貴州及周邊地區(qū)斑蝥資源抗人肝癌HepG2細(xì)胞的活性研究*

郭　侃，李曉飛，晏　容，劉　云，張　沛，劉　流△（.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義5600；.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義5600；.貴州省柏強(qiáng)制藥有限公司，貴陽550000）

貴州及周邊地區(qū)斑蝥資源抗人肝癌HepG2細(xì)胞的活性研究*

郭侃1，李曉飛1，晏容1，劉云2，張沛3，劉流1△
（1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州遵義563003；2.貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義563003；3.貴州省柏強(qiáng)制藥有限公司，貴陽550000）

目的初步分析貴州及周邊不同地域種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素的含量，篩選出抗人肝癌HepG2細(xì)胞效果顯著的地域種。方法采用水提結(jié)合斑蝥素方式提取有效成分，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析提取液內(nèi)的結(jié)合斑蝥素含量，采用磺酰羅丹明染色法（SRB法）考察提取液對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的體外抗腫瘤活性，應(yīng)用倒置相差顯微鏡檢測凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果貴州省羅甸縣境內(nèi)南方大斑蝥與黃黑小斑蝥體內(nèi)所含結(jié)合斑蝥素含量均高于其他地區(qū)同種斑蝥，分別為375、290 mg/L；不同地域種的斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖均有抑制作用，其中貴州茂丼鎮(zhèn)境內(nèi)的2種斑蝥對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制效果明顯優(yōu)于其他地區(qū)同種斑蝥，其半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為0.78、0.65 mg/L；形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示，茂丼鎮(zhèn)南方大斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素可促進(jìn)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡，且凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)典型的形態(tài)特征。結(jié)論不同地域不同種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素的含量存在較大差異；茂丼鎮(zhèn)境內(nèi)2種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于其他地域種，可進(jìn)行深入研究。

斑蝥；斑蝥素；肝腫瘤；腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)的；氣相色譜-質(zhì)譜法；貴州

一直以來，斑蝥素被認(rèn)為是斑蝥體內(nèi)的抗癌活性物質(zhì)［1］，但本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素在斑蝥體內(nèi)有2種存在形式——游離斑蝥素和結(jié)合斑蝥素［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)合斑蝥素多數(shù)為斑蝥素鹽類衍生物，并且這些斑蝥素鹽類衍生物的種類及含量在不同地域的不同種斑蝥之間存在著很大的差異［3］，因此抗腫瘤效果也有巨大差異［4-9］。斑蝥在我國分布較廣，主產(chǎn)于貴州、廣西、陜西、云南、四川等省，但目前對(duì)其藥用資源的系統(tǒng)研究較少。本研究通過對(duì)貴州及周邊地區(qū)的斑蝥資源進(jìn)行系統(tǒng)深入的采集、鑒定和歸類，測定斑蝥中結(jié)合斑蝥素的含量；以斑蝥素酸鈉為陽性對(duì)照，測定不同地域不同種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制活性，篩選出抗腫瘤活性較好的優(yōu)良地域種。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1斑蝥蟲來源斑蝥蟲體收集自貴州若干縣、區(qū)、鄉(xiāng)、鎮(zhèn)及四川、云南、廣西和陜西等產(chǎn)區(qū)，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院李曉飛博士鑒定各個(gè)產(chǎn)區(qū)的蟲體分別為南方大斑蝥與黃黑小斑蝥（以地區(qū)后綴“大”和“小”分別表示南方大斑蝥與黃黑小斑蝥）。

1.1.2試劑人肝癌HepG2細(xì)胞和斑蝥酸鈉均由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心提供。斑蝥素標(biāo)準(zhǔn)品購自上海Aladdin公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Hyclone公司；磺酰羅丹明（SRB）購自美國Sigma公司；胰蛋白酶、其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器Agilent 6890-5973N氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀購自美國安捷倫公司；Agilent HP-5MS色譜柱購自美國安捷倫公司。3131型CO2培養(yǎng)箱、Multiskan spectrum全波長酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Ti-S倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；超純水制備系統(tǒng)購自美國Millpore公司。

1.2方法

1.2.1結(jié)合斑蝥素提取純化［10］將斑蝥成蟲蟲體烘干后用粉碎機(jī)粉碎，干燥后置于容器中，加入足量三氯甲烷，搖勻，靜置24 h，過濾，殘?jiān)萌燃淄闆_洗3次，干燥，獲得去除游離斑蝥素的斑蝥粉末，取質(zhì)量為20倍的蒸餾水浸泡24 h，過濾，即得結(jié)合斑蝥素水提液，抽濾除菌，備用。

1.2.2斑蝥素的萃取取10 mL結(jié)合斑蝥素水提液，加入20 mL三氯甲烷，再加入2 mL濃鹽酸；加入正十六烷內(nèi)標(biāo)液10 μL固定；搖勻，靜置萃取4 h；分離收集下層氯仿液，待測。

1.2.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析條件色譜柱為AgilentHP-5MS色譜柱（30.00mm×0.25mm，0.25μm），載氣：高純氦氣（He），流速0.5 mL/min，不分流；質(zhì)譜電離方式：電子轟擊電離（EI），電子能量70 eV；進(jìn)樣口溫度250℃，程序升溫：初始溫度50℃，以20℃/min升至260℃，保持5.0 min；溶劑延遲4.2 min；四極桿溫度150℃；離子源溫度230℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～500；用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)，對(duì)色譜峰總峰面積初始閥值大于15.0、初始峰寬大于0.102的成分進(jìn)行積分和鑒定，利用美國WILEY7-NIST05和NIST05譜庫檢索比對(duì)，并對(duì)圖譜進(jìn)行解析，從而得到化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.4細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），37℃、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞長至對(duì)數(shù)生長期，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗，0.25%胰蛋白酶消化，加培養(yǎng)液吹打均勻成單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液（含8 000～10 000個(gè)細(xì)胞）接種于96孔培養(yǎng)板，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.5SRB染色法［11］接種肝癌HepG2細(xì)胞時(shí)，平行接種3塊96孔板，一塊為對(duì)照板（T0），另2塊為實(shí)驗(yàn)板。CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后，將對(duì)照板（T0）取出，用預(yù)冷的50%三氯乙酸（TCA）固定，待測。實(shí)驗(yàn)板中分別加入不同地域不同濃度的結(jié)合斑蝥素并設(shè)實(shí)驗(yàn)組（T）、陰性對(duì)照組（C）、陽性對(duì)照組（斑蝥酸鈉2.71 mg/L）、溶劑對(duì)照組；陰性對(duì)照孔加入培養(yǎng)液100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后取出培養(yǎng)板，以預(yù)冷的50%TCA固定（終濃度為10%），1 h（4℃）后以去離子水沖洗，自然晾干，用100 μL 0.4%SRB染色，10 min后用0.1%醋酸沖洗、晾干，最后用200 μL 10 mmol/L的緩沖Tris堿液（pH 10.5）溶解，在酶標(biāo)儀上選擇530 nm處測吸光度值（OD值），按照下列公式計(jì)算生長抑制率（IR）。

1.2.6茂丼境內(nèi)南方大斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響將HepG2細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后，用不同濃度的結(jié)合斑蝥素分別作用于癌細(xì)胞，并設(shè)空白對(duì)照組，48 h后將其置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況及形態(tài)變化。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1不同產(chǎn)地、不同品種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素含量的分析結(jié)果由GC-MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，貴州省羅甸縣境內(nèi)南方大斑蝥與黃黑小斑蝥體內(nèi)所含結(jié)合斑蝥素較其他地區(qū)內(nèi)的同種斑蝥體內(nèi)含量高，分別為375、290 mg/L；在周邊4省中云南境內(nèi)南方大斑蝥、廣西境內(nèi)黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素較其他省份同種斑蝥含量多，分別為84、134 mg/L。見表1。

2.2斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響將所提取的不同結(jié)合斑蝥素稀釋成不同濃度分別作用于肝癌HepG2細(xì)胞，以結(jié)合斑蝥素濃度為橫坐標(biāo)，IR為縱坐標(biāo)作回歸曲線，計(jì)算其半數(shù)抑制濃度（IC50），見表2。由表3所示，不同濃度的茂丼鎮(zhèn)南方大斑蝥與黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長抑制作用分別在0.52～1.57 mg/L和0.40～1.99 mg/L，且呈劑量依賴性，隨著濃度的增加，抑制效果逐漸顯著。以藥物濃度為橫坐標(biāo)，IR為縱坐標(biāo)作回歸曲線，茂丼鎮(zhèn)南方大斑蝥對(duì)應(yīng)的回歸方程為Y=47.423Ln（X）+62.109，R2= 0.988 7；茂丼鎮(zhèn)黃黑小斑蝥對(duì)應(yīng)的回歸方程為Y=38.241 Ln（X）+66.714，R2=0.986 3，其鏡內(nèi)的南方大斑蝥與黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于其他地區(qū)同種斑蝥。

表1　不同產(chǎn)地、不同品種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素含量的分析結(jié)果

表2　不同產(chǎn)地、不同品種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響（mg/L）

表3　茂丼（大）、茂丼（?。┌唑w內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

2.3茂丼鎮(zhèn)南方大斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響圖1為茂丼南方大斑蝥結(jié)合斑蝥素作用于HepG2細(xì)胞48 h后所觀察結(jié)果，與空白對(duì)照組比較，當(dāng)結(jié)合斑蝥素質(zhì)量濃度為0.52 mg/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)目略減少，且形態(tài)少許變圓、變亮；隨著藥物濃度增加到0.79、1.05 mg/L時(shí)，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，形態(tài)不規(guī)則，并出現(xiàn)固縮、體積變小現(xiàn)象，細(xì)胞貼壁差；當(dāng)藥物濃度達(dá)到1.30、1.57 mg/L時(shí)，細(xì)胞存留很少，大部分細(xì)胞已壞死或凋亡，形態(tài)變化更加明顯。

圖1　茂丼鎮(zhèn)南方大斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響（100×）

3　討　論

芫菁科昆蟲在我國目前已知有15屬130多種，因貴州具有較獨(dú)特的地理與氣候特性，決定了其昆蟲分布的廣泛性與多樣性，貴州可能分布著多于20種產(chǎn)斑蝥素的昆蟲［12］。但當(dāng)前開發(fā)與應(yīng)用的力度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。有研究證實(shí)，芫菁體內(nèi)斑蝥素鹽類衍生物即結(jié)合斑蝥素含量顯著多于斑蝥素，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些斑蝥素鹽類衍生物多是以鎂、鈣、鉀、鋅、鈉等鹽類為主［2-3］。本研究采用水提結(jié)合斑蝥素的方法，通過GC-MS分析斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素含量，結(jié)果顯示，不同地域不同種斑蝥體內(nèi)的結(jié)合斑蝥素含量也不同，存在地域和種類的差異。貴州省羅甸縣境內(nèi)2種斑蝥體內(nèi)的結(jié)合斑蝥素含量普遍高于其他地區(qū)同種斑蝥體內(nèi)含量，四川、云南、廣西及陜西4省境內(nèi)的黃黑小斑蝥體內(nèi)所含結(jié)合斑蝥素多于同地區(qū)的南方大斑蝥體內(nèi)含量。

在此基礎(chǔ)上，以斑蝥素酸鈉為陽性對(duì)照，測定不同地域不同種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制活性。結(jié)果顯示，不同地域種斑蝥體內(nèi)的結(jié)合斑蝥素對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞均有一定的抑制作用，其抑制活性呈現(xiàn)出地域和品種的差異性。其中貴州茂丼鎮(zhèn)境內(nèi)的南方大斑蝥與黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用明顯優(yōu)于其他地區(qū)同種斑蝥。

本研究通過對(duì)貴州及周邊地區(qū)斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素進(jìn)行提取、含量測定，并對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性測定，初步篩選出抗腫瘤活性顯著的地域種。下一步本課題組將對(duì)優(yōu)良地域種進(jìn)行培育繁殖，提取分離其活性部位或活性物質(zhì)，并對(duì)分離提取物進(jìn)行抗腫瘤效果評(píng)價(jià)。為更好地開發(fā)利用斑蝥這一寶貴的昆蟲資源提供必要的科學(xué)依據(jù)。

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［12］李曉飛，陳祥盛，侯曉暉.貴州產(chǎn)斑蝥素芫菁科、蠟蟬科昆蟲名錄與種類鑒定［J］.山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2008，27（1）：79-82.

Anti-human hepatocellular carcinoma HepG2cells activity of cantharidin derived from Guizhou Province and surround-ing regions*

Guo Kan1，Li Xiaofei1，Yan Rong1，Liu Yun2，Zhang Pei3，Liu Liu1△（1.Basic Medicine School，Zunyi Medical College，Zunyi，Guizhou 563003，China；2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines，Zunyi，Guizhou 563003，China；3.Guizhou Baiqiang Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550000，China）

ObjectiveTo preliminarily analyze the in vivo bound cantharidin content derived from the different geographic variants of Mylabrise in Guizhou Province and surrounding regions for screening out the geographic variant with the obvious effect for anti-human hepatocellular carcinoma HepG2cells.MethodsThe water extracting bound cantharidin mode was adopted to extract the effective ingredients；the bound cantharidin content in the extracting solution were analyzed by using GC-MS；the sulforhodamine B（SRB）assay was employed to evaluate the in vitro anti-tumor effect of the extracted liquid on hepatocellular carcinoma HepG2cells；the morphological alteration of apoptotic cells was detected by phase contrast microscopy.ResultsThe bound cantharidin content of Mylabrisphalerata Pallas and Mylabriscichorii Linnaeus collected in Luodian County of Guizhou Province were higher than that of the same species of Blister beetle collected from other regions，which were 375 mg/L and 290 mg/L，respectively；bound cantharidin from different geographical species all had the inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells，in which two kinds of cantharis in the Maojing town of Guizhou Province had the more significantly inhibitory effects on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells than that of the same cantharis in other areas，and its median inhibitory conventration（IC50）value was 0.78 mg/L and 0.65 mg/L respectively；the morphological observation results showed that in vivo bound cantharidin of Blister beetle in the Maojing town could promote the apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2cells，moreover the apoptotic cells appeared typical morphological characteristics.ConclusionThe bound cantharidin content has large difference among the different kinds of cantharis collected from different regions.The inhibitory effects of bound cantharidin from two kinds of cantharis in the Maojing town on the proliferation of hepatocellular carcinoma HepG2cells is superior to other geographic species，which may be deeply researched.

Mylabris；Cantharidin；Liver neoplasms；Tumor cells，cultured；Gas chromatography-mass spectrometry；Guizhou

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.05.004

A

1009-5519（2016）05-0648-03

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81260488）；貴州省科技廳中藥現(xiàn)代化項(xiàng)目（黔科合SY字［2013］3012）；貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合SY字［2012］3082）；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（黔教合KY字［2014］212）。

郭侃（1986-），在讀碩士研究生，主要從事昆蟲資源開發(fā)與利用方面的研究。

△，E-mail：403365478@qq.com。

（2015-12-03）