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    一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

    2016-09-03 10:44:15田海軍李世偉2信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院464000廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司350200
    當(dāng)代水產(chǎn) 2016年10期
    關(guān)鍵詞:諾氟沙星小檗草魚

    ■ 田海軍李世偉2( 信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 464000;2 廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司 350200)

    一例氣單胞菌引起池塘草魚死亡案例

    ■ 田海軍1李世偉12(1 信陽農(nóng)林學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院 464000;2 廈門利洋水產(chǎn)科技有限公司 350200)

    圖1 發(fā)病草魚

    圖2 病原菌分離與純化培養(yǎng)

    圖3 分離菌革蘭氏染色

    草魚,屬于鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬,俗稱鯇魚。因其生長(zhǎng)迅速、餌料來源廣泛,并且生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高,成為中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚之一。草魚是我國(guó)特有魚類,但以其獨(dú)特的食性和覓食手段從而被當(dāng)做拓荒者移植到世界各地。草魚養(yǎng)殖過程中容易患上爛腮、腸炎、赤皮、病毒性出血病等多種疾病,細(xì)菌性病原致病的情況很嚴(yán)重,因此,通過對(duì)草魚細(xì)菌性疾病的病原菌分離與鑒定對(duì)草魚病害的防治具有較大意義。

    1 材料和方法

    1.1 發(fā)病草魚

    今年3月,廣東珠海一草魚養(yǎng)殖池塘開始出現(xiàn)草魚死亡,池塘面積8畝,3臺(tái)葉輪式增氧機(jī),水深1.8 m,7,500 kg魚,養(yǎng)殖前沒有清塘,從3月中期開始,每天死亡十幾條,觀察發(fā)病草魚,魚體表發(fā)紅,尾鰭發(fā)白,鰓蓋、鰭條充血,剪開肚子有腹水,肝臟發(fā)黑,腸空、發(fā)紅(如圖1)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料

    LB固體培養(yǎng)基、70%酒精、冰箱、恒溫培養(yǎng)箱、壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、培養(yǎng)皿、燒杯、研缽、試管、接種環(huán)、酒精燈等。

    1.3 病原菌的分離與純化培養(yǎng)

    在無菌條件下,先用70%酒精對(duì)魚體表面消毒,然后分別取草魚的肝臟、腎臟、脾臟于無菌研缽中搗碎。

    分別加少量無菌水后分別劃線接種于LB固體培養(yǎng)基平板上,放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

    選取平板上的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng),最終培養(yǎng)至3~5代后獲得形態(tài)一致的純菌落。

    選取單個(gè)菌落經(jīng)過涂片、HE染色、鏡檢,確認(rèn)為純培養(yǎng)物。

    選取一個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落,在LB固體培養(yǎng)基斜面上-80℃冰箱保存(通過抑制酶的活性來抑制細(xì)胞的生命活動(dòng)的方式延長(zhǎng)細(xì)胞存活時(shí)間),備用。

    1.4 分離菌菌落觀察

    將純培養(yǎng)物接種于LB固體培養(yǎng)基平板上,在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,觀察并記錄培養(yǎng)出的細(xì)菌菌落特征。將獲得的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色:在載玻片上加1滴無菌水,用接種環(huán)挑取少許菌落與無菌水混合并進(jìn)行均勻涂布;經(jīng)自然干燥、火焰固定后,用草酸銨結(jié)晶紫染液染色1~2min,加水沖洗;再加革蘭氏碘液后1~2min,加水沖洗,再加復(fù)紅酒精染液等50~60s后加水沖洗;等待干燥后鏡檢。菌體被染成紫藍(lán)色為陽性,被染成紅色則為陰性。

    1.5 病原菌的鑒定

    采用API細(xì)菌數(shù)值鑒定系統(tǒng),這是同時(shí)能測(cè)定20項(xiàng)以上生化指標(biāo),可用做快速鑒定細(xì)菌的長(zhǎng)形卡片(21cm×4.5cm,法國(guó)生產(chǎn)),上面排列著20個(gè)塑料管,管內(nèi)加有適量糖類等生化反應(yīng)的干粉(有標(biāo)簽表明)以及反應(yīng)產(chǎn)物的顯色劑。每份產(chǎn)品都有薄膜覆蓋,這樣保證無雜菌污染。

    使用時(shí),首先打開內(nèi)部附有的一瓶無菌基本培養(yǎng)基(液體),用來稀釋待鑒定的純菌落;

    把配制成的濃度適中的細(xì)菌懸液用無菌滴管逐個(gè)以0.1ml的量加入到每個(gè)小管中;

    在經(jīng)過24~28h保溫后,觀看每個(gè)小管是否發(fā)生了顯色反應(yīng);

    將結(jié)果記錄在相應(yīng)表格中,然后按照規(guī)定對(duì)結(jié)果進(jìn)行編碼、查檢索表,就可以獲得該菌種的鑒定結(jié)果。

    1.6 藥敏試驗(yàn)

    藥敏試驗(yàn)采用的是紙片法(購自杭州某微生物試劑公司),選用在生產(chǎn)上常用的藥物進(jìn)行試驗(yàn)研究。

    首先進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng),用無菌生理鹽水洗后吸取0.2mL菌液在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行均勻涂布。

    貼上藥敏紙片,設(shè)4個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組。

    放置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

    觀察有無抑菌圈產(chǎn)生,同時(shí)記錄抑菌圈直徑,計(jì)算其平均值;然后再重復(fù)做1次實(shí)驗(yàn);最后依據(jù)抑菌圈直徑比值照判斷標(biāo)準(zhǔn)得到藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

    1.7 臨床用藥

    根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和池塘情況使用藥物治療

    2 結(jié)果

    2.1 病原菌分離與純化培養(yǎng)結(jié)果

    在LB固體培養(yǎng)基上形成菌落為其菌落形態(tài):圓形、圓滑、濕潤(rùn)邊緣整齊、微凸、半透明、灰白色至淡黃色中等大小的菌落,易挑?。ㄒ妶D2)。

    2.2 分離菌鏡檢結(jié)果

    革蘭染色陰性,短桿菌,懸滴標(biāo)本觀察動(dòng)力,運(yùn)動(dòng)活潑(見圖3)。

    2.3 分離菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果(見表1)

    表1 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

    2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果(見表2)。

    表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 臨床治療結(jié)果

    用藥:第1d, 陰雨天,死亡15條左右,上午10點(diǎn),使用諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑(1包)拌兩包料。

    第2d,陰雨天,死亡6條,下午17點(diǎn),諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制劑(1包)拌1包料。

    第3d,陰天,死亡6、7條,上午10點(diǎn)喂諾氟沙星、鹽酸小檗堿混合制(劑1包)拌2包料。

    草魚死亡量明顯減少得到控制。

    3 討論

    根據(jù)分離菌的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生化特性等試驗(yàn)結(jié)果確定該分離病原菌為氣單胞菌。氣單胞菌,廣泛分布于自然界中,能從表層和地下來源的飲用水中分離出該菌,氣單胞菌屬已經(jīng)被國(guó)際上列為腸道致病菌之一,是危害草魚的主要病原菌之一,感染后可發(fā)生胃腸炎、外傷感染和敗血癥并具有高死亡率。試驗(yàn)從草魚的肝脾腎等組織中分離出了氣單胞菌,為臨床治療提供了理論依據(jù)。但由于時(shí)間等多種條件限制,不能做回歸實(shí)驗(yàn)。

    由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知病原菌對(duì)諾氟沙星、鹽酸小檗堿、氟甲喹、恩諾沙星、氟苯尼考高度敏感。臨床上選用這些高敏藥物進(jìn)行治療,根據(jù)藥物特性采用了拌料口服的方式。諾氟沙星(Norfloxacin)化學(xué)名為1-乙基-6-氟-1,4-二氫-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸,作用原理為通過作用于細(xì)菌DNA螺旋酶的A亞單位,抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細(xì)菌死亡,是氟喹諾酮類抗菌藥,對(duì)需氧革蘭陰性桿菌的抗菌活性高。鹽酸小柴堿是小檗堿(Berberine)的鹽酸鹽(俗稱鹽酸黃連素),小檗堿分子式[C20H18NO4]+,是一種異喹啉生物堿,又稱黃連素,存在于小檗科等4科10屬的許多植物中,抗菌譜廣,體外對(duì)多種革蘭陽性及陰性菌均具抑菌作用,臨床主要用于腸道感染及菌痢等。

    具體治療:因前期沒有清塘,草魚出現(xiàn)死亡后用了絮凝的凈水產(chǎn)品,使塘底滋生了更多的有害細(xì)菌。后來又用了很多殺蟲的藥物,破壞了水體的生態(tài)平衡,加上一直陰雨天氣,池塘自凈能力差,溶氧一直不高,建議首先控制好死亡量,然后改善好池塘環(huán)境,最后再根治魚病。在注意增氧的前提下連續(xù)3d每天1包鰓皮腸利康拌料,草魚食欲恢復(fù),死亡數(shù)量明顯減少。

    氣單胞菌致病是由多種致病因子協(xié)同作用的結(jié)果,指導(dǎo)臨床用藥時(shí)為防止濫用抗生素而引起的病原菌抗藥性問題,對(duì)分離的病原菌用藥敏試驗(yàn)測(cè)定后再合理選用藥物治療才能達(dá)到最好的效果。該菌以往被認(rèn)為是低毒力條件性病原菌,但近年來該菌引起感染性疾病的報(bào)道日益增多,并對(duì)多種抗生素產(chǎn)生不同程度的耐藥性,需要加以重視,注意衛(wèi)生等各方面管理。臨床上,早發(fā)現(xiàn),早治療,防止多種病原交叉感染,提高機(jī)體抵抗力,科學(xué)養(yǎng)殖。(參考文獻(xiàn)略)

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