真核表達載體GV394-Nurr1的構建及鑒定

樊秀雙，郭軍堂，陳安琪

(濰坊醫(yī)學院臨床學院，山東 濰坊　261053)

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真核表達載體GV394-Nurr1的構建及鑒定

樊秀雙，郭軍堂，陳安琪*

(濰坊醫(yī)學院臨床學院，山東 濰坊261053)

目的構建含人源性Nurr1基因真核表達載體GV394-Nurr1，檢測其瞬時表達對細胞內活性氧類物質(ROS)水平的影響。方法 PCR擴增人Nurr1基因,克隆至T載體，測序正確后與真核載體GV394一起,經BamHI和XhoI雙酶切,T4 DNA連接酶連接,構建GV394-Nurr1；采用脂質體將GV394-Nurr1瞬時轉染神經母細胞瘤SH-SY5Y細胞，RT-PCR檢測Nurr1基因mRNA水平，通過DCFH-DA染色檢測Nurr1對細胞內ROS水平的影響。 結果 PCR及測序證實人Nurr1基因正確克隆至真核表達載體GV394; RT-PCR顯示Nurr1基因mRNA水平在瞬時轉染的細胞中明顯增高;DCFH-DA染色顯示瞬時轉染Nurr1的神經母細胞瘤細胞的細胞內的ROS水平峰值較對照組明顯左移。結論成功構建人源性Nurr1真核載體，可在SH-SY5Y細胞中表達并減少細胞內ROS水平，為進一步在體外研究Nurr1的功能及其與多巴胺能神經元的保護作用的關系提供了基礎。

Nurr1；真核表達載體；帕金森氏病；細胞活性氧；

帕金森氏病(Parkinson disease,PD)是與年齡相關的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為靜止性震顫、肌強直、動作徐緩、姿態(tài)異常等運動功能障礙和自主神經功能障礙。多巴胺代謝異常是PD發(fā)病的核心機制，幾乎每一種有關調控多巴胺代謝基因的多態(tài)及突變都能影響多巴胺代謝酶的含量，共同最終導致多巴胺神經元的應激損傷，多巴胺能神經元數目上相應的減少[1]。孤核受體Nurr1廣泛表達于胚胎和成體中腦黑質腹側被蓋區(qū)，作為轉錄調控蛋白在多巴胺能神經元發(fā)育和存活過程中起到了重要的作用[2]?；蚯贸齆urr1(-)的小鼠細胞免疫熒光顯示DA神經元前體細胞凋亡，最終導致中腦多巴胺能神經元發(fā)育不全[3]。本研究通過構建Nurr1真核表達載體，研究其過表達細胞內的ROS水平的影響，為研究Nurr1參與PD神經元變性的保護作用關系奠定基礎，為臨床指導Nurr1有可能作為帕金森病基因治療提供了實驗理論依據。

1　材料和方法

1.1主要試劑

大腸桿菌DH5α為本實驗保存；質粒GV394、限制性內切酶，人腦 cDNA文庫購自上海吉凱基因有限公司；Liptap脂質體、小量質粒抽提試劑盒購自碧云天公司；PCR引物、平端DNA加A試劑盒、 T載體均自上海生工； Trizol試劑、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit、 PrimeSTAR HS DNA polymerase試劑盒均購自寶生物工程大連有限公司；DCFH-DA染色試劑盒購自于Sigma公司；其余化學試劑為進口或國產化學分析純。

1.2實驗方法

1.2.1真核表達載體GV394-Nurr1的構建與鑒定

依據NCBI NM_006186.3 NR4A2基因信息設計引物，5’-TTGGTACCGAGCTCGGATCCCGCCACC ATGCCTTGTGTTCAGGCGCAG-3’，下游引物5’-ACGGGCCCTCTAGACTCGAGTTAGAAAGGTAAAG TGTCCA GG-3’。以人腦 cDNA文庫為模板，進行PCR：98℃預變性5 min，98℃變性10 s，57℃退火10 s，72℃延伸 90 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸 8 min。膠回收后的PCR產物利用平端DNA加A試劑盒進行加“A”后與pUCm- T載體連接并轉化DH5α感受態(tài)細菌。小量提取質粒DNA進行PCR及BamHI和XhoI雙酶切鑒定并送上海生工進行測序，正確克隆命名為體pCUm-T- Nurr1。BamHI和XhoI雙酶切載體GV394質粒及pCUm-T- Nurr1，將純化回收的1541bp大小的目的片段與酶切后線性化的GV394質粒用T 4DNA連接酶進行連接并轉化DH5α感受態(tài)細胞，PCR反應鑒定挑選正確的克隆，命名為GV394-Nurr1。

1.2.2瞬時轉染

培養(yǎng)神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y密度達到80%左右時，胰酶消化細胞，使每孔細胞密度達到2-6×105，均勻接種到6孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，確保第二天細胞密度能達到70-80%。按照脂質體轉染試劑說明書，將GV394-Nurr1轉染SH-SY5Y細胞，同時設空載GV394為對照組。轉染24 h后，用Trizol RNA提取試劑盒抽提總RNA，通過RT-PCR檢測Nurr1 mRNA的表達。Nurr1的PCR條件同1.2.1。內參β-actin引物：上游引物：5‘GACCCAGATCATGTTTGAGA 3 ’下游引物：5‘GCTTGCTGATCCACATCTGC3 ’ , PCR循環(huán): 98℃預變性5 min，98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸 8 min。

1.2.3DCFH-DA染色法檢測Nurr1對細胞內ROS水平影響

胰酶消化實驗組及對照組細胞，吹打成細胞懸液，1000 rpm 離心5 min，離心2次，500 μL的PBS輕輕重懸沉淀，加入工作液10 μmol/L的DCFH-DA熒光染料1 μL，室溫避光孵育15 min，流氏細胞儀上機檢測，用激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長為525 nm來檢測熒光強度。每組設置三個復孔，重復三次獨立實驗。

1.3統(tǒng)計學處理

2　結果

2.1全長人Nurr1的PCR擴增

如圖1A所示，PCR擴增出與預期產物大小一致的1541 bp人Nurr1 DNA片段。

2.2pCUm-T- Nurr1的鑒定

如圖1B所示，小量提取質粒后，PCR擴增后得到一條1541 bp左右的條帶，與預期大小一致。如圖1C所示，質粒經BamHI和XhoI限制性內切酶酶切得到一條1500 bp左右的目的條帶和2700 bp左右大pCUm-T載體條帶，與預期大小一致。 對PCR和酶切鑒定成功的pCUm-T- Nurr1克隆送上海生工進行測序, 測序結果與Genebank堿基序列完全一致。

2.3GV394-Nurr1的鑒定

重組質粒PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果，如圖1D所示，在1.5 kb左右呈現(xiàn)與Nurr1分子量大小相符DNA條帶，結果證實人Nurr1基因成功插入真核GV394載體中。

注：(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR產物；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR產物；(3)pCUm - T- Nurr1經BamH I和X hoI酶切產物；(4)GV394-Nurr1 PCR產物。圖1　瓊脂糖凝膠電泳鑒定Note.(M)DNA Marker；(1)Nurr1 PCR products；(2)pCUm-T-Nurr1 PCR products；(3)pCUm - T- Nurr1 by I BamH and hoI X enzyme digestion products；(4)GV394-Nurr1 PCR products.Fig.1　Agarose gel electrophoresis

2.4RT-PCR檢測Nurr1 mRNA表達

逆轉錄聚合酶鏈式PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果，如圖2A所示，實驗組與對照組均見特異性條帶，大小為1541 bp，實驗組較對照組條帶亮些，圖像經IPP圖像系統(tǒng)分析，如圖2B在內參灰度值大致相同的情況下，實驗組Nurr1/內參的灰度值之比(0.754±0.02)較對照組Nurr1/內參的灰度值之比(0.347±0.03)明顯增高，兩組差異比較有統(tǒng)計學意義(t=19.55,P< 0.01),提示表達載體GV394-Nurr1在SHSY5Y細胞中能夠瞬時表達。

2.5DCFH-DA染色法檢測瞬時表達Nurr1對細胞內ROS水平影響

本實驗采用DCFH-DA染色，通過流氏細胞儀檢測ROS峰值的變化精確反應細胞內活性氧含量變化，ROS峰值左移提示抑制細胞內ROS表達，如圖3所示，瞬時表達Nurr1的細胞內的ROS峰值較對照組明顯左移，表明過表達Nurr1抑制了SH-SY5Y細胞內活性氧的產生。

3　討論

PD是常見的一種中老年人常見的中樞神經錐體外系統(tǒng)疾病，其主要病理學特征是中腦黑質多巴胺能神經元選擇性喪失和路易氏小體(Lewy Body)的形成[4]。迄今為止，對選擇性多巴胺神經元缺失的確切病因和發(fā)病機制尚未完全闡明。研究認為，眾多因素都參與了PD的發(fā)病機制，但其最終的結局是中樞神經內多巴胺含量減少，使多巴胺能神經元應激性損傷敏感性增加。因此，對中腦多巴胺能神經發(fā)育分化基因調節(jié)機制的研究有助于了解帕金森氏疾病的發(fā)病機制。

注：(A)RT-PCR圖；(B)灰度掃描分析圖(1)實驗組Nurr1；(2)對照組Nurr1；(3)實驗組β-actin；(4)對照組β-actin；(5)DNA Marker。與對照組比較，*P < 0.05。圖2　Nurr1 mRNA 表達Note.(A)RT-PCR image；(B)The result of gray scale analysis；(1)Experimental group；(2)Control group；(3)Experimental group(β-actin)；(4)Control group(β-actin)；(5)DNA Marker. *P < 0.05，Compared with control group.Fig.2　The expression of Nurr1 mRNA

圖3　流氏細胞儀檢測瞬時表達Nurr1對細胞內ROS水平的影響Fig.3　Flow cytometry detection the effect of transient expression of Nurr1 on the intracellular

Nurr1又稱孤核受體因子，定位于染色體2q22 -q23[5]，由598個氨基酸組成，分子量大約為66KD,主要分布于中腦黑質和腹側被蓋區(qū)，作為轉錄蛋白因子對多巴胺的發(fā)育和存活有著重要的作用。Nurr1作為配體誘導轉錄因子包含DNA結合區(qū)域(DBD)，配體結合區(qū)域(LBD)，N端可變區(qū)，在外界環(huán)境的刺激激活MAPK通路，調控下游基因的表達[6]。Kaoru等[7]發(fā)現(xiàn)在小神經膠質細胞和星型膠質細胞中Nurr1能夠募集Co REST([co]repressor for element-1-silencing transcription factor)復合物形成反式通路對神經毒素物質致炎效應表現(xiàn)出較強的防御反應，同時通過實驗性研究證實在中樞神經系統(tǒng)中Nurr1可以保護多巴胺神經元免受LPS和A30P α-Synuclein產生的毒害反應。實時定量PCR顯示在過表達α-Synuclein大鼠中Nurr1基因表達量減少，給予體外帕金森病動物模型Nurr1及類視黃醇X受體配體的刺激后結果顯示α-Synuclein表達下降[8]。因此，可以推測Nurr1蛋白表達抑制了α-Synuclein對多巴胺能神經元的毒性作用。體外研究證明，Nurr1在轉錄因子LmxIb(LIM homeobox transcription factor 1 beta)和EN(Engrailed)蛋白的共同參與下，通過Lmxlb驅動Pitx3(paired-like homeodomain transcription factor 3)介導調控多巴胺神經元的發(fā)育、存活[9, 10]。通過基因敲除技術，缺失Nurr1基因表達的小鼠實時定量PCR結果顯示，其體內酪氨酸羥化酶(TH)的表達含量下降，活性水平降低，多巴胺含量減少，多巴胺能神經元數量減少，小鼠表現(xiàn)出對MPTP毒素的敏感性增加，表明降低Nurr1表達及其活性，失去了對多巴胺能神經元的保護作用[11, 12]。Nurr1表達促進多巴胺能神經元發(fā)育、存活、成熟方面起到了重要的作用，但是Nurr1如何參與調控尚存在爭議。

本研究以人腦 cDNA文庫為模板，成功擴增出人全長Nurr1基因，并構建了真核細胞表達載體GV394-Nurr1，利用陽離子脂質體轉染技術將其轉染到SH-SY5Y細胞內，發(fā)現(xiàn)該基因能夠在SH-SY5Y細胞內表達，且能夠降低了細胞內的ROS水平，這為進一步研究Nurr1對多巴胺能神經元的分化、成熟的機制提供了基礎。

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The construction and identification of eukaryotic expression vector GV394-Nurr1

FAN Xiu-shuang,GUO Jun-tang,CHEN An-qi*

(Clinical College，Weifang Medical University，Weifang 261053,China)

ObjectiveTo construct the eukaryotic expression vector GV394-Nurr1 containing humanNurr1 gene and to study the effects of transient transfection ofNurr1 on intracellular reactive oxygen species level. Methods The full-length of human Nurr1 gene amplified by PCR was subcloned into T vector and sequenced. GV394-Nurr1 vector was constructed by BamHI and XhoI double digestion and then T4 DNA ligase conjunction. GV394-Nurr1 was transfected into SH-SY5Y cells by liposome transfection technique; The mRNA ofNurr1 was detected by RT-PCR; The effect ofNurr1 expression on intracellular reactive oxygen species (ROS)was detected by (DCFH-DA) staining.ResultsPCR and sequencing confirmed that theNurr1 gene was correctly cloned into eukaryotic expression vector GV394. The RT-PCR results showed that theNurr1 mRNA expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cells transiently transfectedNurr1 was higher than that in the control group. DCFH-DA staining showed that the level of reactive oxygen peak in neuroblastoma cells transiently transfectedNurr1 obviously shifted to the left compared to the control group. ConclusionsThe humanNurr1 gene eukaryotic expression vector was successfully established and its high expression in the neuroblastoma SH-SY5Y cell line significantly decreased the ROS level. This provide the basis for further study on the function ofNurr1 in vitro and its relationship with the protective effect of dopaminergic neurons.

Nurr1; Eukaryotic expression vector; Parkinson disease; Reactive oxygen species

山東省自然科學基金(ZR2011HM014)。

樊秀雙(1990-)，女，碩士研究生，研究方向: 帕金森病發(fā)病機制的研究。 Email: Fanxiushuang0314@163.com。

陳安琪 (1981-)，女, 醫(yī)學碩士，研究方向：帕金森發(fā)病機制。Email:chenanqi_1981@163.com。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0031-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.005

2016-03-31