一個水稻類受體蛋白激酶OsRPK2的過量表達分析

曹振華，宋 婷，李瑩瑩，熊 煒，劉晨曦，欒維江

（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

一個水稻類受體蛋白激酶OsRPK2的過量表達分析

曹振華，宋 婷，李瑩瑩，熊 煒，劉晨曦，欒維江

（天津師范大學(xué) a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

為了解類受體蛋白激酶OsRPK2在水稻發(fā)育中的作用，采用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了該蛋白激酶基因的過表達載體，將其導(dǎo)入野生型水稻中獲得轉(zhuǎn)基因植株后，觀察植株的表型變化以及該基因在水稻植株不同部位的表達情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsRPK2的轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生白化現(xiàn)象，qRT-PCR分析表明白化植株中OsRPK2的表達量明顯增加，說明水稻轉(zhuǎn)基因植株的白化表型是由OsRPK2基因的過表達造成的.OsRPK2的組織特異性表達結(jié)果表明，OsRPK2在水稻的不同組織器官中均有表達，但在水稻幼嫩的分生組織和幼齡葉片中表達量較高，反映了OsRPK2在水稻植株發(fā)育及建成中具有重要作用.

水稻；類受體蛋白激酶OsRPK2；過表達；白化

蛋白激酶（protein kinase）是一類催化蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)的酶，能將三磷酸腺苷（ATP）上的γ磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)分子的氨基酸殘基上，大多數(shù)情況發(fā)生在絲/ 蘇/酪氨酸殘基上［1］.蛋白激酶在細胞信號通路中起化學(xué)修飾作用，參與多種生物學(xué)功能，如細胞的生長、分裂、分化、細胞間的相互作用等［2］.目前預(yù)測在水稻基因組中的蛋白激酶編碼基因超過1 500個，主要參與植物的葉片衰老及逆境應(yīng)答反應(yīng)等過程［3］.植物類受體蛋白激酶（receptor-like protein kinase，RLK）是一類包含胞外結(jié)構(gòu)域、單次跨膜域和胞內(nèi)激酶域的蛋白分子，它們通過胞外結(jié)構(gòu)域與胞外信號分子的特異結(jié)合來激活胞內(nèi)激酶域的自磷酸化和互磷酸化活性，完成跨膜傳遞信號的功能［4］，從而調(diào)控植物的生長發(fā)育和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程.如在擬南芥中，類受體蛋白激酶HAESA具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，在萼片、花瓣、葉柄和花?；烤斜磉_，該激酶表達量的降低會導(dǎo)致花器官延遲脫落［5］；BRI1激酶在分生組織、根、芽和種子的下胚軸均有表達，亞細胞定位結(jié)果顯示該激酶在細胞膜上感應(yīng)BR（Brassinosteroids）信號，并通過細胞內(nèi)的蛋白激酶區(qū)傳遞該信號［6］；BAK1也具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，能夠與BRI1發(fā)生磷酸化作用從而參與BR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［7］.RLK在植株抗病中也具有重要作用.如Song等［8］研究發(fā)現(xiàn)，水稻中與抗白葉枯病相關(guān)的Xa21蛋白激酶可以激活細胞內(nèi)的防御反應(yīng)，識別病原體配體；胡丹丹等［9］在水稻中發(fā)現(xiàn)了1個蔗糖非酵解型蛋白激酶（又稱脅迫相關(guān)蛋白激酶）OsSAPK2，該激酶可能通過調(diào)控抗病相關(guān)基因OsLRR1、OsHIR1以及感病相關(guān)基因OsMAPK5的表達來調(diào)控水稻對白葉病的抗病反應(yīng).

動植物響應(yīng)外界脅迫時會普遍產(chǎn)生以H2O2為中心的活性氧（ROS），質(zhì)膜NADPH氧化酶（NOX）在脅迫條件下細胞ROS的產(chǎn)生和積累過程中起主要作用.用生物信息學(xué)方法在水稻NOX數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)水稻中至少有11個基因的產(chǎn)物具有NOX活性，為了研究其中1個基因OsNox2在抗旱調(diào)控方面的作用，王剛鋒［10］利用基因芯片技術(shù)對osnox2干旱材料中的相關(guān)基因進行表達分析，發(fā)現(xiàn)了2個有類受體蛋白激酶活性的基因在osnox2缺失突變體中明顯下調(diào)，分別命名為OsRPK1 （LOC_Os09g19380）和OsRPK2（LOC_Os06g16300）.這2個基因在水稻遭受到高溫、低溫或者鹽脅迫時，表達量都會上升.本研究利用反向遺傳學(xué)方法構(gòu)建了OsRPK2基因的過表達載體，將其導(dǎo)入野生型水稻植株中，對比分析轉(zhuǎn)基因植株和野生型水稻植株的表型差異，以此探討類受體蛋白激酶OsRPK2在水稻生長發(fā)育中的功能和作用機理.

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種日本晴（Oryzasativa L.ssp.Japonica Nipponbare）及其轉(zhuǎn)基因植株.

1.2 主要儀器與試劑

PCR儀（9002，美國Applied Biosystems公司）；凝膠成像分析儀（美國BIO-RAD公司）；瓊脂糖水平電泳儀（美國Baygene公司）；超速離心機和分光光度計（美國Eppendorf公司）.

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker 2000、DNA Marker 15000（美國Takara公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；質(zhì)粒小量提取試劑盒（美國OMEGA Bio-Tek公司）；普通PCR試劑（北京鼎國生物有限公司）；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒（北京康為世紀生物有限公司）.引物合成及DNA測序由金唯智生物科技有限公司完成.

1.3 實驗方法

1.3.1 過表達載體的構(gòu)建

采用RT-PCR方法獲得目的基因OsRPK2的全長開放閱讀框架（open reading framework，ORF）.從生長30 d的水稻葉片中提取總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，用基因特異性引物ORPK2F（5′-TCGCGGTACCAGCTACCTTCATCAGCAAT-3′）和ORPK2R（5′-GCTGTCGACACAGACGGAACAGTAAAATC-3′）進行PCR擴增，獲得OsRPK2的全長開放閱讀框架.獲得的目的片段純化回收后連入過表達空載體pCAMBIA2300中，酶切檢測及測序正確后導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，用介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化方法將載體導(dǎo)入日本晴中獲得轉(zhuǎn)基因植株.PCR擴增條件：98℃下1 min；運行35次循環(huán)的98℃30s、60℃15s、72℃45s；之后72℃延伸7 min.

1.3.2 轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測

采用CTAB法從水稻葉片中提取基因組DNA，然后用載體中的NPTⅡ抗性基因進行分子檢測.引物為NPTⅡF（5′-TTGTCACTGAAGCGGGAAGGG-3′）和NPTⅡR（5′-GCGATACCGTAAAGCACGAGGAA-3′）.PCR擴增條件：94℃下4 min；運行32次循環(huán)的94℃30 s、56℃30 s、72℃30 s；之后72℃延伸5 min.PCR反應(yīng)結(jié)束后用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

1.3.3 目的基因的表達分析

采用逆轉(zhuǎn)錄定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）對目的基因的表達進行分析.從生長50d的轉(zhuǎn)基因水稻葉片中提取總RNA，用于分析轉(zhuǎn)基因植株中OsRPK2的表達；分別從野生型植株的根、莖、葉和各個時期的幼穗等材料中提取總RNA，用于分析目的基因組織特異性的表達；從生長70 d的野生型水稻最上部葉片、倒2葉、倒3葉及倒4葉中提取總RNA，用于分析不同葉齡葉片中目的基因的表達.用去基因組的反轉(zhuǎn)錄試劑盒對500 ng的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板進行RT-PCR反應(yīng).所用引物：RPK2-F（5′-ACCTGTCGCACCTTGTTTTC-3′）和RPK2-R（5′-GGCGTTCTCCATTTGCTCTT-3′）.PCR擴增條件：94℃下4 min；運行32次循環(huán)的94℃30 s、54℃30 s、72℃30 s；之后72℃延伸7 min.

以水稻OsActin1為內(nèi)參進行相對定量分析，內(nèi)參基因所用引物為：ActinF（5′-GACTCTGGTGATGGTGTCAGC-3′）和ActinR（5′-GGCTGGAAGAGGACCTCAGG-3′）.PCR反應(yīng)程序為：95℃下1 min；運行24個循環(huán)的94℃30 s、56℃30 s、72℃30 s；之后72℃延伸5 min.每個反應(yīng)重復(fù)3次.

2 結(jié)果及分析

2.1 過表達載體的構(gòu)建

本研究構(gòu)建的OsRPK2基因的過表達載體結(jié)構(gòu)如圖1（a）所示.通過RT-PCR方法獲得了OsRPK2基因的完整ORF，目的片段經(jīng)檢測符合預(yù)期設(shè)計，如圖1（b）所示.純化回收后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ對目的片段和空載體pCAMBIA2300進行酶切，純化回收后用T4 DNA連接酶進行連接，獲得重組質(zhì)粒.之后對重組質(zhì)粒進行酶切檢測，發(fā)現(xiàn)切出了預(yù)期的目的片段，如圖1（c）所示，表明目的片段已成功連入空載體中.對獲得的重組質(zhì)粒進行測序，得到的測序結(jié)果與NCBI（美國國立生物技術(shù)信息中心）中OsRPK2基因的cDNA序列進行比對，確定分析序列正確后，將過表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?

圖1 OsRPK2基因的過表達載體構(gòu)建Fig.1 Construction of ectopic vector OsRPK2

2.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、表達及表型分析

將重組載體pCAMBIA2300-OsRPK2導(dǎo)入野生型水稻中，最終獲得20個T0代獨立株系，T0代植株共102株.為了檢測T0代植株的基因組中是否含有重組載體，利用載體標記基因NPTⅡ的特異性引物對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR擴增，結(jié)果顯示102株中的96株含有標記基因，陽性率為94.1%，部分植株的檢測結(jié)果如圖2（a）所示.隨機選取5個T0代株系產(chǎn)生T1代轉(zhuǎn)基因植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2個株系在苗期出現(xiàn)白化現(xiàn)象，如圖2（b）所示.為了驗證白化現(xiàn)象是否由OsRPK2基因的過量表達造成，利用qRT-PCR方法對轉(zhuǎn)基因植株OsRPK2的表達進行分析，結(jié)果如圖2（c）所示.與野生型相比，白化植株的目的基因OsRPK2的表達量明顯提高，表明水稻的白化表型確實與OsRPK2的過表達有關(guān).

圖2 OsRPK2 T1代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測、表達及表型分析Fig.2 PCR detection，expression and phenotype in OsRPK2 transgenic plants of T1generation

2.3 OsRPK2基因在水稻中的表達分析

考察OsRPK2基因在水稻不同器官組織和不同葉齡葉片中的表達情況，結(jié)果如圖3所示.

圖3 OsRPK2基因的組織特異性表達Fig.3 Tissue-specific expression of OsRPK2

分別提取日本晴的總RNA，研究OsRPK2基因在水稻不同組織器官中的表達，結(jié)果如圖3（a）所示.圖3 （a）所示為野生型水稻植株幼嫩的莖頂端分生組織（SAM）、幼根、成熟葉、成熟葉鞘、莖、不同時期穗中OsRPK2的表達情況.由此可知，OsRPK2基因在水稻的不同組織器官中均有表達，但在幼嫩的莖頂端分生組織中表達量最高，在其他組織中表達量較低.分析OsRPK2在水稻不同葉齡葉片中的表達，結(jié)果如圖3 （b）所示，OsRPK2基因在葉齡較小的最上部葉片、倒二葉、倒三葉中表達量較高，但在衰老的倒四葉中的表達量較低.這與其在不同組織器官中的表達結(jié)果吻合，暗示了OsRPK2在整個水稻植株的發(fā)育及衰老中具有重要作用.

3 結(jié)論

本研究利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建水稻類受體蛋白激酶基因OsRPK2的過表達載體，導(dǎo)入野生型水稻中產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株，以此探討該基因在水稻中除了與脅迫反應(yīng)相關(guān)之外的其他功能.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在水稻的莖頂端分生組織和幼齡葉片中表達量較高，在其他部位相對較低.莖頂端分生組織中有長期保持分生能力的原始細胞及剛衍生的細胞，為植物的器官和組織不斷合成新細胞［11］.OsRPK2基因在水稻莖頂端分生組織和幼齡葉片中高表達表明該基因可能與水稻發(fā)育密切相關(guān).另一方面，OsRPK2的過量表達也會造成水稻幼苗出現(xiàn)白化現(xiàn)象，白化苗最典型的特征就是葉綠體不能正常發(fā)育［12］，這說明OsRPK2基因與水稻葉片葉綠體的合成有關(guān)，過量表達會抑制葉綠體的正常合成.

本課題組今后還將構(gòu)建OsRPK2的RNAi載體，進一步揭示OsRPK2基因在干擾情況下的功能.從而全面揭示該基因與葉綠素合成及葉綠體發(fā)育途徑相關(guān)基因之間的相互作用和調(diào)控關(guān)系，精確闡明OsRPK2在水稻生長發(fā)育中的功能.

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（責(zé)任編校 紀翠榮）

Overexpression analysis of OsRPK2，a receptor-like protein kinase in rice

CAO Zhenhua，SONG Ting，LI Yingying，XIONG Wei，LIU Chenxi，LUAN Weijiang
（a.College of Life Sciences，b.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To investigate the function of OsRPK2，a receptor-like protein kinase in rice，the overexpression vector of Os-RPK2 was constructed and introduced into the wild type of rice to produce transgenetic plants.Phenotypic observation found that transgenetic lines exhibited albino phenotype.The qRT-PCR analysis revealed that the expression of OsRPK2 significantly increased in the albino seedings compared with wild type plants，which suggested that the albino phenotype of rice was caused by the overexpression of OsRPK2.The tissue specific expression of OsRPK2 showed that OsRPK2 was expressed in different organs of rice，especially with high expression in shoot apical meristem and young leaves，which indicated that OsRPK2 played important roles in the development and plant architecture of rice.

rice；receptor-like protein kinase OsRPK2；overexpression；albino

Q943.2

A

1671-1114（2016）03-0050-04

2015-12-23

國家自然科學(xué)基金資助項目（31171515）；天津市高校中青年骨干創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃資助項目（ZX110gg017）.

曹振華（1989—），女，碩士研究生.

欒維江（1971—），男，教授，主要從事水稻功能基因組學(xué)方面的研究.