貴州省鴨源新城疫病毒強(qiáng)毒株的遺傳變異分析及致病性研究

段志強(qiáng)，許厚強(qiáng)，嵇辛勤，陳　強(qiáng)，胡　炎，胡順林，劉秀梵*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；3.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

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貴州省鴨源新城疫病毒強(qiáng)毒株的遺傳變異分析及致病性研究

段志強(qiáng)1，2，許厚強(qiáng)1，2，嵇辛勤1，2，陳強(qiáng)1，胡炎1，胡順林3，劉秀梵3*

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025；3.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

為了科學(xué)理解家鴨在新城疫病毒(NDV)流行和傳播中的作用，對(duì)貴州不同地區(qū)分離的5株鴨源NDV強(qiáng)毒株進(jìn)行遺傳變異分析以及對(duì)鴨和SPF雞的致病性研究。結(jié)果顯示：5株NDV分離株均屬于基因Ⅶd亞型，其F蛋白裂解位點(diǎn)基序均為112RRQKRF117，符合強(qiáng)毒株序列特征，與病毒致病性指數(shù)測(cè)定結(jié)果相符；F和HN蛋白中功能性氨基酸位點(diǎn)均高度保守，但在HN蛋白線性表位區(qū)有3株發(fā)生E347K突變。交叉血凝抑制試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota的抗原同源性較低(為83.3%～87.0%)，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性較高(為93.5%～100%)。將5株NDV分離株以0.5 mL病毒尿囊液原液通過(guò)肌肉注射感染鴨后未見(jiàn)明顯發(fā)病死亡和病理變化，并且除脾外在其他多個(gè)組織臟器未能檢測(cè)到病毒復(fù)制；而以106.0ELD50·0.1 mL-1劑量通過(guò)滴鼻點(diǎn)眼感染SPF雞后6 d內(nèi)100%發(fā)病死亡，病死雞表現(xiàn)出新城疫典型的臨床癥狀和病理變化，病毒在多個(gè)組織臟器中均能復(fù)制且對(duì)脾、胸腺和法氏囊等免疫器官損傷嚴(yán)重。另外，SPF雞攻毒后喉頭和泄殖腔棉拭病毒分離率明顯高于試驗(yàn)鴨。本研究結(jié)果表明，貴州省鴨群中流行的基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株HN蛋白發(fā)生E347K突變的變異株呈上升趨勢(shì)，并與傳統(tǒng)疫苗株產(chǎn)生抗原差異；5株鴨源NDV強(qiáng)毒株對(duì)鴨和雞致病性差異顯著，雖然對(duì)鴨無(wú)明顯致病性，但鴨感染后可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)喉頭或泄殖腔向體外排毒，因此必須采取有效措施防止NDV強(qiáng)毒由鴨群向雞群的傳播。

新城疫病毒；基因Ⅶd亞型；遺傳變異；致病性

新城疫(Newcastle disease，ND)是由禽副黏病毒Ⅰ型新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)感染禽類(lèi)所引起的一種急性、高度傳染性疾病，是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一，給多國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。ND自1926年被確認(rèn)以來(lái)，經(jīng)過(guò)世界范圍內(nèi)的四次大流行，其宿主范圍明顯擴(kuò)大，迄今能自然或人工感染的禽類(lèi)已超過(guò)250余種。水禽被認(rèn)為是NDV的天然儲(chǔ)存宿主，ClassⅠ中的基因1型和ClassⅡ中的基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型和Ⅸ型NDV均可從水禽中分離到[2]。過(guò)去一般認(rèn)為水禽對(duì)NDV強(qiáng)毒株抵抗力強(qiáng)，即使感染也不會(huì)引起發(fā)病和暴發(fā)或流行。然而自1997年以來(lái)，國(guó)內(nèi)多個(gè)省份均有水禽(主要是鵝)感染NDV發(fā)病死亡的報(bào)道，并呈擴(kuò)大流行趨勢(shì)[3]。對(duì)我國(guó)NDV分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，感染并導(dǎo)致水禽發(fā)病死亡的主要是基因Ⅶ型和Ⅸ型NDV，其中又以基因Ⅶ型NDV強(qiáng)毒株占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[4-6]。值得注意的是，雖然有些基因Ⅶ型NDV毒株對(duì)家鴨的致病力不強(qiáng)，但是人工感染鵝或雞后卻能造成嚴(yán)重的發(fā)病和死亡[7-8]。因此，要高度警惕家鴨攜帶的NDV強(qiáng)毒向雞群或鵝群傳播而對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成的嚴(yán)重威脅和損失，有必要加強(qiáng)對(duì)家鴨NDV的監(jiān)測(cè)力度。

三穗麻鴨是我國(guó)四大蛋系麻鴨之一，同時(shí)也是貴州省地方優(yōu)良畜禽品種。近年來(lái)，三穗麻鴨產(chǎn)業(yè)已成為貴州省特色優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)，但隨著其規(guī)?；B(yǎng)殖的快速發(fā)展同樣導(dǎo)致了多種傳染病的發(fā)生。為了解當(dāng)前NDV強(qiáng)毒株在三穗麻鴨中的流行和遺傳變異情況及其致病性，作者實(shí)驗(yàn)室從2014年6月至2015年12月對(duì)貴州省不同地區(qū)的三穗麻鴨進(jìn)行NDV監(jiān)測(cè)，分離得到5株NDV強(qiáng)毒株。作者進(jìn)行了病毒的遺傳變異分析和針對(duì)鴨和SPF雞的致病性研究，以期對(duì)更好地理解家鴨在NDV流行和傳播中的作用，以及為ND的科學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1病毒

鴨源NDV分離株Duck/China/Guizhou/SS1/2014(SS1)、Duck/China/Guizhou/ZY/2014(ZY)、Duck/China/Guizhou/SS2/2015(SS2)、Duck/China/Guizhou/TZ/2015(TZ)、Duck/China/Guizhou/JH/2015(JH)系從貴州不同地區(qū)病死三穗麻鴨臟器或健康鴨泄殖腔棉拭子中分離，用NDV、禽流感H5和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行病毒鑒定。NDV分離株經(jīng)蝕斑純化3次后用9～11日齡SPF雞胚進(jìn)行病毒擴(kuò)增，收集陽(yáng)性雞胚尿囊液用于病毒的序列測(cè)定、生物學(xué)特性鑒定以及動(dòng)物試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)鴨、SPF雞胚和SPF雞

7日齡三穗麻鴨購(gòu)自貴州三穗縣興綠洲農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，飼養(yǎng)至15日齡(經(jīng)ND抗體檢測(cè)陰性)進(jìn)行攻毒。SPF雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；SPF雞由SPF雞胚自行孵化并于潔凈動(dòng)物房中飼養(yǎng)至30日齡用于攻毒試驗(yàn)。

1.3主要試劑

RNA提取試劑TRIzol Reagent、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、高保真TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶和pCR2.1克隆載體購(gòu)自Invitrogen公司；DNA Gel Extraction Kit和質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自AxyGEN公司；6 nt隨機(jī)引物、瓊脂糖、DNA Marker購(gòu)自上海生物工程有限公司。

1.4病毒的生物學(xué)特性測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[9]，測(cè)定分離株的最小致死雞胚量致死雞胚平均時(shí)間(MDT)、1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)、6周齡雞翅靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)和雞胚半數(shù)致死量(ELD50)。

1.5引物合成、病毒RNA抽提及RT-PCR擴(kuò)增

病毒F和HN基因擴(kuò)增引物序列見(jiàn)參考文獻(xiàn)[10]，由上海生物工程有限公司合成。按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，用6 nt隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后用F和HN基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。膠回收PCR產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)T-A克隆后，將鑒定的陽(yáng)性質(zhì)粒送上海Invitrogen公司測(cè)序。每個(gè)樣品送3份陽(yáng)性質(zhì)粒。

1.6病毒F和HN序列分析

運(yùn)用Lasergen 7.1軟件對(duì)測(cè)序基因片段進(jìn)行拼接，應(yīng)用Clustal X1.83和MEGA 6.0對(duì)F和HN基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與從GenBank下載的NDV代表性毒株序列進(jìn)行比對(duì)分析，并根據(jù)F基因高變區(qū)47-420 nt序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹(shù)。

1.7病毒與疫苗株LaSota株和A-Ⅶ株的抗原性差異

將5株病毒分離株制備的疫苗以及LaSota和A-Ⅶ滅活疫苗(青島易邦生物工程有限公司)分別免疫4周齡SPF雞，制備單因子血清。參照文獻(xiàn)方法[11]將上述7種NDV抗原和陽(yáng)性血清進(jìn)行交叉血凝抑制(HI)試驗(yàn)，試驗(yàn)重復(fù)3次，取3次平均值。毒株間的抗原相似系數(shù)用R來(lái)評(píng)價(jià)，公式：R=(r1×r2)1/2×100%，其中r1=異源血清效價(jià)1/同源血清效價(jià)1，r2=異源血清效價(jià)2/同源血清效價(jià)2。

1.8病毒對(duì)鴨和SPF雞的致病性試驗(yàn)

1.8.1試驗(yàn)動(dòng)物分組與設(shè)計(jì)將60只15日齡試驗(yàn)鴨隨機(jī)分成6組(A1～A6)，每組10只；60只30日齡SPF雞隨機(jī)分成6組(B1～B6)，每組10只。A1～A5組用0.5 mL病毒尿囊液原液(SS1、ZY、SS2、TZ和JH株)以腿部肌肉注射途徑進(jìn)行攻毒，B1～B5組用106.0ELD50·0.1 mL-1病毒尿囊液稀釋液以滴鼻點(diǎn)眼方式進(jìn)行攻毒。A6和B6組為對(duì)照組，分別用0.5 mL和0.1 mL無(wú)菌PBS進(jìn)行肌注和滴鼻點(diǎn)眼。試驗(yàn)動(dòng)物分組情況見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)動(dòng)物分組設(shè)計(jì)

Table 1Grouping design of experimental animals

組別Group毒株Strain試驗(yàn)動(dòng)物Experimentalanimal日齡Age/day數(shù)量/只Number攻毒方式Inoculationroute攻毒劑量DoseA1SS1鴨1510肌肉注射5×108.38ELD50·0.5mL-1A2ZY鴨1510肌肉注射5×108.63ELD50·0.5mL-1A3SS2鴨1510肌肉注射5×108.34ELD50·0.5mL-1A4TZ鴨1510肌肉注射5×108.79ELD50·0.5mL-1A5JH鴨1510肌肉注射5×108.17ELD50·0.5mL-1A6*鴨1510肌肉注射0.5mLB1SS1SPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼106.0ELD50·0.1mL-1B2ZYSPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼106.0ELD50·0.1mL-1B3SS2SPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼106.0ELD50·0.1mL-1B4TZSPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼106.0ELD50·0.1mL-1B5JHSPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼106.0ELD50·0.1mL-1B6*SPF雞3010滴鼻點(diǎn)眼0.1mL

* 表示試驗(yàn)所用溶液為無(wú)菌PBS

* indidicate sterile PBS was used in the experiment to replace virus

1.8.2試驗(yàn)鴨、雞攻毒后臨床癥狀和病理變化觀察攻毒后每天觀察并記錄各組試驗(yàn)鴨和雞的精神狀態(tài)、采食變化、糞便顏色和發(fā)病死亡等情況。對(duì)病死鴨和雞進(jìn)行解剖，觀察其組織臟器的病理變化情況。

1.8.3試驗(yàn)鴨和雞喉頭、泄殖腔排毒及抗體檢測(cè)攻毒后第3、5、7和14天分別采集各組試驗(yàn)鴨和雞的喉頭及泄殖腔棉拭，經(jīng)過(guò)處理后接種10日齡SPF雞胚分離病毒，檢測(cè)喉頭和泄殖腔的排毒情況。另外，對(duì)攻毒后第7和14天存活的試驗(yàn)鴨和雞于翅靜脈采血，分離血清，用于NDV抗體滴度檢測(cè)。

1.8.4試驗(yàn)鴨和雞組織器官中病毒分布檢測(cè)攻毒后第3天分別剖殺A1～A5和B1～B5組試驗(yàn)鴨或雞，每組2只，無(wú)菌采取腦、心、肝、脾、肺、氣管、腎、胸腺、胰腺、法氏囊、腺胃和十二指腸等12種組織，于-80 ℃保存。通過(guò)接種雞胚分離病毒檢測(cè)試驗(yàn)鴨和雞組織器官中的病毒分布情況。

1.8.5試驗(yàn)鴨和雞免疫器官病理組織學(xué)觀察攻毒后第3天對(duì)剖殺的各組試驗(yàn)鴨和雞采集脾、胸腺和法氏囊，用10%中性福爾馬林溶液固定，將固定的組織樣品進(jìn)行脫水、石蠟包埋后制備病理切片，經(jīng)過(guò)常規(guī)HE染色后觀察其病理組織學(xué)變化。

2　結(jié)　果

2.15株病毒分離株的生物學(xué)特性測(cè)定

收集24 h以后死亡雞胚尿囊液進(jìn)行HA測(cè)定，分離的病毒均有血凝性；血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果顯示5株病毒與NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)均為陽(yáng)性，而與禽流感H5和H9亞型陽(yáng)性血清反應(yīng)均為陰性，說(shuō)明5株分離株均為NDV。生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果顯示，5株NDV分離株的MDT均小于60 h，ICPI均大于1.6，IVPI均大于1(表2)。根據(jù)國(guó)際獸疫局(OIE)的NDV毒力判定標(biāo)準(zhǔn)，5株病毒分離株均為強(qiáng)毒株。

[3] 吳擁政,何 杰,司林坡,等.義馬礦區(qū)深部礦井地應(yīng)力分布規(guī)律研究[J].煤炭科學(xué)技術(shù),2018,46(10):16-21.

表2本研究中5株NDV試驗(yàn)毒株信息和生物學(xué)特性

Table 2Background information of 5 NDV isolates used in this study

毒株Strain來(lái)源Source地點(diǎn)Place時(shí)間Year生物學(xué)特性BiologicalcharacteristicsMDTICPIIVPIELD50·mL-1HASS1病死鴨脾三穗縣201452h1.892.80108.388log2ZY健康鴨泄殖腔鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣201446h1.922.62108.636log2SS2健康鴨泄殖腔三穗縣201548.8h1.882.74108.347log2TZ健康鴨泄殖腔天柱縣201550h1.782.55108.798log2JH健康鴨泄殖腔劍河縣201552h1.722.74108.177log2

2.2F基因序列同源性及遺傳進(jìn)化分析

對(duì)5株NDV分離株F基因編碼的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)氨基酸序列均為112RRQKRF117(表3)，符合NDV強(qiáng)毒株特征，與測(cè)定的病毒生物學(xué)特征相符。5株分離株F蛋白氨基酸序列相似性為97.8%～99.5%，其中SS1株與ZY株、SS2株與JH株相似性最高，均為99.5%，說(shuō)明分離株之間親緣關(guān)系較近。將分離株與國(guó)內(nèi)外NDV參考株F蛋白氨基酸序列進(jìn)行相似性比較分析發(fā)現(xiàn)：分離株與疫苗株LaSota及國(guó)內(nèi)經(jīng)典強(qiáng)毒株F48E8的相似性較低，分別為87.7%～88.4%和90.6%～91.9%；而與國(guó)內(nèi)基因Ⅶ型NDV流行株的相似性較高，為96.7%～99.3%。對(duì)F蛋白功能區(qū)氨基酸位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，5株分離株F蛋白中的6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)和12個(gè)半胱氨酸殘基均高度保守[12]；7個(gè)中和抗原位點(diǎn)均與當(dāng)前流行的基因Ⅶ型NDV參考株以及疫苗株LaSota相同，未出現(xiàn)變異。根據(jù)F基因高變區(qū)(47—420 nt)核苷酸序列進(jìn)一步繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示5株NDV分離株與基因Ⅶd亞型NDV參考株GM、SD09、NA-1、ZJ1等處于同一分支(圖1)，表明目前在三穗麻鴨中流行的NDV強(qiáng)毒為基因Ⅶd亞型NDV。

2.3HN基因編碼的氨基酸序列分析

5株NDV分離株HN基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1 716 bp，編碼571個(gè)氨基酸，其HN蛋白氨基酸序列相似性為97.2%～99.3%，與疫苗株LaSota的相似性較低(為87.4%～88.5%)，而與基因Ⅶd亞型NDV參考株的相似性較高(為96.0%～99.1%)。對(duì)分離株HN蛋白氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，HN蛋白中的13個(gè)半胱氨酸殘基和13個(gè)唾液酸受體結(jié)合位點(diǎn)完全保守；4個(gè)糖基化位點(diǎn)(119、341、433和481位)也完全保守；HN蛋白上5個(gè)受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域(193—201、345—353、494、513—521和569位)，僅在線性表位區(qū)345—353位氨基酸區(qū)域發(fā)生變化，其中5株NDV分離株中有3株在347位氨基酸發(fā)生了E347K的突變(表3)。

表35株NDV分離株及部分參考株F和HN基因的具體信息

Table 3TheFandHNgenes of NDV strains used in this study

毒株Strain基因型Genotype分離時(shí)間YearofisolationF基因登錄號(hào)AccessionnumberofFgeneHN基因登錄號(hào)AccessionnumberofHNgeneF蛋白裂解位點(diǎn)CleavagesiteofFproteinHN蛋白線性表位(345-353)Linearepitope(residues345-353)ofHNproteinSS1Ⅶd2014KP742770KP742770RRQKRFPDEQDYQIRZYⅦd2014KU933948KU933952RRQKRFPDKQDYQIRSS2Ⅶd2015KU933949KU933953RRQKRFPDKQDYQIRTZⅦd2015KU933950KU933954RRQKRFPDKQDYQIRJHⅦd2015KU933951KU933955RRQKRFPDEQDYQIRLaSotaⅡ1946DQ195265AY510092GRQGRLPDEQDYQIRF48E8Ⅸ1948GQ168924AY636144RRQRRFPDEQDYQIRNA-1Ⅶd1999DQ659677DQ659677RRQKRFPDEQDYQIRZJ1Ⅶd2000AF431744AF431744RRQKRFPDEQDYQIRGMⅦd2001FJ608343FJ608361RRQKRFPDKQDYQIRGuangxi11Ⅶd2003DQ485231DQ485231RRQKRFPDEQDYQIRJS-5-05-GoⅦd2005JN631747JN631747RRQKRFPDEQDYQIRSF02Ⅶd2006DQ363535DQ234582RRQKRFPDEQDYQIRXZ-9-08-ChⅦd2008GQ245812GQ245867RRQKRFPDKQDYQIRSD09Ⅶd2011HQ317395HQ317395RRQKRFPDEQDYQIR

圖1　根據(jù)NDV F基因47-420位核苷酸繪制的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹(shù)Fig.1　Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of the NDV F gene fragments (47-420 nt)

2.4病毒與疫苗株抗原差異檢測(cè)

交叉HI試驗(yàn)結(jié)果顯示，LaSota株抗血清與分離株的交叉HI效價(jià)比LaSota HI效價(jià)低1.3～2.7個(gè)滴度，A-Ⅶ株抗血清與分離株的交叉HI效價(jià)比A-Ⅶ HI效價(jià)低0.5～1.0個(gè)滴度，而分離株之間的交叉HI效價(jià)比分離株HI效價(jià)低0.3～1.5個(gè)滴度(表4)?？乖嗨菩杂?jì)算結(jié)果表明，分離株之間的抗原同源性為91.2%～96.8%，分離株與疫苗株LaSota的抗原同源性較低(為83.3%～87.0%)，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性較高(為93.5%～100%)；疫苗株LaSota與A-Ⅶ之間的抗原同源性為84.9%(表5)。以上結(jié)果表明目前流行的基因Ⅶd亞型NDV毒株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota在抗原性上存在較大差異。

表4不同NDV毒株交叉血凝抑制結(jié)果

Table 4The cross hemagglutination inhibition test among different NDV strains

毒株Strain抗血清HI效價(jià)(log2)Antibodytiter(log2)SS1ZYSS2TZJHLaSotaA-ⅦSS19.08.07.08.38.07.510.0ZY7.58.08.08.36.58.59.5SS28.77.58.07.37.58.310.0TZ8.07.07.78.06.78.79.3JH8.07.06.57.07.07.310.0LaSota8.57.08.08.07.010.09.0A-Ⅶ9.08.07.08.07.08.010.0

表5不同NDV毒株間的抗原同源性Table 5The antigen homology among different NDV strains

%

2.5試驗(yàn)鴨和雞攻毒后臨床癥狀和病理變化

試驗(yàn)鴨各攻毒組(A1～A5)和對(duì)照組(A6組)鴨的食欲、精神狀況、糞便顏色等均正常，在攻毒后的14 d內(nèi)未發(fā)現(xiàn)明顯的發(fā)病和死亡，剖檢后也沒(méi)有明顯的病理變化。

SPF雞各攻毒組(B1～B5)大多數(shù)雞于第2天開(kāi)始表現(xiàn)出食欲減退、精神沉郁、排綠色稀糞、兩腳麻痹，口角有水樣黏液流出；第3天開(kāi)始發(fā)生死亡；第5—6天攻毒組所有的雞全部死亡，死亡率為100%。剖檢發(fā)現(xiàn)病死雞的喉頭氣管、腺胃乳頭和十二指腸出血，腎腫大，脾淤血腫大并伴有壞死灶(圖略)。對(duì)照組(B6組)SPF雞食欲和精神等均正常。

2.6試驗(yàn)鴨和雞喉頭、泄殖腔排毒及抗體檢測(cè)

A1～A5組試驗(yàn)鴨以肌肉注射攻毒后喉頭、泄殖腔棉拭檢測(cè)結(jié)果顯示：A2和A4組試驗(yàn)鴨在第3、5、7和14天喉頭和泄殖腔棉拭病毒檢出率均明顯高于A1、A3和A5組，其中僅A4組試驗(yàn)鴨在第14天喉頭棉拭病毒檢測(cè)為陽(yáng)性，A1、A3和A5組試驗(yàn)鴨在14 d內(nèi)泄殖腔棉拭病毒檢測(cè)均為陰性。對(duì)照組(A6組)試驗(yàn)鴨喉頭和泄殖腔病毒檢測(cè)均為陰性(表6)。

B1～B5組SPF雞以滴鼻點(diǎn)眼方式攻毒后，各攻毒組雞在6 d內(nèi)100%死亡。從第3天開(kāi)始B1～B5組雞喉頭、泄殖腔棉拭病毒檢測(cè)均為陽(yáng)性，且B1和B4組第5天存活雞的喉頭、泄殖腔病毒分離仍為陽(yáng)性。對(duì)照組(B6組)SPF雞喉頭、泄殖腔病毒檢測(cè)為陰性(表6)。

5組試驗(yàn)鴨攻毒后的第7和14天，每組隨機(jī)取5只采血進(jìn)行NDV抗體檢測(cè)，結(jié)果表明：5組試驗(yàn)鴨在攻毒后的第7和14天均可檢測(cè)到NDV抗體，其中以A2組鴨在第7天的抗體滴度最高，為7.5 log2；各組試驗(yàn)鴨NDV抗體在第14天比第7天均有所下降(表6)，這與以往的報(bào)道結(jié)果相一致[8，13-14]。

2.7試驗(yàn)鴨和雞組織器官中病毒分布檢測(cè)

攻毒后第3天分別剖殺A1～A6和B1～B6組試驗(yàn)鴨和SPF雞，采集腦、心、肝、脾、肺、腎、氣管、腺胃、胸腺、胰腺、法氏囊和十二指腸等12種組織進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果顯示：A1～A5組試驗(yàn)鴨在脾中均可檢測(cè)到病毒，僅A2組鴨在氣管中檢測(cè)到病毒，而其他各組鴨的多個(gè)組織器官中病毒檢測(cè)均為陰性；B1～B5組攻毒后的SPF雞組織器官病毒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在各組雞的多個(gè)組織器官均能檢測(cè)到病毒，僅B1和B4組雞的肝組織中未檢測(cè)到病毒(表7)。A6和B6正常對(duì)照組試驗(yàn)鴨和SPF雞各組織器官病毒檢測(cè)均為陰性。

2.8試驗(yàn)鴨和雞免疫器官病理組織切片觀察

攻毒后第3天剖殺A2和A6組試驗(yàn)鴨，對(duì)采集的脾、胸腺和法氏囊組織制備病理切片，觀察結(jié)果顯示：攻毒組鴨的脾有輕微出血，胸腺和法氏囊無(wú)病理組織學(xué)變化；正常對(duì)照組(A6組)鴨的脾、胸腺、法氏囊病理組織學(xué)觀察均表現(xiàn)正常(圖2)。

攻毒后第3天 B2組SPF雞免疫器官組織病理學(xué)觀察結(jié)果顯示：雞脾有多個(gè)壞死灶和顯著的淋巴細(xì)胞減少；胸腺中有明顯的壞死、組織增生以及淋巴細(xì)胞減少，胸腺小體結(jié)構(gòu)被破壞；法氏囊中有大面積的壞死、濾泡髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞明顯減少。正常對(duì)照組(B6組)SPF雞的免疫器官病理組織學(xué)觀察正常(圖3)。

3　討　論

自20世紀(jì)90年代以來(lái)，亞洲和非洲的許多國(guó)家和地區(qū)一直處于由基因Ⅶ型NDV毒株所引起的第4次大流行之中，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15]。對(duì)我國(guó)不同省份的NDV分子流行病學(xué)調(diào)查研究表明，基因Ⅶd亞型NDV是造成我國(guó)家禽ND暴發(fā)與流行的主要因素和主要優(yōu)勢(shì)流行毒株[4-6]。本研究從貴州省不同地區(qū)病死或健康三穗麻鴨中分離得到5株基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株，對(duì)病毒囊膜表面糖蛋白F和HN序列分析發(fā)現(xiàn)，分離株F和HN蛋白中重要的功能性氨基酸位點(diǎn)均高度保守，未發(fā)生變異。有研究表明，HN蛋白上的線性表位區(qū)(345—353位氨基酸)是一個(gè)重要的受體結(jié)合區(qū)域，其中347位氨基酸多數(shù)為E[16]，但是2005年以后的研究發(fā)現(xiàn)NDV由E→K的變異株在逐年增加。2007年S.H.Cho等[17]首先報(bào)道了這種基因Ⅶd亞型NDV變異株的存在，并且這類(lèi)變異株已成為韓國(guó)當(dāng)前的主要流行毒株。2008年姚春峰等[18]對(duì)國(guó)內(nèi)分離的15株基因Ⅶd亞型NDV進(jìn)行了遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)15株NDV中有3株發(fā)生了E347K的突變；而2009年吳雙等[19]從16株NDV中發(fā)現(xiàn)了5株E347K突變的毒株。我們對(duì)貴州省近兩年分離的5株NDV分析發(fā)現(xiàn)其中有3株NDV發(fā)生了E347K的突變，說(shuō)明此類(lèi)變異株在我國(guó)呈增多的趨勢(shì)。這可能與當(dāng)前ND疫苗大規(guī)模、高劑量的頻繁使用有關(guān)，應(yīng)該引起相關(guān)研究者的關(guān)注和深入研究。

目前普遍認(rèn)為ND疫苗株與當(dāng)前流行株之間的基因型和抗原性差異是引起禽群免疫失敗的主要原因。國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果顯示：傳統(tǒng)疫苗株LaSota雖然對(duì)不同基因型的NDV強(qiáng)毒流行株能產(chǎn)生完全的臨床保護(hù)，但是并不能防止流行株在免疫禽群中的感染復(fù)制和排毒[20-21]；只有當(dāng)疫苗株與流行株的基因型一致時(shí)，不僅能提供理想的臨床保護(hù)，還能顯著降低免疫禽群的強(qiáng)毒感染率和排毒量[22]。本研究分離的5株NDV強(qiáng)毒株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota的F和HN蛋白相似性均較低，分別為87.7%～88.4%和87.4%～88.5%。同時(shí)，交叉HI試驗(yàn)也顯示5株分離株與疫苗株LaSota之間的抗原同源性?xún)H為83.3%～87.0%，而與新型基因Ⅶ型疫苗株A-Ⅶ的抗原同源性達(dá)93.5%～100%，表明目前貴州省NDV流行株與傳統(tǒng)疫苗株在抗原性上存在較大差異，而與新型疫苗株的抗原性差異小。因此，使用新型ND疫苗對(duì)控制我國(guó)當(dāng)前ND的發(fā)生和流行具有較大的優(yōu)勢(shì)[23]。

a.A2組脾出血；b.A2組胸腺無(wú)明顯病變；c.A2組法氏囊無(wú)明顯病變；d.A6組脾正常；e.A6組胸腺正常；f.A6組法氏囊正常a.Hemorrhage in the spleen of A2 group；b.No obvious thymus lesions in the A2 group；c.No obvious bursa lesions in the A2 group；d.Normal spleen in the A6 group；e.Normal thymus in the A6 group；f.Normal bursa in the A6 group圖2　試驗(yàn)鴨免疫器官組織病理學(xué)觀察(200×)Fig.2　Histopathology on immune organs from infected ducks (200×)

a.B2組脾壞死、淋巴細(xì)胞減少；b.B2組胸腺壞死、組織增生、淋巴細(xì)胞減少以及胸腺小體被破壞；c.B2組法氏囊壞死、濾泡髓質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞減少；d.B6組脾正常；e.B6組胸腺正常；f.B6組法氏囊正常a.Necrosis and decrease of lymphocytes in the spleen of B2 group；b.Necrosis，hyperblastosis，decrease of lymphocytes and destruction of thymic corpuscle in the thymus of B2 group；c.Necrosis and decrease of follicular medulla area lymphocytes in the bursa of B2 group；d.Normal spleen in the B6 group；e.Normal thymus in the B6 group；f.Normal bursa in the B6 group圖3　試驗(yàn)雞免疫器官組織病理學(xué)觀察(200×) Fig.3　Histopathology on immune organs from infected chickens (200×)

有研究表明，相比鴨群而言，基因Ⅶd亞型NDV在雞群和鵝群中具有更強(qiáng)的生存優(yōu)勢(shì)[23]，表現(xiàn)為對(duì)雞和鵝具有高度致病性，而對(duì)鴨的致病性較低。本研究將NDV分離株分別以0.5 mL病毒尿囊液原液通過(guò)肌肉注射途徑感染試驗(yàn)鴨，在攻毒后的14 d內(nèi)鴨均無(wú)明顯的臨床癥狀，組織臟器病理學(xué)變化也不明顯，并且除脾外其他多個(gè)組織未能檢測(cè)到病毒復(fù)制，表明鴨對(duì)這5株基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株抵抗力較強(qiáng)，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致[8，13-14]。然而劉梅等[24]和Y.Dai等[25]同樣用基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株通過(guò)腿部肌肉注射0.2 mL病毒尿囊液原液感染15日齡麻鴨后4～6 d試驗(yàn)鴨100%發(fā)病死亡，這可能與試驗(yàn)所用的毒株和試驗(yàn)鴨品種有關(guān)。此外，SPF雞的攻毒試驗(yàn)結(jié)果表明，以106.0ELD50·0.1mL-1劑量經(jīng)滴鼻點(diǎn)眼感染SPF雞后6 d內(nèi)100%發(fā)病死亡，病死雞表現(xiàn)出ND典型的臨床癥狀和病理變化，病毒在多個(gè)組織臟器中均能復(fù)制且對(duì)脾、胸腺和法氏囊等免疫器官損傷嚴(yán)重。這與“基因Ⅶd亞型NDV可引起家禽免疫器官更為嚴(yán)重的組織病理?yè)p傷”報(bào)道結(jié)果一致[26]。排毒試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攻毒后第3天試驗(yàn)雞100%通過(guò)喉頭和泄殖腔同時(shí)排毒，而試驗(yàn)鴨中僅個(gè)別鴨可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)喉頭或泄殖腔排毒，說(shuō)明NDV強(qiáng)毒在雞體內(nèi)的復(fù)制與增殖效率明顯高于鴨，這是NDV強(qiáng)毒對(duì)雞和鴨致病性存在差異的一個(gè)重要因素。此外，研究發(fā)現(xiàn)鴨和雞在先天性免疫基因方面存在差異[27-28]，鴨的先天性免疫應(yīng)答在抵抗病毒早期感染中發(fā)揮重要作用[29]，這可能是兩者致病性存在差異的又一重要因素。

近年來(lái)，隨著水禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增長(zhǎng)，目前我國(guó)水禽飼養(yǎng)量和肉產(chǎn)量均占世界總量的75%以上。ND疫苗免疫是我國(guó)目前控制雞群和鵝群NDV感染的主要措施，但是對(duì)于鴨群是否有必要進(jìn)行ND疫苗免疫尚存在爭(zhēng)議。根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果和本研究結(jié)果來(lái)看，基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株對(duì)麻鴨無(wú)明顯的致病性，因此不必對(duì)貴州省三穗麻鴨群進(jìn)行廣泛的疫苗免疫接種。但值得注意的是，雖然麻鴨感染NDV強(qiáng)毒株后不表現(xiàn)臨床癥狀，但在一定時(shí)間內(nèi)感染鴨可通過(guò)喉頭或泄殖腔向環(huán)境中排毒，有造成其他禽群接觸感染的危險(xiǎn)。因此，針對(duì)我國(guó)養(yǎng)殖地區(qū)家禽養(yǎng)殖密度高、不同禽群接觸頻率高的現(xiàn)狀，在家禽和水禽養(yǎng)殖密集區(qū)域，必須制定有效合理的ND疫苗免疫接種程序以避免NDV在水禽和家禽之間的相互傳播。

4　結(jié)　論

貴州省三穗麻鴨群中主要流行基因Ⅶd亞型NDV強(qiáng)毒株，病毒的HN蛋白發(fā)生E347K突變呈上升趨勢(shì)，并與傳統(tǒng)疫苗株產(chǎn)生較大的抗原差異。5株鴨源NDV分離株對(duì)SPF雞致病性強(qiáng)，而對(duì)麻鴨無(wú)明顯致病性，但鴨感染后可在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)喉頭或泄殖腔排毒。

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(編輯白永平)

Genetic Variation and Pathogenicity Analysis of Virulent Newcastle Disease Viruses Isolated from Ducks in Guizhou Province

DUAN Zhi-qiang1，2，XU Hou-qiang1，2，JI Xin-qin1，2，CHEN Qiang1，HU Yan1，HU Shun-lin3，LIU Xiu-fan3*

(1.CollegeofAnimalScience，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；2.KeyLaboratoryofAnimalGenetics，BreedingandReproductioninthePlateauMountainousRegionofMinistryofEducation，GuizhouUniversity，Guiyang550025，China；3.KeyLaboratoryofAnimalInfectiousDiseasesofMinistryofAgriculture，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

To better evaluate the role of domestic ducks in the epidemiology and transmission of NDV，five virulent NDV strains isolated from ducks in Guizhou Province were used to study their genetic variation and pathogenicity in ducks and SPF chickens.Sequence analysis showed that all the strains belonged to subgenotype Ⅶd NDV and had the velogenic motif112RRQKRF117in the cleavage sites of F protein，which was consistent with the results of biological tests.The functional amino acid sites in the F and HN proteins were all highly conserved，but three strains with E347K mutation were detected in the linear epitope of HN protein.Cross hemagglutination inhibition test revealed that the antigen homology of the isolates between LaSota and A-Ⅶ were 83.3%-87.0% and 93.5%-100%，respectively.In the challenge test，ducks of different groups challenged with virus allantoic fluid intramuscularly at the dose of 0.5 mL showed no obvious clinical symptoms and histopathologic changes，and viruses could not be detected in multiple tissues except for the spleen.On the contrary，SPF chickens infected with NDV strains intranasally at a dose of 106.0ELD50·0.1 mL-1died in 6 days and showed typical clinical symptoms.Viruses could replicate in multiple tissues and cause severe damages to spleen，thymus and bursa in chickens.In addition，viruses were detected more frequently in the laryngeal and cloacal swabs of chickens than ducks.These results showed that subgenotype Ⅶd NDV strains with E347K mutation on HN protein significantly increased and had the antigenic differences with traditional vaccine strain.Although all the NDV strains were virulent in chickens whereas had no obvious pathogenicity in ducks，some measures should be taken to prevent virus transmission from ducks to chickens as viruses were detected in swabs of virulent NDV infected ducks for a long time.

Newcastle disease virus；subgenotype Ⅶd；genetic variation；pathogenicity

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.013

2016-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31502074)；教育部“促進(jìn)與美大地區(qū)科研合作與高層次人才培養(yǎng)項(xiàng)目”(教外司美[2014]2029號(hào))；貴州省省校合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2014]7669號(hào))；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303033)

段志強(qiáng)(1985-)，男，湖北襄陽(yáng)人，講師，博士，主要從事家禽重要疫病發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制方面的研究，E-mail: zqduan@gzu.edu.cn

劉秀梵，Tel: 0514-87991416；E-mail: xfliu@yzu.edu.cn

S852.659.5；S855.3

A

0366-6964(2016)08-1623-12