溪黃草抗乙型肝炎病毒體外抑制作用研究

龐瓊，胡志立（.郴州市疾病預(yù)防控制中心體檢科，湖南423000；2.湘南學(xué)院胃腸外科，湖南郴州423000）

·論著·

溪黃草抗乙型肝炎病毒體外抑制作用研究

龐瓊1，胡志立2△
（1.郴州市疾病預(yù)防控制中心體檢科，湖南423000；2.湘南學(xué)院胃腸外科，湖南郴州423000）

目的為證實(shí)溪黃草單味藥具有體外抗乙型肝炎病毒活性提供重要的科學(xué)依據(jù)。方法將溪黃草50%乙醇提取物配置成一定藥物濃度，擬采用HepG2.2.15細(xì)胞模型進(jìn)行細(xì)胞毒試驗(yàn)和乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）酶聯(lián)免疫檢測。結(jié)果半數(shù)細(xì)胞抑制時(shí)其濃度為4.275mg/mL，溪黃草粗提物對HBsAg的半抑制濃度（IC50）為2.250mg/mL，對HBeAg的IC50為2.150mg/mL，治療指數(shù)小于2。結(jié)論溪黃草粗提物具有抑制體外乙型肝炎病毒的作用。

溪黃草；肝炎病毒，乙型；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；植物，藥用；細(xì)胞毒性試驗(yàn)，免疫

【Abstract】Objective To provide an important scientific basis for verifying the in vitro anti-HBV activity of single herb Rabdosia Serra.M ethods 50% ethanolextract of Rabdosia Serra was dispensed ascertain concentrations.The HepG 2.2.15 cellularmodel was adopted to conduct the cellular toxicity testand HBs Ag and HBe Ag enzyme-linked immunosorbentssay（ELISA）. Results IC50was 4.275mg/mL，IC50of crude extract of Rabdosia Serra on HBs Ag was 2.250mg/mL，which on HBe Ag was 2.150 mg/mL，the therapeutic index（TI）＜2.Conclusion The crude extract of Rabdosia Serra has the effect for in vitro inhibiting HBV.

【Key words】Isodon striatus；Hepatitis B virus；Cell culture techniques；Plants，medicinal；Cytotoxicity tests，immunologic

目前，乙型肝炎病毒（HBV）感染呈世界性流行趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染HBV，其中2.4億人為慢性HBV感染者［1］。2006年全國乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào)查表明，我國1～59歲人群乙型肝炎表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18%［2-3］。據(jù)此推算，我國有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性CHB患者約2 000萬例［4］。我國是乙型肝炎大國，因此，國家將乙型肝炎藥物的研發(fā)作為重點(diǎn)研究項(xiàng)目。溪黃草屬唇形科香茶菜屬，多年生草本植物，香茶菜屬植物在民間做藥用，功效之一即為能夠治療各種肝炎。到目前為止，大多數(shù)對溪黃草的研究集中在對其化學(xué)成分的分離與鑒定上，而抗乙型肝炎的實(shí)驗(yàn)研究較少，對HBV的體外抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究更少，且大部分是采用以溪黃草為主的復(fù)方制劑為研究對象，因此，該實(shí)驗(yàn)研究溪黃草單味藥體外抗HBV活性部位有利于深度開發(fā)溪黃草。該研究用HepG2.2.15作為細(xì)胞模型，將溪黃草50%乙醇提取物配置成一定藥物濃度，進(jìn)行體外抑制HBV試驗(yàn)。

1　材料與方法

1.1材料溪黃草（購自長沙市中藥大市場），乙醇（國產(chǎn)分析純），HepG2.2.15細(xì)胞（購自中南大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)中心），RPMI1640干粉，胎牛血清，G-418（Geneticin），谷氨酰胺，青鏈霉素（雙抗），RPMI1640培養(yǎng)液，噻唑藍(lán)（MTT）反應(yīng)液，細(xì)胞消化液（0.25%胰酶），HBV表面抗原診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法），乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法），HBV核酸擴(kuò)增（HBV PCR）熒光檢測試劑盒，氨水，阿昔洛韋片（0.1 g/片）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，離心機(jī)（KA-1000型），超凈工作臺（YJ-875型），生化培養(yǎng)箱（SP-01型），艾科浦純水機(jī)（AFX-Z-1001-P型），恒溫水浴箱（HWS-26型），酶標(biāo)儀，熒光定量PCR儀，培養(yǎng)瓶，96孔板。

1.2方法

1.2.1HepG2.2.15細(xì)胞株的培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇。

1.2.2藥物的配制選取溪黃草50%乙醇提取物，阿昔洛韋分別用0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成一定濃度；5%NaHCO3、1mol/LHCl調(diào)pH值至6.8～7.2，0.25μm針頭過濾器過濾后備用。

1.2.3細(xì)胞毒性測定HepG2.2.15細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化液消化成單個(gè)細(xì)胞，吹打均勻后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)2×104個(gè)，37℃，5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。溪黃草提取物3 g，用100mL的0.1%DMSO稀釋成30mg/mL制成儲備液，再用0.1%DMSO稀釋成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0mg/mL 5個(gè)濃度，每孔20μL加于96孔板，每濃度4孔，分別在3、6、9 d換同濃度藥液，設(shè)無藥物細(xì)胞對照組和培養(yǎng)液空白對照組及阿昔洛韋陽性對照組，作用9 d后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。吸取上清用于抗原檢測，每孔加入100μL培養(yǎng)液，加入10μL濃度為5mg/mL的噻唑藍(lán)（MTT）；在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，可見紫黑色顆粒，棄去培養(yǎng)液及MTT液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩后顆粒溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀測450 nm光密度（OD）值OD450。

1.2.4對HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg、HBeAg合成分泌的抑制實(shí)驗(yàn)用0.1%DMSO稀釋成0.3、0.8、1.0、2.0、2.5mg/mL 5個(gè)濃度，設(shè)無藥物細(xì)胞對照組和培養(yǎng)液空白對照組，阿昔洛韋陽性對照組，作用9 d后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBsAg、HBeAg抗原含量。每孔加入待測標(biāo)本（即上清培養(yǎng)液）50μL，再將每孔中加入酶結(jié)合物50μL（空白對照組除外），充分混勻后封板，置37℃孵育8 h。手工洗板，棄去孔內(nèi)液體，洗滌液儲滿各孔，靜置5 s后甩干，重復(fù)5次后拍干。每孔加入顯色板A、B液各50μL，充分混勻，封板，置37℃孵育15min。最后，每孔加入終止液50μL，混勻。用酶標(biāo)儀測定，先用空白孔校零，然后讀取450 nm處各孔OD值。當(dāng)日不進(jìn)行測定的細(xì)胞培養(yǎng)上清，需放置在-20℃保存。

1.2.5對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA合成分泌的抑制實(shí)驗(yàn)對抗原檢測確實(shí)有效的藥物，留存細(xì)胞培養(yǎng)上清。采用HBVPCR熒光檢測試劑盒，檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量。具體操作，取9 d的上清合并液加等量DNA提取液打勻，沸水浴10 min（誤差不超過1min），轉(zhuǎn)至4℃靜置8～12 h以保證病毒顆粒充分裂解。10 000 r/min離心5min，取上清保存DNA于-20℃?zhèn)溆?。提取上清液中的DNA加入HBVDNA PCR熒光檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)管（已加入HBV DNA特異性引物、一條HBVDNA特異性熒光探針、耐熱Taq DNA聚合酶、4種核苷酸單體dNTPs，PCR反應(yīng)液）。用ABI7000實(shí)時(shí)定量檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞抑制百分率（%）=［（細(xì)胞對照OD450值-加藥組OD450值）/（細(xì)胞對照OD450值-空白OD450）］×100%。TC50：以細(xì)胞抑制率對藥物濃度用Origin軟件擬合，若曲線形狀為典型的S型濃度-效應(yīng)曲線，可得到抑制細(xì)胞生長50%時(shí)所需藥物濃度，即TC50。取儲備液稀釋成2.5、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL 5個(gè)濃度，作用于HepG2.2.15，MTT實(shí)驗(yàn)后，經(jīng)計(jì)算得抑制率分別為1.0%、7.2%、21.0%、56.0%、60.3%，經(jīng)Origin軟件擬合，其半數(shù)細(xì)胞抑制時(shí)其濃度為4.275mg/mL，即TC50為4.275 mg/mL，陽性對照組的TC50為0.370mg/mL。

2.2抗原分泌抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果抗原抑制率（%）=［（細(xì)胞對照OD450-加藥組OD450值）/（細(xì)胞對照組OD450-空白OD450）］×100%。將藥物濃度與抑制率輸入軟件，通過量效關(guān)系來擬合曲線，從而推算出半抑制濃度（IC50），即半數(shù)有效濃度，也是抑制抗原分泌達(dá)50%時(shí)所需的藥物濃度。溪黃草50%提取物有抗HBV活性。在無毒濃度2.5 mg/mL時(shí)對HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制率為51.8%；對HBeAg的抑制率為53.4%。經(jīng)Origin軟件S曲線擬合，溪黃草粗提物對HBsAg的IC50為2.25mg/mL，對HBeAg的IC50為2.15mg/mL。見表1、2。

表1　溪黃草50%乙醇提取物對HepG2.2.15分泌HBsAg的抑制情況

表2　溪黃草50%乙醇提取物對HepG2.2.15分泌HBeAg的抑制作用

2.3TI TI=TC50/IC50當(dāng)TI＜1.0表明受試樣品為無效；1～2為低效有毒，即弱陽性；＞2～＜10為有效低毒，即陽性；≥10為高效低毒，即強(qiáng)陽性。根據(jù)細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，及體外乙型肝炎抗原分泌抑制實(shí)驗(yàn)，計(jì)算得到溪黃草50%提取物對HBsAg的治療指數(shù)為1.90；對HBeAg的治療指數(shù)為1.99。因此，為有效低毒。陽性對照組HBeAg的IC50為7.750mg/mL，TI為0.048＜2；HBsAg的IC50為0.001 mg/mL，TI為328.472＞2。

2.4對HepG2.2.15細(xì)胞合成HBVDNA作用結(jié)果為進(jìn)一步確證溪黃草50%提取物的抗病毒作用，采用熒光定量PCR方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBV DNA含量。即濃度為0mg/mL，DNA拷貝數(shù)為280×103；濃度為0.5mg/mL，DNA拷貝數(shù)為190×103；濃度為1.0mg/mL，DNA拷貝數(shù)為96×103；濃度為2.0mg/mL，DNA拷貝數(shù)為57×103；濃度為2.5mg/mL，DNA拷貝數(shù)為22×103。

溪黃草粗提物對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA有抑制作用，且隨濃度的增加，細(xì)胞培養(yǎng)上清中HBVDNA含量減少，呈劑量依賴關(guān)系，見圖1。溪黃草50%提取物對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg均有抑制作用，且呈劑量-效應(yīng)依賴關(guān)系。陽性對照組僅對HBsAg有抑制作用。從以上抑制抗原及HBV DNA的實(shí)驗(yàn)可以看出，溪黃草50%乙醇提取物具有抗HBV的活性，因此，可將溪黃草50%乙醇的提取物繼續(xù)進(jìn)行下一步的分離。3討論

圖1　溪黃草95%提取物抑制HBVDNA分泌活性檢測情況

目前治療HBV以干擾素及核苷類似物為主，而其均具有一定的使用局限性。比如干擾素-α（INF-α），來源于宿主細(xì)胞對病毒發(fā)生免疫應(yīng)答而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，既有免疫調(diào)節(jié)作用，又有抗病毒的作用。但由于其不良反應(yīng)明顯，可加重某些免疫性疾病，而且高病毒載量者應(yīng)答率低，因此，INF-α的使用受到一定的限制［5］。

我國天然植物資源豐富，從中找到了抗HBV的天然有效成分，具有極其重要的社會意義和經(jīng)濟(jì)意義。目前已研制出以溪黃草為組方的保健產(chǎn)品，溪黃草茶已在市場上廣泛應(yīng)用［6］。臨床上已將溪黃草用于治療HBV，例如使用新鮮溪黃草汁（溪黃草I.Prrd）加蜜糖口服，治療臨床診斷的HBV［7］，采用自擬蛇參虎溪湯治療HBV，總有效率達(dá)83.8%［8］。還有研究者做過溪黃草的復(fù)方制劑對HBV的體外抑制作用，發(fā)現(xiàn)十味溪黃草顆粒在HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)中對HBsAg、HBeAg的分泌有顯著的抑制作用［9］。由此看來，從民間藥用到臨床使用再到藥物實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究，都為溪黃草抗HBV作用提供了初步證據(jù)。本研究將單味溪黃草藥物作為研究對象，進(jìn)行抗HBV體外抑制研究，具有新的研究價(jià)值，為開發(fā)中草藥治療HBV提供科研依據(jù)。

血清HBsAg定量檢測可用于預(yù)測疾病進(jìn)展、抗病毒療效和預(yù)后［10-11］。因此，本研究選取了HBsAg、HBeAg進(jìn)行酶聯(lián)免疫檢測。而HBVDNA定量檢測主要用于判斷慢性HBV感染的病毒復(fù)制水平，可用于抗病毒治療適應(yīng)證的選擇及療效的判斷。因此，本實(shí)驗(yàn)采用靈敏度和精確度高的PC R法來測定HBV DNA。

雖然本研究證實(shí)了單味溪黃草具有體外抗HBV的作用，但藥物進(jìn)入體內(nèi)后，要進(jìn)行復(fù)雜的代謝，產(chǎn)生一些新的有效成分，也可能有些有效成分會被滅活，或體內(nèi)、體外有效的藥物濃度會存在較大差距，為進(jìn)一步驗(yàn)證溪黃草抗HBV的作用，下一步還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。

綜上所述，溪黃草50%乙醇提取物具有體外抗HBV的活性，因此，可將溪黃草50%乙醇的提取物繼續(xù)進(jìn)行下一步的分離，為篩選溪黃草體外抗HBV活性部位提供素材。

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Study on in vitro inhibiting effect of Rabdosia Serra in anti-HBV

Pang Qiong1，Hu Zhili2△
（1.Chenzhou Municipal Center

for Disease Control and Prevention，Chenzhou，Hunan 423000，China；2.Department of Gastroent erological Surgery，Affiliated Hospitalof Xiangnan College，Chenzhou，Hunan 423000，China）

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.010

A

1009-5519（2016）10-1465-03

龐瓊（1981-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事臨床及相關(guān)基礎(chǔ)研究工作。

△，E-mail：50381234@qq.com。

（2016-02-18）