，加入二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)液，添加后的質(zhì)量濃度為 0.02、0.05、0.1 mg·kg-1，用上述“1.4”方法對其進(jìn)行前處理，并按“1.5”液相條件進(jìn)行測定，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行，以S/N≥3 計(jì)算檢測限(LOD)，以S/N≥10計(jì)算定量限(LOQ)。

1.8絕對回收率及變異系數(shù)測定

回收率=Ax/As×100%

注：Ax為處理樣品后檢測的二甲氧芐啶峰面積；As為對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測的二甲氧芐啶峰面積。

1.9樣品中二甲氧芐啶的濃度測定

各時(shí)間階段內(nèi)雞排泄物按“1.4”方法處理，以“1.5”液相條件進(jìn)行測定，求得二甲氧芐啶的峰面積，將峰面積分別代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出二甲氧芐啶的濃度，進(jìn)而計(jì)算得到各時(shí)間段內(nèi)雞總排泄物中二甲氧芐啶的總量。

2　結(jié)　果

2.1色譜行為

在“1.5”色譜條件下，二甲氧芐啶得到了很好的分離，峰形尖銳、對稱，藥物附近未發(fā)現(xiàn)干擾峰，檢測結(jié)果定性準(zhǔn)確度高。二甲氧芐啶的保留時(shí)間在6.8 min左右，所得標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白雞排泄物、空白雞排泄物添加、實(shí)測樣品色譜圖見圖1～4。

圖1　二甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品(1 mg·L-1)色譜圖Fig.1　Chromatogram of the standard sample of diaveridine(1 mg·L-1)

圖2　空白雞排泄物色譜圖Fig.2　Chromatogram of blank chicken excreta

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

二甲氧芐啶在0.1～50 mg·kg-1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)色譜峰面積與濃度線性相關(guān)良好，其線性方程：y=30 958x+10 557，R2=0.999 7(y為色譜峰面積，x為藥物質(zhì)量濃度)，若樣品質(zhì)量濃度超出此范圍，則稀釋樣品至范圍內(nèi)測定。

2.3檢測限和定量限

按照“1.7”方法進(jìn)行測定，根據(jù)添加濃度的響應(yīng)值和空白基線的噪音值，以 S/N≥3 為檢測限，以S/N≥10為定量限，得到雞排泄物中二甲氧芐啶的檢測限(LOD)為0.05 mg·kg-1，定量限(LOQ)為0.1 mg·kg-1。

圖3　空白雞排泄物添加DVD (1 mg·kg-1)色譜圖Fig.3　Chromatogram of DVD (1 mg·kg-1) in spiked chicken excreta

圖4　雞排泄物樣品的DVD色譜圖Fig.4　Chromatogram of DVD in the sample of chicken excreta

2.4絕對回收率和變異系數(shù)

空白雞排泄物在低、中、高3個(gè)濃度添加二甲氧芐啶后，絕對回收率和精密度見表1，由表1可知，DVD在0.1、1、10 mg·kg-1質(zhì)量濃度添加下，絕對

回收率在80.49%～97.60%之間，批內(nèi)變異系數(shù)在 1.41%～11.62%，批間變異系數(shù)在4.18%～10.24%?？梢姸籽跗S啶絕對回收率較高，變異系數(shù)符合要求，該方法能夠滿足雞排泄物中二甲氧芐啶的檢測，快速、方便，穩(wěn)定可靠。

表1二甲氧芐啶的添加回收率和精密度

Table 1Recoveries and precision data of the method of DVD

%

2.5給藥后二甲氧芐啶在雞排泄物中的排泄

將HPLC分析所得二甲氧芐啶峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，可計(jì)算出不同時(shí)間段雞排泄物中DVD的濃度值，再乘以排泄物的量，即得排泄的DVD量。給藥前空白雞排泄物中未檢測出二甲氧芐啶。

由表2可知，在2—4和4—8小時(shí)時(shí)間段內(nèi)排泄二甲氧芐啶較多，10 mg·kg-1劑量組在2—4和4—8小時(shí)時(shí)間段內(nèi)平均排泄DVD原形4.72%和5.79%，20 mg·kg-1劑量組平均排泄DVD原形5.80%和7.68%。兩劑量組雞總排泄二甲氧芐啶占給藥劑量分別為21.63%和24.13%。

%

ND.不可測得

ND.Not detectable

3　討　論

3.1樣品前處理和檢測條件

藥物提取方面，一般采用相似相容原理，二甲氧芐啶和甲氧芐啶屬于極性化合物，結(jié)構(gòu)式中含有氨基屬于弱堿性物質(zhì)，幾乎不溶于水，較易溶于乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷等有機(jī)溶劑中[7]。雞排泄物屬于復(fù)雜基質(zhì)，樣品中含有大量有機(jī)質(zhì)和蛋白，前處理方法至關(guān)重要。常見的糞便提取有機(jī)試劑有三氯乙酸，Mcllvaine-EDTA，乙酸乙酯，乙腈等。二甲氧芐啶屬于弱堿性物質(zhì)，在堿性環(huán)境下更容易提取，因?yàn)樘崛A性藥物整個(gè)體系的最佳 pH 值應(yīng)高于pKa 值 1～2個(gè)pH 單位，弱堿性的化合物在弱堿性的環(huán)境中水溶性降低，這樣可以提高藥物的提取效率。余建新等[8]用堿性丙酮-乙酸乙酯對尿液和組織中的三甲氧芐啶進(jìn)行提取，陳麗等[9]和林海丹等[10]用堿性二氯甲烷對雞組織中的敵菌凈(二甲氧芐啶)進(jìn)行提取。元波等[11]用堿性乙酸乙酯對豬糞便中二甲氧芐啶進(jìn)行提取。筆者比較了上述提取劑發(fā)現(xiàn)，三氯乙酸，Mcllvaine-EDTA，乙腈在提取藥物過程中需要旋干等操作，容易導(dǎo)致藥物損失回收率降低。而乙酸乙酯在堿性條件下對DVD提取充分，操作過程簡單回收率高。

凈化方面，由于雞排泄物成分復(fù)雜，提取劑提取過程中會(huì)相應(yīng)提取其他雜質(zhì)成分，會(huì)對DVD的檢測造成較大的基質(zhì)干擾，需要進(jìn)一步的凈化。凈化方面主要采用固相萃取法，固相萃取法有著溶劑用量小、方便快捷、除雜質(zhì)并富集目標(biāo)藥物等特點(diǎn)。根據(jù)藥物的不同化學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適當(dāng)?shù)墓滔噍腿⌒≈鶅艋崛∫?。對于磺胺類藥物來說，常見的固相萃取小柱有HLB、堿性氧化鋁、C18小柱及各種離子交換小柱MCX、PCX、WAX等。羅浩師[12]用MCX凈化提取液。筆者在摸索凈化方法時(shí)比較了HLB和MCX小柱，發(fā)現(xiàn)MCX凈化效果好且回收率較高，而HLB回收率較低。這可能是因?yàn)镸CX小柱是兼有反相和陽離子吸附混合機(jī)理的固相萃取小柱，經(jīng)過酸化的MCX小柱能強(qiáng)烈吸附帶正電荷的堿性化合物從而被保留，只有通過改變pH值才能使藥物洗脫下來，故最終選擇MCX小柱凈化。

檢測方面，王小慶等[13]用液相色譜法對豬糞便中三種獸藥及代謝物進(jìn)行檢測，元波等對液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬糞便排泄物中的二甲氧芐啶進(jìn)行了研究。高效液相色譜法檢測糞便中藥物比較普遍。而用高效液相色譜法檢測雞排泄物中二甲氧芐啶的濃度尚未報(bào)道，筆者通過摸索DVD的液相方法最后確定流動(dòng)相等條件，所得結(jié)果能滿足二甲氧芐啶在雞糞中的濃度檢測要求。

3.2二甲氧芐啶在雞體內(nèi)的消除

二甲氧芐啶內(nèi)服吸收很少，其最高血液濃度約為甲氧芐啶的1/5，在胃腸道內(nèi)的濃度較高，主要從糞便排出體外，主要用作腸道抗菌增效劑。王輝(H.Wang)等[14]對二甲氧芐啶在雞排泄物中的代謝物進(jìn)行了鑒定，報(bào)道了DVD在雞體內(nèi)的代謝研究，提出了DVD在雞體內(nèi)的主要代謝方式和代謝途徑，其中去甲基化和羥基化以及隨后與葡萄糖醛酸結(jié)合是雞體內(nèi)的主要代謝方式。代謝產(chǎn)物及葡萄糖醛酸結(jié)合物因沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)無法定量分析，未能確定主要排泄物。本試驗(yàn)研究了DVD原形藥物在雞排泄物中的排泄規(guī)律，在給藥后的2 h內(nèi)即可從排泄物中檢測到DVD，說明藥物在雞消化道停留時(shí)間很短，很快以糞尿混合物的形式排出體外。由結(jié)果可知，兩劑量組DVD原形藥物排泄總量占給藥量的21.63%和24.13%，說明了在給藥劑量增大的情況下，藥物排泄的量也增加。郝增坤[15]通過磺胺氯吡嗪鈉、二甲氧芐啶溶液在雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)和組織殘留消除研究，內(nèi)服給藥后，DVD生物利用度為67.48%，6 h左右血藥濃度峰值。兩劑量組在2—8小時(shí)時(shí)間段內(nèi)雞排泄物回收藥量最多，分別占給藥劑量的10.51%的13.48%。王輝研究發(fā)現(xiàn)，DVD去甲基化和羥基化以及隨后與葡萄糖酸酸結(jié)合是雞體內(nèi)的主要代謝方式。結(jié)合本試驗(yàn)，兩劑量組排泄DVD量分別為21.63%和24.13%，部分藥物可能以代謝物和葡萄糖醛酸結(jié)合物形式隨排泄物排出體外，由于葡糖糖醛酸結(jié)合物具有較高的水溶性，難以提取和凈化，一般將其水解為游離藥物然后測定。D.Courtheyn等[16]應(yīng)用β-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶水解尿液中的結(jié)合物達(dá)到了提高回收率的目的。上述兩種酶是否可提高二甲氧芐啶在雞排泄物中的濃度，需進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

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(編輯白永平)

Studies on Excretion of Diaveridine in Chicken Excreta

WANG Jia-peng，CHEN Hong，LIU Hai-sheng，QUAN Dan，ZHOU Yu-hui，PAN Li-hua，ZENG Zhen-ling*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SouthChinaAgriculturalUniversity/GuangdongProvincialKeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticsDevelopmentandSafetyEvaluation，Guangzhou510642，China)

A high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the determination of diaveridine in chicken excreta to explore excretion regularity of diaveridine in chicken excreta.Twenty healthy white feather broiler chickens were randomly divided into 2 groups of 10 chickens each，the 2 groups were orally administered at a dosage of 10，20 mg·kg-1body weight of diaveridine，respectively.The all excreta of chicken were collected at 2，4，8，16，24，32，48，72 h，respectively.The concentration of diaveridine was analyzed by HPLC.Diaveridine was excreted quickly with excreta after oral administration.The total recovery of diaveridine was 21.63% at a dosage of 10 mg·kg-1body weight and 24.13% at a dosage of 20 mg·kg-1body weight，respectively.The results indicate that prototype drug of diaveridine in chicken is incompletely excreted，and there probably exist other metabolites and glucuronide conjugates of prototype drug in the excreta.

diaveridine；chickens；excreta；excretion

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.020

2016-03-04

廣東省自然科學(xué)基金研究團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(S2012030006590)；農(nóng)業(yè)部獸藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修訂項(xiàng)目[農(nóng)財(cái)發(fā)(2015)]

王嘉鵬(1989-)，男，河南開封人，碩士生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究，E-mail：18819474891@163.com

曾振靈(1963-)，男，教授，博士，E-mail：zlzeng@scau.edu.cn

S859.7

A

0366-6964(2016)08-1682-07