牙齦缺損修復(fù)中鈣結(jié)合蛋白和膠原酶-1的濃度變化*

董露，楊琴秋，肖瓊，尹曉樺，陳紅亮，孫勇△（.涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院口腔科，四川西昌65000；.遂寧市第一人民醫(yī)院口腔科，四川69000；.重慶拜博口腔醫(yī)院管理有限公司九龍坡口腔醫(yī)院，重慶0005；.中國人民解放軍成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科，四川成都600）

·論著·

牙齦缺損修復(fù)中鈣結(jié)合蛋白和膠原酶-1的濃度變化*

董露1，楊琴秋2，肖瓊3，尹曉樺1，陳紅亮4，孫勇4△
（1.涼山彝族自治州第一人民醫(yī)院口腔科，四川西昌615000；2.遂寧市第一人民醫(yī)院口腔科，四川629000；3.重慶拜博口腔醫(yī)院管理有限公司九龍坡口腔醫(yī)院，重慶400051；4.中國人民解放軍成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院口腔科，四川成都610041）

目的檢測富血小板纖維蛋白（PRF）膜與膠原膜修復(fù)拔牙術(shù)后牙齦缺損各時間節(jié)點(diǎn)的分泌物中鈣結(jié)合蛋白和膠原酶-1的水平，評價PRF對牙齦缺損的修復(fù)和調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)的能力。方法選取2013年8月至2014年12月到成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院種植修復(fù)臨床?？浦行木驮\，需拔除磨牙并同期進(jìn)行位點(diǎn)保存的患牙16例，隨機(jī)分為PRF膜組和膠原膜組，各8例。拔牙后，牙槽窩內(nèi)植入Bio-Oss骨替代材料，表面分別覆蓋PRF膜或膠原膜。通過ELISA檢測術(shù)區(qū)在術(shù)后3、7、14、21、28 d創(chuàng)面分泌物中膠原酶-1和鈣結(jié)合蛋白的水平，動態(tài)評價PRF對牙齦缺損的修復(fù)和調(diào)節(jié)局部炎性反應(yīng)的能力。結(jié)果鈣結(jié)合蛋白水平在術(shù)后3、7 d膠原膜組均明顯高于PRF膜組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后14、21、28 d膠原膜組稍高于PRF膜組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。膠原酶-1水平在術(shù)后3、7 d PRF膜組均明顯高于膠原膜組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后14、21、28 d PRF組稍高于膠原膜組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 PRF能促進(jìn)牙齦缺損的修復(fù)，減輕術(shù)區(qū)局部炎性反應(yīng)。PRF膜是一種有一定抗感染能力的生物活性再生平臺材料，有一定的臨床價值。

牙齦疾?。烩}結(jié)合蛋白質(zhì)類；富血小板纖維蛋白；膠原酶類；牙修復(fù)體；口腔

【Abstract】Objective To detect the levelsof calbindin and collagenase-1 in the secretion atvarious time nodes of gingivalde fectafter teeth extraction operation by the platelet-rich fibrin（PRF）membrane and collagen membrane，and to evaluate the ability of PRFon repairing the gingival defectand regulating the local inflammatory reaction.Methods Sixteen teeth needing to extractpremolar teeth ormolarand simultaneously conducting the site preservation in the Special Dental Implantation and Repair ClinicalCenterof the Chengdu Military Region from August 2013 to December 2014 were selected and divided into the PRF group and collagen membrane group，8 cases in each group.Afterextracting teeth，the tooth socketin the two groups was implanted by the bone substitutematerials（Bio-Oss）and the surface was respectively covered by the PRF membrane and the collagen membrane. ELISA was used to detect the collagenase-1 and calbindin levels in the wound secretion on postoperative 3，7，14，21，28 d.The ability of PRF on the repair of gingival detection and regulation of local in flammatory reaction was dynamically evaluated.Results

The calbindin levelon postoperative 3，7 d in the collagen membrane group was higher than that in the PRF membrane group，and the difference was statistically significant（P＜0.05），the calbindin levelon postoperative 14，21，28 d in the collagen membrane group was slightly higher than that in the PRF membrane group，but the difference was not statistically significant（P＞0.05）.The collagenase-1 levelon postoperative 3，7 d in the PRF membrane group was significantly higher than that in the collagen membrane group，there are statistically significant difference（P＜0.05），which on 14，21，28 d in the PRF membrane group was slightly higher than that in the collagen membrane group，the difference was notstatistically significant（P＞0.05）.Conclusion PRF membrane can promote the repair of gingival defectand decrease local in flammatory reaction.PRF membrane is a biological activity regeneration platform material with some anti-infection ability and hasa certain clinicalvalue.

【Key words】Gingivaldiseases；Calcium-bindingproteins；Platelet-rich-fibrin；Collagenases；Dental prosthesis；Mouth

牙齦缺損的修復(fù)是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子參與調(diào)控的一個復(fù)雜過程，其中起到重要作用的蛋白有鈣結(jié)合蛋白（calbindin）和膠原酶-1（collagenase-1）。鈣結(jié)合蛋白在口腔炎癥疾病患者的唾液、齦溝液和局部組織中高水平表達(dá)［1］；而膠原酶-1通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分從而實(shí)現(xiàn)新生血管的形成，促進(jìn)軟組織愈合［2］。本研究通過收集患牙拔除后行位點(diǎn)保存術(shù)患者術(shù)區(qū)術(shù)后牙齦軟組織缺損創(chuàng)面分泌物，檢測其中鈣結(jié)合蛋白和膠原酶-1的水平，分析探討富血小板纖維蛋白（PRF）膜促進(jìn)牙齦缺損修復(fù)和減輕炎性反應(yīng)的能力。

1　資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料選取2013年8月至2014年12月到成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院種植修復(fù)臨床?？浦行木驮\，因各種原因需要拔除磨牙并同期進(jìn)行位點(diǎn)保存的患牙16例，共16顆磨牙。按就診順序，采用隨機(jī)數(shù)字化表分為PRF膜組和膠原膜組，各8例。

1.1.2納入標(biāo)準(zhǔn)拔牙后牙齦軟組織缺損面積大于或等于5mm×5mm；拔牙位點(diǎn)及周圍軟組織無炎癥；鄰牙無炎癥，松動度小于Ⅰ度；全身健康；血小板計(jì)數(shù)（100～300）×109L-1，采血前3個月未服用過影響血液中血小板功能的藥物；未服用影響牙齦愈合的藥物，如抗癲癇藥物、免疫抑制劑等。

1.1.3材料與試劑Bio-Oss骨替代材料（Geistlich Pharma AG，瑞士），海奧口腔修復(fù)膜（正海生物技術(shù)有限公司，煙臺），1.5mL EP管（Axygen公司，美國），3M濾紙（Whatman，英國），人膠原酶-1 ELISA試劑盒（Abcam公司，美國），人鈣結(jié)合蛋白ELISA試劑盒（Abcam公司，美國）等。

1.2方法

1.2.1位點(diǎn)保存術(shù)多根牙術(shù)前半小時分牙，常規(guī)消毒，鋪巾，微創(chuàng)拔除患牙，刮盡術(shù)區(qū)肉芽組織，給予甲硝唑及生理鹽水交替沖洗，窩洞內(nèi)植入Bio-Oss骨替代材料，平齊于牙槽嵴頂，其后根據(jù)不同組別表面分別覆蓋海奧膠原膜（膠原膜組）或PRF膜（PRF膜組），嚴(yán)密縫合。所有手術(shù)均由同一醫(yī)生完成。

1.2.2PRF的制備拔牙前5min采用一次性采血針采集患者肘靜脈血9mL置于無抗凝劑的真空采血管，立即放入PRF離心機(jī)中，以2 700 r/min離心12min后，得到介于頂部少細(xì)胞質(zhì)液層和底部紅細(xì)胞層間的PRF凝膠層，在超凈工作臺里棄上清液取出PRF凝膠，修剪過多的紅細(xì)胞層，將PRF置于PRF成型處理工具盒中制備成膜，并置于擠壓過程中的滲出液中待用［3］。

1.2.3創(chuàng)面分泌物的采集、保存、檢測方法將3M濾紙條剪為2mm×8mm的濾紙條，5根濾紙條放入1個EP管中，編號、消毒、烘干備用。去除術(shù)區(qū)的食物殘?jiān)?，棉球隔濕，三用槍輕輕將創(chuàng)面吹干后，將5根濾紙條輕輕插入創(chuàng)面邊緣，遇到阻力后停止，留置1min后取出濾紙條放入EP管中，丟棄血液和唾液污染的樣本。將樣本立刻放入-80℃的冰箱中保存。采用ELISA測定樣品中人鈣結(jié)合蛋白和膠原酶-1的水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對兩組資料進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，均滿足正態(tài)分布，計(jì)量資料以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中鈣結(jié)合蛋白水平比較兩組在術(shù)后3、7 d創(chuàng)面分泌物中鈣結(jié)合蛋白水平均明顯高于基準(zhǔn)線［（503.47±18.23）μg/mL］，14、21、28 d時兩組分泌物中鈣結(jié)合蛋白水平與基準(zhǔn)線相差不大。術(shù)后3、7 d時膠原膜組鈣結(jié)合蛋白水平均高于PRF膜組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后14、21、28 d膠原膜組均稍高于PRF膜組，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1　兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中鈣結(jié)合蛋白水平比較（±s，μg/mL）

表1　兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中鈣結(jié)合蛋白水平比較（±s，μg/mL）

注：與PRF組同一時間點(diǎn)比較，aP＜0.05。

組別PRF膜組膠原膜組術(shù)后3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 460.71±20.84 481.82±20.22 n 8 8 598.47±28.24 694.39±67.51a522.47±17.25 629.35±56.73a486.46±17.29 530.01±33.61 513.00±43.31 553.63±36.46

2．2兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中膠原酶-1水平比較術(shù)后3～28 d兩組創(chuàng)面分泌物中膠原酶-1水平均高于基準(zhǔn)線［（29.13±3.57）μg/mL］。在術(shù)后3、7 d PRF膜組的膠原酶-1水平均明顯高于膠原膜組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；術(shù)后14、21、28 d PRF膜組均稍高于膠原膜組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2　兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中膠原酶-1水平比較（±s，μg/mL）

表2　兩組術(shù)后不同時間創(chuàng)面分泌物中膠原酶-1水平比較（±s，μg/mL）

注：與PRF組同一時間點(diǎn)比較，aP＜0.05。

組別PRF膜組膠原膜組術(shù)后3 d 7 d 14 d 21 d 28 d 33.45±2.33 31.47±1.88 n 8 8 39.83±2.90 34.94±1.7a46.02±5.23 38.80±1.32a40.15±2.58 38.02±1.76 36.63±2.22 35.27±0.82

3　討論

牙齦軟組織缺損導(dǎo)致術(shù)區(qū)不能有效關(guān)閉，臨床上常采用頰側(cè)滑行粘骨膜瓣、游離粘骨膜瓣移植、覆蓋膠原生物膜等方法，但是這些方法增加患者痛苦、費(fèi)用較高、存在免疫原性風(fēng)險等；嚴(yán)重影響拔牙后即刻種植手術(shù)、拔牙位點(diǎn)保存術(shù)的效果。因此，尋找一種方便、經(jīng)濟(jì)、快速具有引導(dǎo)牙齦軟組織再生的材料迫在眉睫。

鈣結(jié)合蛋白存在于粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞中，其為胞漿蛋白，創(chuàng)傷早期適量的鈣結(jié)合蛋白可促進(jìn)傷口的愈合，在創(chuàng)傷修復(fù)后期過度地產(chǎn)生鈣結(jié)合蛋白將延緩創(chuàng)面的愈合時間［2］。損傷后牙齦上皮的基底層角質(zhì)細(xì)胞增殖并快速釋放膠原酶-1，并在愈合期間持續(xù)釋放，膠原酶-1通過降解細(xì)胞外基質(zhì)成分實(shí)現(xiàn)新生血管的形成，上皮細(xì)胞的有效遷移。因此，膠原酶-1水平可代表牙齦創(chuàng)傷處角質(zhì)細(xì)胞增殖分化的能力。創(chuàng)面滲出液是損傷后創(chuàng)面愈合所處的一個微環(huán)境，急性創(chuàng)面的滲出液可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和創(chuàng)面的愈合，通過對滲出液成分含量的檢測可以反映創(chuàng)面的愈合情況［4］。

法國學(xué)者Dohan等［5］首次發(fā)現(xiàn)PRF并將其成功用于口腔頜面外科手術(shù)后許多學(xué)者掀起了對PRF修復(fù)軟組織的研究熱潮。研究發(fā)現(xiàn)PRF中血小板濃度比正常值高3～7倍，白細(xì)胞濃度比正常值高2～4倍［6］。PRF中血小板α-顆粒能釋放多種生長因子如血小板衍生生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、表皮生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等，這些生長因子協(xié)同促進(jìn)軟組織愈合［7-8］；另外，PRF中三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中含有大量的白細(xì)胞，可釋放高濃度促炎性細(xì)胞因子及抗炎性細(xì)胞因子，具有維持免疫平衡的作用［9-10］。本研究結(jié)果顯示，術(shù)后3、7 d PRF膜組鈣結(jié)合蛋白水平低于膠原膜組，而膠原酶-1水平卻相反，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但在其余時間節(jié)點(diǎn)比較，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示術(shù)后3、7 d PRF促進(jìn)牙齦軟組織生長和減輕炎癥的能力強(qiáng)于膠原膜。孫潔［11］在拔牙位點(diǎn)保存術(shù)中將PRF覆蓋于骨替代材料表面（試驗(yàn)組），術(shù)后1周試驗(yàn)組傷口愈合良好，但對照組（骨替代材料表面覆蓋膠原膜）牙齦組織色澤偏紅，與本研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于PRF的超微結(jié)構(gòu)、組成成分、體外誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化的能力、促進(jìn)骨組織修復(fù)再生效果報(bào)道較多；而PRF促進(jìn)牙齦軟組織缺損的修復(fù)再生主要集中在細(xì)胞水平［12-13］。本研究初步說明PRF膜是一種具有引導(dǎo)牙齦軟組織再生能力，避免生物安全性風(fēng)險且具有一定抗感染能力的生物活性再生平臺材料，具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

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Changes of calbindin and collagenase-1 concentrations in repair of gingivaldefects

Dong Lu1，Yang Qinqiu2，Xiao Qiong3，Yin Xiaohua1，Chen Hongliang4，Sun Yong4△
（1.Department of Stomatology，F(xiàn)irst People′s Hospital of Liangshan Yi Autonomous Prefecture，Xichang，Sichuan 615000，China；2.Department of Stomatology，Suining Municipal First People′s Hospital，Suining，Sichuan 629000，China；3.Jiulongpo Dental Hospital of Chongqing Bybo Dental Hospital Administrative Co.，Ltd.，Chongqing 400051，China；4.Departmentof Stomatology，Institution Hospital of Chengdu Military Region，Chengdu，Sichuan 610041，China）

·論著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.10.001

A

1009-5519（2016）10-1441-02

成都軍區(qū)“十二五”科研面上項(xiàng)目（C14050）。

董露（1986-），碩士研究生，主要從事口腔種植修復(fù)研究工作。

△，E-mail：2623457656@qq.com。

（2016-01-19）