新型卵母細胞載體降溫速率的實驗研究

李維杰　王利紅　劉寶林　周新麗　樓 偉　吳國榮

(1 上海理工大學生物熱科學研究所　上?！?00093；2 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院　上海　200233；3上海安久生物科技有限公司　上?！?01108)

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新型卵母細胞載體降溫速率的實驗研究

李維杰1王利紅2劉寶林1周新麗1樓 偉3吳國榮1

(1 上海理工大學生物熱科學研究所上海200093；2 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院上海200233；3上海安久生物科技有限公司上海201108)

降溫速率是決定細胞低溫保存效果的關鍵，而冷凍載體的形式和使用方式對細胞的降溫速率有重要影響。本文采用數(shù)字示波器、線徑80 μm的T型熱電偶建立高速測溫系統(tǒng)，研究了一種新型封閉式卵母細胞冷凍載體以不同的方式從空氣插入液氮的降溫速率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)載體的降溫主要通過對流換熱實現(xiàn)；載體橫臥時，載體的氣孔方向與液氮垂直時降溫速率高于氣孔與液氮相切時的降溫速率；將載體直接插入液氮時的降溫速度大于插入后左右擺動的操作方法的降溫速率；當采用載體倒置插入時，降溫速度高于采用載體正置和橫臥的降溫速率。當采用載體倒置直接插入時，降溫速率最高，可以達到54572 ± 1338 K/min，有利于卵母細胞的玻璃化保存。

冷凍載體；降溫速率；液氮；萊頓弗羅斯特效應

卵母細胞是哺乳動物的重要生殖細胞，對其低溫保存一直以來都是醫(yī)學研究的重要內(nèi)容[1-3]，早在1984年Jondet M等[4]報道了使用慢速冷凍的方法冷凍卵母細胞，但沒有對細胞的存活率等結(jié)果進行統(tǒng)計。之后的研究者逐漸意識到高速降溫實現(xiàn)玻璃化才能有效提高卵母細胞存活率，各種低溫保存載體被用于低溫保存。微滴法(Micro-Droplet)是早期的一種玻璃化冷凍方法，由Landa V等[5]較早用于胚胎保存，它是將卵母細胞懸浮溶液以液滴的形式彈射進入液氮進行冷凍，但是細胞的冷凍速率不高，對卵細胞的保存效果較差[6]。開放式拉伸麥管法(Open Pulled Straws，OPS)是一種使用較多的卵母細胞玻璃化冷凍方法，從1998年一直使用至今[7,8]。之后又發(fā)展出顯微鏡銅網(wǎng)格法(Electron Microscope Copper Grids，EMCG)[9]，由于冷凍保護液較多且細胞被完全包裹，阻礙了細胞與冷源間的傳熱。尼龍網(wǎng)法(Nylon Mesh)由Matsumoto H等[10]首先使用，該方法先將尼龍線圈浸入冷凍液中，借助溶液的表面張力作用，在線圈上形成一層薄膜，然后將預處理的卵母細胞加載到薄膜上，投入液氮中直接冷凍，該方法處理速度快。冷凍環(huán)法(Cryoloop)由Lane M等[11]首先提出，由于構(gòu)成Cryoloop的尼龍絲十分細軟，難以支撐冷凍保護劑液膜，操作十分困難，和尼龍網(wǎng)法一樣，都具有易受污染、不便保存和易破裂等缺點。石英毛細管法[12](Quartz Micro-Capillary，QMC)是在開放式拉伸麥管法基礎上發(fā)展而來的，所采用的材料為導熱性比塑料好的石英。與開放式拉伸麥管法相比，石英毛細管的管直徑更小，管壁更薄，所用的溶液體積比較小。Cryotop法是Kuwayama M等[13]于2005年根據(jù)最小化溶液體積原理提出的高速冷凍方法，此法用于卵母細胞的玻璃化保存后取得了較高的存活率和發(fā)育率，但是該方法依然是開放法，無法避免細胞污染。

上海安久生物科技有限公司提出了一種封閉式高速降溫的冷凍裝置，該裝置由兩部分構(gòu)成，包括一個底座，底座中心由薄膜構(gòu)成的厚度可以達到2 μm，底座上有螺紋可以和上蓋閉合，閉合后薄膜和上蓋構(gòu)成封閉腔體，上蓋和下蓋由貫穿孔從兩側(cè)穿過，冷凍時液氮從薄膜旁邊穿過。由于該方法保持樣品與液氮分離，安全性較高，同時由于接觸膜較薄，熱阻小，降溫效果較好。降溫速率是細胞冷凍成敗的決定因素[14]，由于涉及到對流等因素的影響，不同的操作方式造成降溫速率差別較大，有必要研究不同插入方式對該載體降溫速率的影響。

1　材料與方法

1.1 儀器和設備

DS1062CD示波器(RIGOL?，中國)；直徑80 μm T型熱電偶(Omega，美國)；液氮(復旦大學，中國)；卵母細胞載體(上海安久生物科技有限公司，中國)見圖1，其中上沿可以用手術鉗等器具夾取，載物膜與底座相連，為幾微米的薄膜，底座和上蓋采用螺紋連接，底座和上蓋有一個貫穿的孔，底座中空，方便冷源與薄膜接觸。

1.2 實驗方法

用針狀物在細胞載體底部扎孔，孔徑約500 μm，該孔與細胞保存腔體連通，將熱電偶測溫端從小孔插入，其頭部保持在載體腔內(nèi)，且不與腔體壁接觸，熱電偶參比端接示波器且暴露在空氣中，遠離冷源液氮，保證參比端的溫度不被冷源溫度干擾。使用手術鉗夾緊載體，做適當固定，將載體按一定的方式插入液氮，使用示波器記錄細胞載體降溫過程中電勢差-時間的散點圖。

圖1　冷凍載體的半剖組裝圖Fig.1 Assembly drawing of the freezing carrier(for details, half of the shell is removed)

1.3 插入方式

載體插入液氮的方式分為表1的6種方式，插入液氮的速度保持一致。

表1冷凍載體插入液氮的方式和氣孔與液氮的相對位置

Tab.1Ways of freezing carrier inserted into liquid nitrogen and relative positions of liquid nitrogen and air hole

實驗方案載體安置方式氣孔與液氮位置運動軌跡1正置切向垂直插入后左右擺2正置切向垂直插入3橫臥垂直垂直插入4橫臥切向垂直插入5倒置切向垂直插入后左右擺6倒置切向垂直插入

圖2具體展示了插入的方式和運動軌跡，箭頭代表運動軌跡。

1.4 數(shù)據(jù)處理[15-16]

對Omega公司提供的T型熱電偶的分度表擬合成函數(shù)為：

t=-0.046[E(t, 0)]4-0.109[E(t, 0)]3-0.829[E(t, 0)]2+26.22E(t, 0)+0.120

(1)

室溫為26 ℃，根據(jù)中間溫度定理，需要對電勢差修正：

E(t, 0)=E(t, 26)+E(26, 0)=E(t, 26) +1.033

(2)

將式(2)代入式(1)可得溫度與電勢差的關系為：

t=-0.046[E(t, 26)+1.033]4-0.109[E(t, 26)+1.033]3-0.829[E(t, 26)+1.033]2+26.22[E(t, 26)+1.033]+0.120

(3)

圖2 冷凍載體使用方式和軌跡Fig.2 Usages and movements of the freezing carrier

將電勢差-時間散點圖轉(zhuǎn)化為溫度-時間散點圖，對該圖分段擬合曲線求斜率，其值即為降溫速率，求取斜率最大部分的值作為最大降溫速率。溫度-時間散點圖示例見圖3。

圖3 溫度時間曲線圖Fig.3 Temperature vs time curve

2　結(jié)果與討論

2.1 實驗結(jié)果概述

當采用常規(guī)的使用方式，即載物臺正置插入后左右晃動的方式進入液氮時，腔體內(nèi)平均最快降溫速率為31276±6858 K/min，此速度只有常見的Cryotop[17]降溫速率的一半，因此可能難以實現(xiàn)玻璃化保存。當采用載體正置，直接插入的方式進入液氮時，降溫速率可以達到50476±13073 K/min，比直接插入后晃動的方式有所提高，但范圍波動較大，可能受插入速度影響較大。當采用載體橫臥、氣窗正對液面插入時，降溫速率顯著提高，可以達到49057±14106 K/min；當采用載體橫臥、氣窗與液氮相切進入液氮時，降溫速率與標準插入方式相近，只有31451±7605 K/min。載物臺倒置插入，左右晃動平均最快降溫速率為46299±11387 K/min。載物臺倒置插入，平均最快降溫速率為54572±1338 K/min。標準插入方式效果不佳，主要由于底座中空，插入過程會裹挾大量氣體進入腔體內(nèi)，根據(jù)萊頓弗羅斯特效應[18]，液氮并不能浸潤表面，從而延緩了降溫。盡管底座旁邊開有貫穿孔，由于氣體流出的速度遠小于降溫速率，阻力較大，液氮由于加熱氣化會源源不斷產(chǎn)生氣體并形成氣團，氣團一直集中載物膜上，影響了傳熱，實驗結(jié)果見表2。

表2不同插入方式的降溫速率

Tab.2The cooling rates of different inserting ways

測量次序最快段降溫速率/(K/s)最快段降溫速率/(K/min)1521±11431276±68582841±21750476±13073*3817±23549057±14106*4524±12631451±76055771±18946299±11387*6909±22354572±1338*

注：*表示p<0.01，差異極顯著。

2.2 運動方式對降溫速率的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當載體的擺放方式一致時，插入方式對降溫速率的影響較顯著。當采用載體正置和倒置的方式插入液氮時，直接插入的降溫速率比插入后擺動的降溫速率顯著提高。這是由于當采用一個簡單的插入動作時，插入速度可以很高；當采用復雜動作時，插入過程中由于要減速后改變運動方向，液氮流體在腔體內(nèi)經(jīng)歷了方向轉(zhuǎn)化，抑制了液體的流出速度，對流換熱速度較低，同時插入后再左右擺動容易造成初始插入速度不足，導致空腔內(nèi)部液氮和載體之間的對流不充分，極大影響了降溫速率。此外，載體在液氮內(nèi)滑動過程中會產(chǎn)生大量氮氣，氣體會在載體表面形成一層氣膜阻礙液氮和載物膜接觸，減緩了降溫速率。

2.3 氣孔與液氮相對位置對降溫速率的影響

方案(c)和方案(d)均采用了橫臥式插入液氮，不同點在于氣孔開口是否與液氮相切。當開口方向與液氮相切時，其降溫速率明顯低于開口與液氮垂直時的降溫速率，這是由于相切時液氮從開口表面劃過，不能直接從開口進入到空腔內(nèi)，熱量主要從載體的外壁傳導到載體外，外壁較厚，熱阻較大。當采用垂直插入時，液氮流體直接進入小孔，與內(nèi)部薄膜接觸，薄膜非常薄，熱阻小，液氮和冷凍樣品換熱好。

2.4 載體放置方式對實驗結(jié)果的影響

對于插入后左右擺動的運動方式來說，載體是否倒置對實驗結(jié)果影響不顯著(p=0.61)，可能擺動是造成降溫速率降低的重要原因，插入后再左右晃動容易造成初始插入速度不足，液氮和載體之間的強制對流不充分，極大影響了降溫速率。對于簡單的直插運動來說，載體的豎立顯著高于橫臥的降溫速率，其中倒置的降溫速率最高，達到54572±1338 K/min，可以實現(xiàn)細胞的玻璃化保存[19]。這可能由于倒置時載體的凹槽朝上，不易發(fā)生氮氣的裹挾，產(chǎn)生的氣體可以方便的與載體脫離，增加了紊流效果，提高了對流換熱系數(shù)，降溫速率較快。

3　結(jié)論

細胞低溫載體的傳熱方式主要以對流換熱為主，因此強制對流的優(yōu)劣決定了降溫速率的快慢，實驗是對降溫速率的篩選，實際是比較不同操作方法的對流換熱效果。實驗采用數(shù)字示波器、線徑80 μm的T型熱電偶建立高速測溫系統(tǒng)，測量低溫載體從空氣中插入液氮的瞬時降溫速度可知：載體橫臥時，氣孔與液氮相切時的降溫速率低于與液氮垂直時的降溫速率；直接插入時的速度大于插入后左右擺動時的速度；載體倒置時降溫速率高于載體正置和橫臥時降溫速率。當采用載體倒置直接插入時，降溫速率最高，最快降溫速率可以達到54572±1338 K/min，而常規(guī)的使用方式即載體正置，插入后擺動的降溫速率僅有31276±6858 K/min，但載體對細胞的保存效果還有待于進一步研究。

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About the corresponding author

Wang Lihong, female, Ph. D., associate chief physician, Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People′s Hospital, +86 21-63468920, E-mail:lihongwang1976@126.com. Research fields: cryopreservation of oocytes.

Experimental Study on the Cooling Rate of a New Type of Oocyte Carriers

Li Weijie1Wang Lihong2Liu Baolin1Zhou Xinli1Lou Wei3Wu Guorong1

(1. Institue of Biothermal Science and Technology, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai, 200093, China; 2. Shanghai Jiao Tong University Affiliated Sixth People′s Hospital, Shanghai, 200233, China; 3. Shanghai Anjiu Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, 201108, China)

Cooling rate is the key factor that determines the cryopreserving effect of cells, which has much to do with the forms and the usages of freezing carrier. In this study, digital oscilloscopes and type T thermocouple of 80 μm diameter were employed to establish a high speed temperature measurement system. The cooling rates of cells were measured by using a new type of enclosed oocyte freezing carrier in different ways of being inserted from air to liquid nitrogen. The results showed that the cooling of freezing carrier is mainly fulfilled via heat convection; when the carriers were horizontally placed, the cooling rate of carrier when the air hole was perpendicular to liquid nitrogen is higher than that when the air hole was tangent to liquid nitrogen; when the freezing carrier was directly inserted into liquid nitrogen, the cooling rate of carrier was higher than that when the freezing carrier was inserted into liquid nitrogen and then swayed; when the freezing carrier was placed downwards, the cooling rate of carrier was higher than that vertically or horizontally placed. Based on the results mentioned above, when the carrier was directly inserted into liquid nitrogen downwards, the cooling rate could reach as high as 54572 ± 1338 K/min, which is the highest and favorable to verification of oocytes.

freezing carrier; cooling rate; liquid nitrogen; Leidenfrost effect

0253-4339(2016) 01-0114-05

10.3969/j.issn.0253-4339.2016.01.114

國家自然科學基金(81300554)資助項目。(The project was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81300554).)

2015年4月18日

TB61+1；R318.52

A

簡介

王利紅，女，博士，副主任醫(yī)師，上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院，(021)63468920，E-mail: lihongwang1976@126.com。研究方向：卵母細胞低溫保存。