矢車菊素-3-葡萄糖苷對APPswe/PS1ΔE9阿爾茨海默病模型小鼠糖脂代謝的影響

宋　楠，張　玲，陳　巍，張　倩，韓云林，秦　川

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京　100021)

?

矢車菊素-3-葡萄糖苷對APPswe/PS1ΔE9阿爾茨海默病模型小鼠糖脂代謝的影響

宋楠，張玲，陳巍，張倩，韓云林，秦川*

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，北京100021)

目的探討矢車菊素-3-葡萄糖苷(Cy3G)對阿爾茨海默病(AD)模型小鼠糖脂代謝的影響。方法將7月齡APPswe/PS1ΔE9(PAP)的AD模型小鼠隨機分為AD模型組(PAP)、Cy3G治療組(PAPCy，5mg/kg/d)及同窩陰性對照組(nPAP)；另外選擇相同月齡的正常野生型C57BL/6J小鼠分別作為空白對照組(WT)和Cy3G干預(yù)組(WTCy，5mg/kg/d)；每組12只，雌雄各半。Cy3G灌胃8周后，用MicroPET/CT檢測腦葡萄糖代謝率；血生化方法檢測小鼠肝腎功能及脂代謝相關(guān)指標(biāo)；取全腦稱重并計算臟器系數(shù)，HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；透射電鏡觀察海馬中老年斑沉積情況；Western-blot分析Jun氨基末端激酶(JNK)和蛋白激酶B(AKT)的表達(dá)情況。結(jié)果 MicroPET/CT結(jié)果顯示，與WT組相比，PAP組小鼠腦18F-FDG的攝取率顯著降低(P< 0.05)，尤其在額葉和海馬區(qū)降低尤為明顯；與PAP組相比，PAPCy組小鼠額葉和海馬區(qū)的18F-FDG的攝取率顯著升高(P< 0.05)。血生化結(jié)果顯示，與WT組相比，PAP組小鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和乳酸脫氫酶(LDH)水平顯著升高(P< 0.05)，脂代謝指標(biāo)相對正常；與PAP組相比，PAPCy組血清LDH水平顯著降低(P< 0.05)。腦組織HE染色未發(fā)現(xiàn)異常，但是在腦系數(shù)比較中，與WT組相比，PAP組小鼠腦系數(shù)顯著降低(P< 0.05)；與PAP組相比，PAPCy組小鼠大腦的腦系數(shù)顯著升高(P< 0.05)。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，WT組、WTCy組及nPAP組海馬中未見有老年斑沉積，PAP組小鼠海馬可觀察到有老年斑沉積，而PAPCy組小鼠海馬中老年斑沉積有所減少。Western blot結(jié)果顯示，與WT組相比，PAP組JNK蛋白水平顯著降低(P< 0.05)、AKT蛋白水平顯著升高(P< 0.05)；與PAP組相比，PAPCy組JNK蛋白水平顯著升高(P<0.05)，而AKT蛋白水平顯著降低(P< 0.05)。結(jié)論Cy3G可以有效改善AD模型小鼠腦葡萄糖代謝障礙，但對脂代謝調(diào)節(jié)并不顯著，同時還能抑制大腦海馬中老年斑的沉積。提示，Cy3G可能是通過JNK/AKT通路調(diào)節(jié)胰島素抵抗和炎癥反應(yīng)。

阿爾茨海默病；矢車菊素-3-葡萄糖苷；葡脂代謝

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)作為常見的神經(jīng)退行性疾病的一種，特征性的病理學(xué)表現(xiàn)有：β淀粉樣肽(β amyloid peptides，Aβ)沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)[1, 2]。臨床上常伴有進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、人格和行為改變等[3, 4]。越來越的研究均證實，隨著AD病程的發(fā)展，大腦葡萄糖代謝障礙是AD一個典型的病理生理特征，比認(rèn)知功能障礙和其他病理改變早出現(xiàn)幾十年[5-8]，并對AD病程的發(fā)展起著重要作用[4]。因此，如何有效預(yù)防AD是關(guān)鍵。

矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyaniding-3-glucoside，Cy3G)是酚類化合物中矢車菊色素(cyanidin，Cy)的一種糖苷形式，是植物中常見的且含量較為豐富的花色素糖苷單體。研究發(fā)現(xiàn)，Cy3G具有神經(jīng)保護(hù)作用[9, 10]，其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機制也主要是涉及抗氧化作用和調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[2, 11]。此外，在非酒精性脂肪肝和2-型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，Cy3G可改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂代謝及緩解氧化應(yīng)激損傷[9, 12, 13]。但其是否通過調(diào)節(jié)糖脂代謝進(jìn)而改善AD尚未有文獻(xiàn)報道。本研究擬用APPswe/PS1ΔE9(PAP)轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，觀察Cy3G對AD模型小鼠糖脂代謝的影響及其相關(guān)生化、病理指標(biāo)的改變，初步探討可能的分子機制，以期能為Cy3G改善AD認(rèn)知的機制研究及潛在臨床應(yīng)用提供新的思路。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

實驗所采用的APPswe/PS1ΔE9(PAP)雙轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病小鼠模型由本所遺傳中心構(gòu)建培育。該模型以C57BL/6J小鼠為背景，含有人APP瑞典突變位點(K595N/M596L)和人PS1第九外顯子敲除(ΔE9)突變位點。用于繁殖的野生雌性C57BL/6J小鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK-(京)2014-0004】，實驗在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所開展【SYXK-(京)2011-0022】。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2實驗藥物和試劑

Cy3G購自(純度≥99%)購自芬蘭Polyphenols AS公司；RIPA裂解液(強)購于江蘇碧云天公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸胺(APS)、Tris-HCl、甘氨酸、TEMED、Tween-20購自美國Sigma公司；N,N’-亞甲基雙丙烯酰胺和丙烯酰胺購自美國Bio-Rad公司；磷酸酶抑制劑購自美國Thermo公司；苯甲基磺酰氟(PMSF)購自美國Amresco公司；麗春紅、溴酚藍(lán)購自北京鼎國生物技術(shù)公司；β-巰基乙醇購自美國Biotech公司；二硫蘇糖醇(DTT)購自北方同正科技發(fā)展公司；BCATMProtein Assay Kit、蛋白Marker與ECL發(fā)光試劑盒購于美國Pierce公司；脫脂奶粉購自伊利公司；兔抗小鼠的JNK多克隆抗體和AKT單克隆抗體購自Cell Signaling公司；小鼠單克隆抗體GAPDH和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Micro-PET示蹤劑(18F標(biāo)記的脫氧葡萄糖，18F-FDG)由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院提供。

1.1.3儀器和設(shè)備

MicroPET/CT及INVEON分析系統(tǒng)(Siemens，美國)；全自動生化分析儀(日立7100，日本)；透射電鏡(JEOL JEM-1400，日本)及倒置顯微鏡(Olympus，日本)；電泳電源、垂直電泳儀、濕式轉(zhuǎn)印槽(北京凱元信瑞儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理

將7月齡PAP模型小鼠分為AD模型組(PAP)、Cy3G治療組(PAPCy，5 mg/kg/d)及同窩陰性對照組(nPAP)；另外選擇相同月齡的正常野生型C57BL/6J小鼠分別作為空白對照組(WT)和Cy3G干預(yù)組(WTCy，5 mg/kg/d)；小鼠體重(23～25)g，每組12只，雌雄各半；Cy3G灌胃8周，灌胃體積為0.2 mL/只，溶劑對照為等體積無菌水。

1.2.2MicroPET/CT檢測腦葡萄糖代謝水平

干預(yù)結(jié)束后，隨機從各組中選擇3只小鼠(雄性)并提前禁食不禁水12 h，實驗前提前適應(yīng)周圍實驗環(huán)境。

1)小鼠吸入含1.5%～2%異氟烷的純氧進(jìn)行吸入麻醉(1～2 L/min)，待小鼠麻醉完全后，腹腔注射放射性示蹤劑18F-FDG，注射量在14.5～21.9 MBq之間，活度≥0.5 mCi。

2)注射1 h后，將小鼠俯臥位固定在掃描床上，使其頭部長軸與掃描器長軸保持平行且在掃描器視野內(nèi)。

3)利用PET/CT進(jìn)行圖像釆集，整個掃描過程中小鼠頭部固定，并使小鼠一直處于麻醉狀態(tài)。

4)Micro-PET影像重建。釆用濾波后投影算法和CT光子衰減校正重建影像，得到10min的單幀圖像。

5)感性興趣區(qū)(region of interest，ROI)的選取。通過三維感興趣區(qū)(3DROI)技術(shù)，在小鼠腦部橫斷面、矢狀面和冠狀面手動選取除小腦外的立體全腦3DROI，計算ROI內(nèi)平均每克腦組織18F-FDG的攝取率(%ID/g)。

1.2.3血生化及脂代謝指標(biāo)檢測

于實驗結(jié)束時，各組小鼠經(jīng)眼眶靜脈采血，按照試劑盒相關(guān)說明，并使用全自動生化分析儀進(jìn)行血液生化檢測。血液生化指標(biāo)包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)；脂代謝指標(biāo)包括乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)及低密度脂蛋白(LDL)。

1.2.4臟器系數(shù)及病理學(xué)檢查

將小鼠眼眶靜脈取血后，頸椎脫臼處死，稱全腦重量并根據(jù)當(dāng)日體重計算臟器指數(shù)。臟器系數(shù)=(臟器重量/體重)×100%；沿腦橫斷面從中切開，入恒冷冰凍切片機行10 μm連續(xù)橫斷面切片，隔3取1，切片于4%多聚甲醛溶液中固定20 min，再在0.01mol/L PBS中放置30 min，最后經(jīng)純乙醇脫水2 min入蒸餾水，進(jìn)行HE染色，封固鏡檢。

1.2.5透射電鏡觀察老年斑沉積

取小鼠海馬CA1區(qū)，將組織修成1 mm×1 mm×1 mm大小的長條形，在含2.5%戊二醛的固定液中4°C固定2 h，0.1 mol/L PBS洗三次，每次10 min；1%鋨酸4℃固定2 h，雙蒸水沖洗三次，每次10 min；梯度酒精脫水(50%，70%，90%)各10 min，100%酒精2次，各15 min；環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片用醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色，透射電鏡觀察(JEOL JEM-1400)。

1.2.6Western-blot檢測JNK和AKT蛋白表達(dá)的變化

提取腦組織蛋白并測定蛋白濃度。取含有60 μg蛋白的樣品(用生理鹽水調(diào)成等體積)加入5×上樣緩沖液，100°C沸水浴變性5 min，置于冰上驟冷后進(jìn)行10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜并用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入稀釋好的抗體JNK(1∶500)、AKT(1∶500)和GADPH(1∶15 000)；于搖床孵育，4°C過夜。次日棄去一抗，TBST搖床上洗膜3次，10 min/次，加入稀釋好的二抗(1∶15 000)，室溫孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑并置于天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tannon 5500)中成像，并用Image J進(jìn)行條帶灰度值分析，利用目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的光密度比值衡量目的蛋白的相對表達(dá)量。1.2.7數(shù)據(jù)分析

注：(A)Cy3G對PAP小鼠不同ROI內(nèi)平均每克腦組織18F-FDG的攝取率(%ID/g)的影響，與WT組比較，aP < 0.05，aaP < 0.01；與PAP組比較，bP < 0.05，bbP < 0.01；(B)各組小鼠腦不同區(qū)域橫斷面MicroPET/CT影像。圖1　Cy3G對PAP小鼠腦葡萄糖代謝的影響(n=3)Note. (A) Comparison of 18F-FDG uptake rates in the ROI of mice brains after Cy3G supplementation for 8 weeks (n=3; closely age-matched). Compared with WT group, aP < 0.05, aaP < 0.01; Compared with PAP group, bP < 0.05, bbP < 0.01. (B) MicroPET/CT imaging of mice after Cy3G supplementation for 8 weeks.Fig.1　Effects of Cy3G on cerebral glucose metabolism in PAP mice.

2　結(jié)果

2.1Cy3G對PAP小鼠腦葡萄糖代謝的影響

如圖1A所示，MicroPET/CT檢測小鼠額葉(frontal lobe)、頂葉(parietal lobe)、顳葉(temporal lobe)和海馬(hippocampus)區(qū)對18F-FDG攝取率的變化。結(jié)果顯示，各組間不同ROI內(nèi)的平均每克腦組織18F-FDG的攝取率(%ID/g)存在顯著差異。即與WT組相比，PAP組小鼠腦18F-FDG的攝取率顯著降低(P< 0.05)，尤其在額葉和海馬區(qū)降低尤為明顯；與PAP組相比，PAPCy組小鼠額葉和海馬區(qū)的18F-FDG的攝取率顯著升高，P值分別為0.019和0.036。

在橫斷面PET影像中%ID/g使用相同閾值，色標(biāo)從上到下分別代表高、中、低18F-FDG攝取水平，相應(yīng)為高、中、低腦葡萄糖代謝水平。結(jié)果顯示(圖1B)，WT組和WTCy組小鼠大腦感興趣區(qū)(額葉、頂葉、顳葉和海馬區(qū))18F-FDG的攝取率較高，PAP組小鼠18F-FDG攝取率較低，而PAPCy組小鼠則有所緩解。

2.2Cy3G對PAP小鼠血生化及脂代謝的影響

結(jié)果如表1所示，與WT組相比，PAP組小鼠血清中AST和LDH水平顯著升高(P< 0.05)，而LDL盡管有升高趨勢，但差異不顯著；與PAP組相比，PAPCy組血清LDH水平顯著降低(P< 0.05)。此外，血清中ALT水平在各組小鼠中均無顯著性差異。提示：PAP組小鼠存在肝腎功能異常，但脂代謝相對正常；Cy3G干預(yù)的各組小鼠無明顯的肝腎損傷，并且脂代謝正常。

表1　各組間小鼠血生化檢測

注：與WT組比較，aP< 0.05，aaP< 0.01，aaaP< 0.001；與PAP組比較，bP< 0.05，bbP< 0.01，bbbP< 0.001。

Note. Compared with WT group,aP< 0.05,aaP< 0.01,aaaP< 0.001; Compared with PAP group,bP< 0.05,bbP< 0.01,bbbP< 0.001.

2.3Cy3G對PAP小鼠腦系數(shù)的影響及病理學(xué)檢查

腦系數(shù)結(jié)果顯示(表2)，與WT組相比，PAP組小鼠腦系數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.001)；與PAP組相比，PAPCy組小鼠腦系數(shù)顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。HE染色結(jié)果表明，各組小鼠腦組織病理檢查未見明顯異常，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)規(guī)則、完整(圖2)。

表2　各組間小鼠腦系數(shù)

注：與WT組比較，aP< 0.05，aP< 0.01，aaaP< 0.001；與PAP組比較，bP< 0.05，bbP< 0.01，bbbP< 0.001。

Note. Compared with PAP group,aP< 0.05,aaP< 0.01,aaaP< 0.001; Compared with PAP group,bP< 0.05,bbP< 0.01,bbbP< 0.001.

2.4Cy3G對PAP小鼠海馬老年斑生成的影響

細(xì)胞外Aβ沉積形成的老年斑是AD的主要病理特征之一。通過透射電鏡觀察不同處理組小鼠海馬中老年斑的生成情況，如圖3所示，野生小鼠(包括WT組和WTCy組)及同窩陰性對照組(nPAP)海馬內(nèi)未見有老年斑形成，周圍分布的線粒體結(jié)構(gòu)正常；而AD模型小鼠(PAP組)小鼠海馬中可觀察到有老年斑沉積，其周圍還有大量聚集在一起的自噬小體。而PAPCy組小鼠海馬中老年斑沉積有所減少。

2.5Cy3G對PAP小鼠腦組織JNK和AKT蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果如圖4所示，JNK蛋白主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，與WT組比，PAP組JNK蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)；與PAP組相比，PAPCy組JNK蛋白顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)。AKT是調(diào)節(jié)胰島素抵抗的蛋白，與WT和WTCy組相比，PAP組AKT蛋白水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.05)；與PAP組相比，PAPCy組AKT蛋白水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P< 0.01)。

圖2　腦組織病理學(xué)檢查(×40，bar=100 μm，n=6)Fig.2　Pathological examination on tissue of mice.

圖3　透射電鏡下海馬區(qū)老年斑及其周圍組織的超微結(jié)構(gòu)(A:×600，bar=5 μm;B:×3000，bar=1 μm；n=3)Fig.3　Representative electron microscopy of senile plaques surrounded by dystrophic neuritis and autophagic vacuoles in hippocampus of each group

注：(A)為腦組織中JNK和AKT蛋白表達(dá)條帶；(B)JNK和AKT蛋白表達(dá)灰度分析結(jié)果；與WT組比較，aP < 0.05，aaP < 0.01；與PAP組比較，bP < 0.05，bbP < 0.01。圖4　Cy3G對PAP小鼠JNK和AKT蛋白表達(dá)的影響(n=3)Note. (A) The immunoreactive bands (JNK, 46/54 kDa; AKT, 60 kDa) were detected using chemiluminescence reagents. (B) The relative density of the detected bands was measured and calculated by an automatic chemiluminescence imaging analysis system; Compared with PAP group, aP < 0.05, aaP < 0.01; Compared with PAP group, bP < 0.05, bbP < 0.01.Fig.4　Effect of Cy3G on the expression of JNK and AKT in different groups.

3　討論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)作為是世界上最常見的一種老年癡呆癥，在中國患者數(shù)也已超過600萬，60歲人群中AD的患病率為3%～5%，并隨著人口老齡化其患病率呈上升趨勢，影響著我國經(jīng)濟和社會發(fā)展[14]。臨床用于治療AD的主要藥物如膽堿酯酶抑制劑只能減輕部分癥狀，對患者腦內(nèi)的主要病理變化并無明顯改善作用，不能用于早期AD病理事件的干預(yù)或控制病情的發(fā)展，病人的生活質(zhì)量無法有效改善，且藥物毒副作用大[15]。此外，葡萄糖代謝功能障礙可增加老年人認(rèn)知損傷的風(fēng)險。而葡萄糖代謝動態(tài)平衡的失調(diào)，會引起大腦慢性代謝性疾病，其中也包括AD。即AD也是一種葡萄糖攝取和利用障礙的退行性代謝疾病。[16]

越來越多的研究證實，Cy3G除了具有清除自由基，抗氧化、抗炎，防止內(nèi)皮功能紊亂，調(diào)節(jié)膽固醇代謝，改善胰島素抵抗，預(yù)防癌癥、糖尿病和心血患疾病等作用外，還具有神經(jīng)保護(hù)作用[9-11, 17]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，用Cy3G活性單體預(yù)處理PC12(大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤)細(xì)胞可有效改善H2O2造成的氧化損傷，也可顯著抑制缺氧缺糖(oxygen glucose deprivation，OGD)所致的PC12細(xì)胞存活率降低[18]。Tarozzi等[19]研究還發(fā)現(xiàn)，該活性物質(zhì)對Aβ致人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞損傷也具有保護(hù)作用，即細(xì)胞存活率升高、細(xì)胞調(diào)亡和壞死率降低、ROS生成量減少、細(xì)胞膜完整性得到保護(hù)。而Aβ可以通過擴散方式進(jìn)入大腦實質(zhì)，是AD發(fā)生的主要致病因素。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，Cy3G可以降低大腦缺血損傷，對短暫中腦動脈阻塞(MCAO)造成的腦損傷模型小鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[11]；Shih等[2]研究發(fā)現(xiàn)，給快速老化(SAMP)小鼠飼喂富含Cy3G的提取物12周，可使大腦中過氧化氫酶及谷胱甘肽過氧化物酶活性升高，脂質(zhì)過氧化水平降低，Aβ生成減少，學(xué)習(xí)記憶能力提高，即Cy3G能改善衰老小鼠的認(rèn)知和行為能力[20]。體內(nèi)外實驗均證實：Cy3G可以透過血-腦屏障，在與學(xué)習(xí)和記憶相關(guān)的腦區(qū)發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)功能[10, 21-23]，因此，研究Cy3G對AD的預(yù)防或緩解作用具有現(xiàn)實意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，Cy3G還能有效改善AD小鼠大腦中不同腦區(qū)的葡萄糖利用率，即補充Cy3G的AD小鼠其腦葡萄糖代謝率顯著升高，尤其以海馬區(qū)最為顯著，其次是額葉、顳葉和頂葉。因此，推測Cy3G具有安全的胰島素樣活性，可調(diào)節(jié)大腦胰島素敏感區(qū)的葡萄糖/能量代謝，Cy3G這種生物學(xué)效用與Shih和Scazzocchio等[9, 13]觀點一致，即他們在非酒精性脂肪肝、2-型糖尿病的研究中發(fā)現(xiàn)，Cy3G可以通過活化過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)通路改善胰島素抵抗、緩解氧化應(yīng)激。Cy3G在腦中發(fā)揮其生物活性的機制可能與其在生理pH下化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、易分解有關(guān)，并且能迅速降解成酚酸(如原兒茶酸)，這可能是其在體液中半衰期相對較短的原因；另一種可能是，在腸道中花青素首先通過腸道微生物將其糖苷鍵部分水解，生成花青素的糖苷配基(Cy)[24]。同時，F(xiàn)leschhut[25]研究也已經(jīng)證實，腸道菌群具有潛在的水解Cy3G的能力，即將Cy3G水解成Cy和PA，而后者可到達(dá)不同組織中，其中也包括腦組織[26]。此外，通過血生化檢測并結(jié)合病理學(xué)檢查，來評價Cy3G干預(yù)期間各組小鼠肝腎功能及脂代謝情況。結(jié)果顯示：PAP小鼠存在肝腎功能紊亂，但是脂代謝相對正常；而Cy3G干預(yù)的各組小鼠均無明顯的肝腎損傷，并且脂代謝正常。但是，Jia等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在脂肪組織和肝臟中Cy3G可顯著降低脂肪變性的肝細(xì)胞的脂質(zhì)濃度，其激活肝細(xì)胞脂代謝的效果類似于降血脂藥物。提示，在本研究中Cy3G可能對AD小鼠糖代謝方面發(fā)揮重要作用，而在脂代謝調(diào)節(jié)中的作用并不顯著，這可能是因?qū)嶒瀸ο蟛煌拢琂ia等是基于細(xì)胞水平上的研究，而本研究是從整體水平檢測。為進(jìn)一步研究Cy3G通過調(diào)節(jié)腦葡萄糖代謝改善AD的可能機制，在Cy3G干預(yù)期間，我們檢測了腦系數(shù)并結(jié)合透射電鏡觀察海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)，盡管病理檢查未發(fā)現(xiàn)異常，但是PAP小鼠腦系數(shù)明顯減小。提示，AD模型小鼠可能出現(xiàn)了腦萎縮，同時海馬區(qū)可觀察到老年斑沉積；而補充Cy3G的PAP小鼠其腦萎縮趨勢有明顯改善，老年斑沉積也有所緩解。結(jié)合上述腦糖代謝紊亂的情況，應(yīng)用免疫印跡法檢測了AKT/JNK蛋白的變化。因為，根據(jù)文獻(xiàn)報道，使用羅格列酮干預(yù)三轉(zhuǎn)基因(APPswe/PS1ΔE9/TAU)AD模型小鼠4個月后，觀察其對認(rèn)知功能和AD相關(guān)腦病理變化的影響，發(fā)現(xiàn)這種長期治療改善了空間學(xué)習(xí)能力與AKT信號通路改變有關(guān)，進(jìn)而可緩解tau蛋白磷酸化和神經(jīng)炎癥[27]。而JNK的磷酸化水平升高可以導(dǎo)致胰島素受體底物-1(IRS-1，第307位的絲氨酸)磷酸化，使AKT去磷酸化，進(jìn)而出現(xiàn)胰島素抵抗[28]。Shih等[13]研究進(jìn)一步證實，Cy3G及曲格列酮分別或共同處理人類肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞后，一方面Cy3G通過其代謝產(chǎn)物Cy(cyanidin)通過調(diào)控細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)和JNK信號通路，發(fā)揮抗氧化作用；另一方面，兩者可發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，抑制由H2O2誘導(dǎo)的脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平下調(diào)、ROS的生成和細(xì)胞的凋亡，緩解氧化應(yīng)激介導(dǎo)的肝毒性。此外，Aβ能引起JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的改變，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元損傷[29, 30]。本研究發(fā)現(xiàn)PAP小鼠腦組織中AKT蛋白表達(dá)水平上調(diào)、JNK蛋白表達(dá)水平下調(diào)，而Cy3G干預(yù)后則逆轉(zhuǎn)了上述蛋白水的變化。提示Cy3G可能通過對AKT/JNK通路的調(diào)節(jié)進(jìn)而改善了AD小鼠腦胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)[28]，可進(jìn)一步解釋Cy3G干預(yù)的AD小鼠腦葡萄糖代謝率升高的原因。

綜上所述，Cy3G改善AD的神經(jīng)保護(hù)作用機制可能與其改善腦葡萄糖代謝，調(diào)節(jié)胰島素抵抗和緩解炎癥反應(yīng)有關(guān)，因此Cy3G可能具有潛在胰島素增敏劑的活性。

[1]S.Y. Hong, W.S. Jeong, M. Jun. Protective effects of the key compounds isolated from Corni fructus against beta-amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells[J]. Molecules, 2012, 17 (9): 10831-10845.

[2]PH Shih, YC. Chan, J.W. Liao,etal. Antioxidant and cognitive promotion effects of anthocyanin-rich mulberry (Morus atropurpurea L.) on senescence-accelerated mice and prevention of Alzheimer’s disease[J]. J Nutr Biochem, 2010, 21 (7): 598-605.[3]Z Chen,C.Zhong.Decoding Alzheimer’s disease from perturbed cerebral glucose metabolism: implications for diagnostic and therapeutic strategies[J]. Prog Neurobiol, 2013, 108: 21-43.

[4]S.M. de la Monte. Brain insulin resistance and deficiency as therapeutic targets in Alzheimer’s disease[J]. Curr Alzheimer Res, 2012, 9 (1): 35-66.

[5]R.J. Caselli, K. Chen, W. Lee,etal. Correlating cerebral hypometabolism with future memory decline in subsequent converters to amnestic pre-mild cognitive impairment[J]. Arch Neurol, 2008, 65 (9): 1231-1236.

[6]L.Mosconi,A.Pupi,M.J.De Leon.Brain glucose hypometabolism and oxidative stress in preclinical Alzheimer’s disease[J]. Ann N Y Acad Sci, 2008, 1147: 180-195.[7]L. Mosconi, R. Mistur, R. Switalski,etal. FDG-PET changes in brain glucose metabolism from normal cognition to pathologically verified Alzheimer’s disease[J]. Eur J Nucl Med Mol Imaging, 2009, 36 (5): 811-822.

[8]J.B.Langbaum,K.Chen,R.J.Caselli,etal. Hypometabolism in Alzheimer-affected brain regions in cognitively healthy Latino individuals carrying the apolipoprotein E epsilon4 allele[J]. Arch Neurol, 2010, 67 (4): 462-468.

[9]B. Scazzocchio, R. Vari, C. Filesi,etal. Cyanidin-3-O-beta-glucoside and protocatechuic acid exert insulin-like effects by upregulating PPARgamma activity in human omental adipocytes[J]. Diabetes, 2011, 60 (9): 2234-2244.

[10]A. Tarozzi, F. Morroni, A. Merlicco,etal. Neuroprotective effects of cyanidin 3-O-glucopyranoside on amyloid beta (25-35) oligomer-induced toxicity[J]. Neurosci Lett, 2010, 473 (2): 72-76.

[11]T.H. Kang, J.Y. Hur, H.B. Kim,etal. Neuroprotective effects of the cyanidin-3-O-beta-d-glucopyranoside isolated from mulberry fruit against cerebral ischemia[J]. Neurosci Lett, 2006, 391 (3): 122-126.

[12]Y. Jia, J.Y. Kim, H.J. Jun,etal. Cyanidin is an agonistic ligand for peroxisome proliferator-activated receptor-alpha reducing hepatic lipid[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1831 (4): 698-708.

[13]P.H. Shih, S.L. Hwang, C.T. Yeh,etal. Synergistic effect of cyanidin and PPAR agonist against nonalcoholic steatohepatitis-mediated oxidative stress-induced cytotoxicity through MAPK and Nrf2 transduction pathways[J]. J Agric Food Chem, 2012, 60 (11): 2924-2933.

[14]Alzheimer’s Association.Alzheimer’s.2015 Alzheimer’s disease facts and figures[J].Alzheimers Dement,2015,11 (3): 332-384.

[15]T. Sobow. Combination treatments in Alzheimer’s disease: risks and benefits[J]. Expert Rev Neurother, 2010, 10 (5): 693-702.

[16]S.C.Correia,R.X.Santos,C.Carvalho,etal. Insulin signaling, glucose metabolism and mitochondria: major players in Alzheimer’s disease and diabetes interrelation[J]. Brain Res, 2012, 1441: 64-78.[17]A.Castaeda-Ovando,M.d.L.Pacheco-Hernández,M.E.Páez-Hernández,etal.Chemical studies of anthocyanins: A review[J]. Food Chemistry, 2009, 113 (4): 859-871.

[18]W.H.Shin,S.J.Park,E.J.Kim.Protective effect of anthocyanins in middle cerebral artery occlusion and reperfusion model of cerebral ischemia in rats[J]. Life Sci, 2006, 79 (2): 130-137.

[19]A.Tarozzi,A.Merlicco,F.Morroni,etal. Cyanidin 3-O-glucopyranoside protects and rescues SH-SY5Y cells against amyloid-beta peptide-induced toxicity[J]. Neuroreport, 2008, 19 (15): 1483-1486.

[20]P.C.Bickford,T.Gould,L.Briederick,etal. Antioxidant-rich diets improve cerebellar physiology and motor learning in aged rats[J]. Brain Res, 2000, 866 (1-2): 211-217.

[21]C. Andres-Lacueva, B. Shukitt-Hale, R.L. Galli,etal. Anthocyanins in aged blueberry-fed rats are found centrally and may enhance memory[J]. Nutr Neurosci, 2005, 8 (2): 111-120.

[22]L. Qin, J. Zhang, M. Qin. Protective effect of cyanidin 3-O-glucoside on beta-amyloid peptide-induced cognitive impairment in rats[J]. Neurosci Lett, 2013, 534: 285-288.

[23]J. Min, S.W. Yu, S.H. Baek,etal. Neuroprotective effect of cyanidin-3-O-glucoside anthocyanin in mice with focal cerebral ischemia[J]. Neurosci Lett, 2011, 500 (3): 157-161.

[24]A. Tarozzi, F. Morroni, S. Hrelia,etal. Neuroprotective effects of anthocyanins and their in vivo metabolites in SH-SY5Y cells[J]. Neurosci Lett, 2007, 424 (1): 36-40.

[25]J. Fleschhut, F. Kratzer, G. Rechkemmer,etal. Stability and biotransformation of various dietary anthocyanins in vitro[J]. European Journal of Nutrition, 2006, 45 (1): 7-18.

[26]M.A. El Mohsen, J. Marks, G. Kuhnle,etal. Absorption, tissue distribution and excretion of pelargonidin and its metabolites following oral administration to rats[J]. Br J Nutr, 2006, 95 (1): 51-58.

[27]Y. Yu, X. Li, J. Blanchard,etal. Insulin sensitizers improve learning and attenuate tau hyperphosphorylation and neuroinflammation in 3xTg-AD mice[J]. J Neural Transm (Vienna), 2015, 122 (4): 593-606.[28]C.J. Chang, C.S. Lin, C.C. Lu,etal. Ganoderma lucidum reduces obesity in mice by modulating the composition of the gut microbiota[J]. Nat Commun, 2015, 6: 7489.

[29]S.Mandrekar-Colucci,J.C.Karlo,G.E.Landreth. Mechanisms underlying the rapid peroxisome proliferator-activated receptor-gamma-mediated amyloid clearance and reversal of cognitive deficits in a murine model of Alzheimer’s disease[J]. J Neurosci, 2012, 32 (30): 10117-10128.

[30]M.Ahmadian,J.M.Suh,N.Hah,etal.PPARgamma signaling and metabolism: the good, the bad and the future[J]. Nat Med, 2013, 19 (5): 557-566.

Effect of cyaniding-3-glucoside on glucose and lipid metabolism in the APPswe/PS1ΔE9mouse model of Alzheimer's disease

SONG Nan, ZHANG Ling, CHEN Wei, ZHANG Qian, HAN Yun-lin, QIN Chuan*

(Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College (PUMC); Institute of Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Science (CAMS); Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine,Ministry of Health, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo investigate the effect of cyaniding-3-glucoside (Cy3G) on glucose and lipid metabolism in the APPswe/PS1ΔE9mouse model of Alzheimer’s disease (AD). MethodsSeven-month-old APPswe/PS1ΔE9(PAP) mice were randomly divided into model group (PAP), Cy3G treatment group (PAPCy, 5 mg/kg/d) and negative-control group (nPAP). In addition, age-matched and normal wild-type of C57BL/6J mice were selected and divided into vehicle group (WT), Cy3G intervention group (WTCy, 5 mg/kg/d). Each group containing 12 mice, with equal number of male and female mice. After 8-week Cy3G supplementation, microPET/CT was used to measure cerebral glucose metabolism rate of mice in each group. Biochemical methods were used to detect the liver / kidney function as well as indicators associated with lipid metabolism. After weighting brain tissue, the brain coefficient was tested and pathological examination was used to observe tissues changes. Transmission electron microscope was used to observe neuropathological amyloid plaques deposition. Western- blot was used to determine protein levels of AKT and JNK. ResultsCompared with the WT group, PAP mice had low levels of18F-FDG uptake rates, especially in the regions of the frontal lobe and hippocampus accompanied by the decreased brain coefficient and amyloid plaques deposition in hippocampus. And levels of aspartate transaminase (AST) and lactic dehydrogenase (LDH) were also increased in PAP mice, but lipid metabolism index was relatively normal. In addition, the expression of JNK was decreased and AKT was increased in mice of PAP. However, in the PAPCy group,18F-FDG uptake rates were obviously increased in the regions of the frontal lobe and hippocampus compared with those in the PAP mice. And the reduction of brain atrophy and amyloid plaques deposition, normal lipid metabolism and no obvious liver/kidney toxicity were also observed. Cy3G also could reverse the changes of JNK and AKT protein. ConclusionsCy3G can improve glucose metabolism disorders instead of lipid metabolism, inhibit the senile plaques deposition in hippocampus and regulate insulin resistance and inflammatory reaction associated with JNK/AKT pathway. Thus, Cy3G has a good safety profile and may be used as an ideal alternative to traditional disease-modifying treatments against AD.

Alzheimer's disease; Cyaniding-3-glucoside; Glucose and lipid metabolism

國家自然基金(81500938)；協(xié)和青年基金(3332015151)。

宋楠，女，博士研究生，研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)，神經(jīng)退行性疾病的機制研究。E-mail：nannanxjwstu@163.com。

秦川，女，研究員，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：病理學(xué)與病理生理學(xué)。E-mail：qinchuan@pumc.edu.cn。

研究報告

R-332

A

1671-7856(2016)07-0015-09

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.07.003

2016-04-13