中國部分地區(qū)鴨、鵝攜帶四種病毒狀況的調(diào)查與分析

劉　洋，王傳彬，霍斯琪，翟新驗，辛盛鵬，劉玉良，韓　雪，張　倩，楊衛(wèi)錚，顧小雪

(中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618)

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中國部分地區(qū)鴨、鵝攜帶四種病毒狀況的調(diào)查與分析

劉洋，王傳彬，霍斯琪，翟新驗，辛盛鵬，劉玉良，韓雪，張倩，楊衛(wèi)錚，顧小雪*

(中國動物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618)

為了解中國部分地區(qū)鴨、鵝的病毒攜帶情況，作者于2014年11月，從安徽、浙江、福建、廣東、廣西5省的多個表觀健康鴨、鵝群中采集樣品1 931份，采用熒光定量PCR對鴨瘟病毒(DPV)、鴨甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，DTMUV陽性率為1.2%，DPV陽性率為0.3%；其余兩種病毒均未檢出。結(jié)果表明，臨床表觀健康的鴨、鵝可攜帶鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒，而且，序列分析結(jié)果顯示，所攜帶的毒株與臨床分離的相應(yīng)致病性毒株相似性較高，提示在水禽疫病傳播過程中，表觀健康但帶毒的動物可能成為疫病傳播的風(fēng)險點。

鴨瘟病毒；鴨甲型肝炎病毒1型；小鵝瘟病毒；鴨坦布蘇病毒；流行病學(xué)調(diào)查

中國是世界上水禽飼養(yǎng)最多的國家，但由于養(yǎng)殖技術(shù)落后，飼養(yǎng)數(shù)量和飼養(yǎng)密度的不斷增加以及各省市間頻繁的活禽調(diào)運，導(dǎo)致水禽疫病愈發(fā)嚴(yán)重，出現(xiàn)“老病未除(如20世紀(jì)50年代即出現(xiàn)的鴨瘟、鴨病毒性肝炎以及小鵝瘟)、新病又起(如2010年以來我國大范圍暴發(fā)的鴨坦布蘇病毒病)”的復(fù)雜局面。另一方面，水禽疫病的相關(guān)研究大多集中于對發(fā)病動物或群體的零星報道，而對水禽整體疫病的流行情況不甚了解，尤其對健康鴨群或鵝群中相關(guān)疫病的感染情況更鮮有報道。因此，為初步了解我國水禽群體中相關(guān)疫病的隱性感染狀況，作者在我國水禽養(yǎng)殖主要產(chǎn)區(qū)的多個省市，分別從水禽養(yǎng)殖的不同環(huán)節(jié)中采集表觀健康鴨鵝的泄殖腔拭子、組織及環(huán)境樣本，進(jìn)行鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒1型、小鵝瘟病毒、鴨坦布蘇病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，以期為進(jìn)一步制定全面的監(jiān)測計劃、采取檢疫措施和科學(xué)防控水禽疫病提供參考。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器

5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit和AgPath-IDTM One-Step RT-PCR Kit購自ABI公司。GoTaq Probe qPCR Master Mix購自Promega公司。pEASY-T3 Cloning Kit購自全式金公司。7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自ABI公司，TissueLyser Ⅱ組織研磨儀購自QIAGEN公司。

1.2樣品采集和信息調(diào)查

選擇我國水禽養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)的安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省進(jìn)行樣品采集，每省選擇2個縣(市、區(qū))，根據(jù)實地情況采集鴨鵝規(guī)模場、活禽交易市場、屠宰場和自然村。每一采樣地采集表觀健康水禽咽喉/泄殖腔拭子30份，環(huán)境樣品5份，屠宰場另加采鴨肝脾組織20份。拭子樣品采集后放入含有雙抗的生理鹽水中，所有樣品置于冰盒盡快送往實驗室進(jìn)行處理，或置于-70 ℃?zhèn)溆?。在采集樣品的同時，對采樣地的水禽種類、品種，養(yǎng)殖規(guī)模，養(yǎng)殖方式，既往病史，疫苗免疫情況等方面進(jìn)行問卷調(diào)查。

1.3病毒核酸提取

取肝、脾組織樣品0.1 g于2 mL平底離心管中，加1粒鋼珠和1 mL PBS(pH7.2)，放入TissueLyser II組織研磨Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)儀中研磨5 min，10 000 r · min-1離心1 min后取上清，與拭子液和環(huán)境樣品液一同進(jìn)行核酸提取。按照5×MagMAXTM-96 Viral Isolation Kit使用說明書，采用Kingfisher Flex全自動磁珠提取純化系統(tǒng)提取病毒核酸。最后將病毒核酸洗脫至50 μL無菌去離子水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物設(shè)計和熒光定量PCR擴(kuò)增

根據(jù)國標(biāo)GB/T22332-2008中的DPV目的片段和GPV保守基因VP3全長設(shè)計熒光定量PCR引物及探針；DTMUV和DHAV-1的熒光定量PCR引物及探針(表1)分別根據(jù)S.Li等[1]和M.Yang等[2]的報道進(jìn)行設(shè)計。引物和探針由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。

DPV和GPV熒光定量PCR反應(yīng)體系為2×GoTaq Probe qPCR Master Mix 10 μL，10 pmol·L-1相應(yīng)上下游引物對0.8 μL，10 pmol·L-1探針0.4 μL，滅菌去離子水6.8 μL，病毒核酸模板2 μL，混勻后置于7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時，判定為DPV或GPV感染陽性。

DTMUV和DHAV-1熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為2×RT-PCR反應(yīng)液 10 μL，10 pmol· L-1相應(yīng)上下游引物對0.8 μL，10 pmol·L-1探針0.4 μL，25×RT-PCR酶混合液0.8 μL，滅菌去離子水6 μL，病毒核酸模板2 μL，混勻后置于7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，40個循環(huán)。出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線時，判定為DTMUV或DHAV-1感染陽性。

1.5數(shù)據(jù)分析

熒光定量PCR檢測結(jié)果為陽性則判定該動物為DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性動物，只要被檢場/村檢出1只DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性動物則判定該場/村為陽性場/村。計算各省被檢樣品的DPV/DHAV-1/GPV/DTMUV陽性率及所有被檢中小規(guī)模場、活禽交易市場、屠宰場和自然村的場/村陽性率和個體陽性率。

個體陽性率=陽性動物數(shù)/被檢動物總數(shù)×100%

場/村陽性率=陽性場(村)數(shù)/被檢場(村)數(shù)×100%

1.6陽性樣品特異性片段擴(kuò)增及序列分析

根據(jù)曹貞貞[3]報道測定DTMUV全長的19對引物，以及李昌主等[4]報道的DPVTK基因全長引物，分別選擇有代表性的DTMUV和DPV陽性樣品進(jìn)行RT-PCR和PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確定為目的片段后，連接到pEASY-T3載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1，挑取單個克隆進(jìn)行PCR鑒定。每個片段選取三個陽性克隆送北京英濰捷基公司測序。

利用Lasergene軟件，對所得序列進(jìn)行拼接，并與已發(fā)表的DTMUV及DPV代表株進(jìn)行比對，采用MEGA軟件對核苷酸相似性較高的序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析。

2　結(jié)　果

2.1調(diào)查水禽和樣品信息

共采集13個規(guī)模鴨場、8個規(guī)模鵝場、15個自然村、13個活禽交易市場和3個屠宰場的1 199份鴨咽喉/泄殖腔拭子、411份鵝咽喉/泄殖腔拭子、242份環(huán)境樣品和79份鴨肝脾組織樣品，共計1 931份。所調(diào)查規(guī)模場以飼養(yǎng)地方鴨鵝品種為主，多以自繁自養(yǎng)和活禽購入方式進(jìn)行繁育，其中水養(yǎng)場11個，旱養(yǎng)場7個，水養(yǎng)旱養(yǎng)結(jié)合的場3個。規(guī)模鴨場中蛋鴨場4個，肉鴨場9個。所調(diào)查活禽市場、自然村中有櫻桃谷、番鴨、半番鴨等肉鴨品種和麻鴨等蛋鴨品種。

2.2水禽群中的DTMUV、DPV、DHAV-1和GPV感染情況

安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省的1 931份樣品檢測結(jié)果顯示，有9.6%的水禽場/村檢出DTMUV陽性樣本，個體陽性率為1.2%(23/1 931)，陽性樣本來自廣東和廣西；有1.9%水禽場/村檢出DPV陽性樣本，個體陽性率為0.3%(4/1 520)，陽性樣本來自廣東；未檢出DHAV-1和GPV，且無混合感染的情況(表2)。

2.2.1不同來源的DTMUV和DPV感染情況在調(diào)查的2個規(guī)模鵝場、2個活禽市場和1個屠宰場的水禽中檢出DTMUV陽性樣本，其場內(nèi)陽性率分別為46.7%、2.9%、1.4%、1.8%、19.4%，自然村散養(yǎng)戶的水禽中沒有檢出DTMUV陽性樣本(表3)。根據(jù)問卷調(diào)查，DTMUV陽性屠宰場的鵝可能來源于同地區(qū)的規(guī)模鵝場。在調(diào)查的1個活禽市場的鴨中檢出DPV陽性樣本，其場內(nèi)陽性率為28.6%(表3)。

2.2.2不同樣品的DTMUV和DPV感染情況鴨咽喉/泄殖腔拭子、鵝咽喉/泄殖腔拭子中的DTMUV檢出率分別為0.2%和5.1%，鴨組織和環(huán)境樣本中沒有檢出DTMUV陽性樣本(表3)。該結(jié)果顯示，DTMUV的鵝源陽性樣本多于鴨源陽性樣本。鴨咽喉/泄殖腔拭子中的DPV檢出率為0.3%，鴨組織和環(huán)境樣本中也沒有檢出DPV陽性樣本(表3)。

2.3陽性樣品序列分析

選取廣東省DTMUV陽性規(guī)模鵝場的陽性鵝咽喉/泄殖腔拭子G23進(jìn)行該病毒的全基因組測序，由于拭子樣品病毒含量有限，3′端未能測通，已獲得的序列拼接后共10 881 nt，提交至GenBank，獲得序列號KT239021。經(jīng)比對其核苷酸序列與2011年分離自廣西蛋鴨毒株GX_2011(GenBank：KC990542)[5]相似性相似性最高，可達(dá)98.9%(10 757/10 882)；與已報道全序列的鵝源毒株相比，與2012年首次報道的鵝源毒株ZJ GH-2(GenBank：JQ314465)[6]相似性最高，為98.4%(10 709/10 882)。已獲得的序列中包含一個完整CDS，長10 278 nt，編碼3 425 aa，采用MEGA6.0構(gòu)建基于該CDS核苷酸的遺傳進(jìn)化樹，由圖1可見，G23與我國多地及泰國的分離株親緣關(guān)系較近，與馬來西亞的分離株則相對較遠(yuǎn)，其中與2013年報道的分離自廣西鴨的GX_2011和2012年報道的分離自廣東番鴨的WJ-1株親緣關(guān)系最近，位于同一分支內(nèi)，相似性達(dá)98.4%以上。

選取廣東省DPV陽性活禽市場的陽性鴨咽喉/泄殖腔拭子92D36對其TK基因進(jìn)行測序，結(jié)果顯示所測得的1 275 bp與1962年分離的CV株(GenBank：JQ673560)相似性最高，達(dá)99.9%(1 274/1 275)。

3　討　論

表觀健康的水禽亦可攜帶禽流感病毒[7]、新城疫病毒[8]，但攜帶其他水禽相關(guān)疫病病原(如鴨瘟病毒和小鵝瘟病毒)的情況則鮮有研究。我國華東、華南地區(qū)水網(wǎng)密集，一直以來都是我國水禽養(yǎng)殖的主要區(qū)域，但也是水禽疫病多發(fā)的地區(qū)。如鴨瘟、鴨病毒性肝炎和小鵝瘟等在我國已流行有五十多年的疫病近幾年在華東、華南地區(qū)也頻有發(fā)生[9]。新發(fā)水禽疫病也多從這些地區(qū)始發(fā)，2010年在我國首次暴發(fā)的水禽新疫病鴨坦布蘇病毒病就是從浙江等省最先出現(xiàn)，而后迅速蔓延至我國華北、東北等省市。因此，了解該區(qū)域表觀健康水禽攜帶病毒的情況，對科學(xué)防控水禽疫病顯得尤為重要。

本研究中作者對安徽、浙江、福建、廣東和廣西五省采集的表觀健康水禽拭子、鴨組織及環(huán)境樣本通過熒光定量PCR/熒光定量RT-PCR檢測鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒1型、小鵝瘟病毒以及鴨坦布蘇病毒。結(jié)果顯示，表觀健康鴨可從拭子樣品中檢出鴨瘟病毒，這與國外文獻(xiàn)報道的健康水禽可攜帶鴨瘟病毒[10]一致。推測是由于鴨瘟病毒能持續(xù)感染水禽，并可長期經(jīng)糞便和口分泌物進(jìn)行排毒所致。鴨瘟屬于我國二類疫病，列入疫情報告系統(tǒng)，但尚無國家主動監(jiān)測計劃和相應(yīng)的防控技術(shù)規(guī)范。該病目前尚無特效治療藥物，因此免疫預(yù)防顯得尤為重要。已批準(zhǔn)的鴨瘟疫苗有鴨瘟活疫苗、鴨瘟活疫苗(雞胚化弱毒株)、鴨瘟滅活疫苗和鴨瘟滅活疫苗(AV1221株)四種，免疫效果良好[9]。但從調(diào)查問卷反饋的情況來看，免疫情況不容樂觀。首先，規(guī)模鴨場仍存在不免疫的情況。本次調(diào)查的13個規(guī)模鴨場中進(jìn)行鴨瘟病毒免疫的僅有8個，有38%的鴨場尚不進(jìn)行免疫。其次，自然村散養(yǎng)戶對該病的免疫意識較差。本次調(diào)查共涉及15個自然村，其中養(yǎng)鴨的有44戶散養(yǎng)戶，無一免疫，增加了該病傳播的風(fēng)險。本研究中檢出的鴨瘟病毒陽性樣品來自廣東三水區(qū)某活禽市場，所采集的鴨亦未免疫，因此也排除了免疫后排毒的可能，提示存在野毒感染。

圖1　G23(框內(nèi))與多株DTMUV病毒CDS核苷酸同源進(jìn)化樹分析Fig.1　Bayesian phylogeny of the CDS nucleotide sequence of G23 (showed in frame) and DTMUV reference strains

鴨坦布蘇病毒自2010年出現(xiàn)以來，已廣泛流行于我國水禽養(yǎng)殖的多個省市[11]，目前已從鴨、番鴨、鵝、雞[12]以及麻雀[13]、鴿子[14]和蚊子[15]中發(fā)現(xiàn)該病毒，也有研究從養(yǎng)鴨場工作人員的血清和口腔拭子中檢出相應(yīng)抗體和病毒RNA[16]。由于該病毒主要感染鴨，因此研究多集中于發(fā)病鴨群，對表觀健康動物帶毒的情況尚無相關(guān)研究。本研究結(jié)果表明，表觀健康的鴨鵝亦可攜帶鴨坦布蘇病毒，同時鵝坦布蘇病毒的攜帶率高于鴨，推測這可能與不同動物宿主對該病毒的易感性存在差異有關(guān)。有文獻(xiàn)指出從病鴨泄殖腔拭子中也可分離到病毒，但本研究中采用陽性拭子液接種9日齡鴨胚和8日齡雞胚，盲傳三代均未見死亡，推測是由于表觀健康鴨鵝拭子的帶毒量有限，不足以造成胚體死亡所致。此外，本次研究中，陽性率較高的規(guī)模場和屠宰場來自廣東同一個地區(qū)，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查問卷顯示，屠宰場動物來自規(guī)模場，說明表觀健康但攜帶病原的水禽具備在環(huán)境中傳播病毒的能力。另外，鴨坦布蘇病毒在這五年間并未出現(xiàn)明顯的變異，而且分離株無明顯地域差異。本研究中表觀健康鴨鵝所攜帶的毒株與臨床分離的致病毒株相似性較高，尤其與兩廣地區(qū)的流行株親緣關(guān)系更近，綜合以上條件，這類水禽在不同地區(qū)調(diào)運過程中極易造成病毒的快速傳播，應(yīng)引起動物疫病防控部門的注意。

鴨甲型肝炎病毒1型和小鵝瘟病毒在我國流行已有50年之久，但至今仍未得到有效控制，每年還會造成雛鴨和雛鵝死亡，對水禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展影響極大[9]。這兩種疫病主要感染幼齡動物，死亡率較高，青年和成年水禽感染后多不表現(xiàn)臨床癥狀，但病毒可在體內(nèi)不斷繁殖進(jìn)而不斷排毒。本研究中所有樣品均未檢出鴨甲型肝炎病毒1型和小鵝瘟病毒，提示所檢禽群可能并未感染這兩種病毒。

4　結(jié)　論

表觀健康的鴨鵝亦可攜帶鴨坦布蘇病毒和鴨瘟病毒，且其所攜帶的毒株與臨床分離的相應(yīng)致病株相似性較高。提示在疫病傳播過程中，應(yīng)有針對性地開展水禽疫病主動監(jiān)測，防止由于表觀健康動物攜帶病原進(jìn)而造成疫病的擴(kuò)散傳播。

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(編輯白永平)

Epidemiologic Investigation of Four Viruses Carried by Ducks and Geese in China

LIU Yang，WANG Chuan-bin，HUO Si-qi，ZHAI Xin-yan，XIN Sheng-peng，LIU Yu-liang，HAN Xue，ZHANG Qian，YANG Wei-zheng，GU Xiao-xue

(ChinaAnimalDiseaseControlCentre，Beijing100126，China)

To investigate the prevalence of duck plague virus (DPV)，duck hepatitis virus type 1 (DHAV-1)，goose parvovirus (GPV) and duck Tembusu virus (DTMUV) carried by duck and goose flocks in China，1 931 samples were collected from clinically healthy ducks and geese in Anhui，Zhejiang，F(xiàn)ujian，Guangdong and Guangxi provinces in November，2014.The four viruses above were detected by real-time PCR.DTMUV and DPV were detected in these specimens with a positive rate of 1.2% and 0.3%，respectively，while no DHAV-1 or GPV was detected.Our results demonstrated the presence of DTMUV and DPV in clinically healthy duck and goose flocks，furthermore，the two viruses carried by duck and goose shared high similarities at the nucleic acid level with the corresponding clinical pathogenic strains.These findings highlight the necessity of active surveillance for healthy waterfowls，in order to prevent transmission of viruses.

duck plague virus；duck hepatitis virus type 1；goose parvovirus；duck Tembusu virus；epidemiologic investigation

10.11843/j.issn.0366-6964.2016.08.011

2016-02-29

農(nóng)業(yè)技術(shù)試驗示范項目(2130106)；科技基礎(chǔ)性工作專項(2013FY113300)

劉洋(1985-)，女，山西大同人，獸醫(yī)師，博士，主要從事水禽疫病及禽類細(xì)菌病的防控工作，E-mail：lysonna@163.com

顧小雪，E-mail：gxxjackie@163.com

S858.35.3

A

0366-6964(2016)08-1610-08