汕頭地區(qū)4例散發(fā)創(chuàng)傷弧菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

陳樂(lè)川，朱紅軍，周澤妍，柯永堅(jiān)，陳釧文（汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭5503；汕頭潮南民生醫(yī)院，廣東汕頭 5544）

汕頭地區(qū)4例散發(fā)創(chuàng)傷弧菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷

陳樂(lè)川1，朱紅軍1，周澤妍2，柯永堅(jiān)1，陳釧文1
（1汕頭市中心醫(yī)院，廣東汕頭515031；2汕頭潮南民生醫(yī)院，廣東汕頭 515144）

目的 了解汕頭市某院創(chuàng)傷弧菌（VV）感染患者的病原微生物學(xué)特征及藥物敏感性。方法 回顧性分析汕頭市某院2013年6月—2014年6月收治的4例VV感染患者，采集患者血標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，采集患者皰液或棉拭子采集傷口分泌物接種于血平板、麥康凱平板及TCBS平板，對(duì)分離的菌株進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例；分別因進(jìn)食腌蟹、蒸扇貝或外傷后接觸海產(chǎn)品，而引起原發(fā)性敗血癥及下肢感染。患者A、B皰液，患者C傷口分泌物，患者D血培養(yǎng)均分離出氧化酶陽(yáng)性、TCBS平板上生長(zhǎng)呈綠色的革蘭陰性菌，均鑒定為VV。VV對(duì)頭孢唑林耐藥或中介，對(duì)頭孢替坦均為中介，1株VV對(duì)頭孢吡肟耐藥。結(jié)論 4例VV感染患者病死率高（3/4），皰液或傷口分泌物培養(yǎng)陽(yáng)性率較血培養(yǎng)高；及時(shí)就診、盡早開(kāi)始抗菌藥物治療及積極清創(chuàng)有助于治療該病。

創(chuàng)傷弧菌；藥敏試驗(yàn)；抗藥性，微生物；耐藥性；食源性感染；傷口感染

［Chin J Infect Control，2016，15（4）：272—276］

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus，VV）為嗜溫、嗜堿、低度嗜鹽、嗜鐵的革蘭陰性（G—）菌，廣泛存在于近海環(huán)境及多種海產(chǎn)品中，可引起人原發(fā)性敗血癥（病死率超過(guò)50%）和嚴(yán)重傷口感染（病死率約25%）［1］。感染者多為免疫功能低下或原有基礎(chǔ)疾病者，通過(guò)進(jìn)食未經(jīng)煮熟的甲殼類海產(chǎn)品（尤其是生牡蠣），以及開(kāi)放性傷口、破損皮膚暴露于帶菌海水而感染。自1976年首次被美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）鑒定并命名以來(lái)，世界多地及國(guó)內(nèi)沿海地區(qū)如浙江、臺(tái)灣等地均有散在病例報(bào)道，潮汕地區(qū)罕見(jiàn)。本院于2013年6月—2014年6月共診治VV感染患者4例，現(xiàn)將其臨床特點(diǎn)及微生物實(shí)驗(yàn)室鑒定過(guò)程予以報(bào)告。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 2013年6月—2014年6月診治的4例VV感染患者，其中死亡3例，治愈1例。4例患者起病均表現(xiàn)為發(fā)熱、畏寒，繼發(fā)下肢腫脹、疼痛，并出現(xiàn)散在水泡及瘀斑似燙傷樣皮膚改變。病情進(jìn)展迅速，3例雙下肢感染者（患者A、B、D）出現(xiàn)感染性休克，2～11 d因多器官功能衰竭而死亡；1例（患者C）左下肢受累，經(jīng)清創(chuàng)換藥1月余并行創(chuàng)面清創(chuàng)植皮術(shù)后治愈。見(jiàn)表1。

表1　VV感染患者臨床基本資料Table 1 Basic clinical characteristics of patients infected with V.vulnificus

1.2儀器與試劑 法國(guó)生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀、血培養(yǎng)儀BACT/ALERT3D。血瓊脂平板、麥康凱平板購(gòu)自江門凱林貿(mào)易有限公司；TCBS平板由本實(shí)驗(yàn)室新鮮配制（TCBS瓊脂購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限責(zé)任公司），微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司，血培養(yǎng)瓶為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本采集 標(biāo)本均由臨床醫(yī)生采集，用無(wú)菌注射器采集A、B、D患者水/血皰穿刺液密封送檢，用無(wú)菌棉簽采集C患者下肢感染傷口的膿性分泌物，置無(wú)菌管保濕送檢；同時(shí)，用需氧、厭氧瓶采集患者血標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2標(biāo)本染色鏡檢及細(xì)菌分離 采用無(wú)菌注射器采集皰液標(biāo)本轉(zhuǎn)至無(wú)菌管中，2 500 r/min離心15 min，以及采用棉拭子采集感染傷口膿性分泌物直接接種于血平板、麥康凱平板、TCBS平板，置37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，同時(shí)涂片行革蘭染色。血培養(yǎng)瓶置血培養(yǎng)儀培養(yǎng)，陽(yáng)性者行涂片革蘭染色并轉(zhuǎn)種于上述培養(yǎng)基。

1.3.3菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 于平板上挑取菌落制成0.5麥?zhǔn)蠁挝粷岫葢乙?，采用法?guó)生物梅里埃公司VITEK2 Compact全自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀，按儀器操作說(shuō)明進(jìn)行，結(jié)果判斷采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2013年標(biāo)準(zhǔn)。

2　結(jié)果

2.1染色及培養(yǎng)結(jié)果 直接染色鏡檢：皰液及傷口分泌物標(biāo)本均檢出少量G—桿菌，部分呈逗點(diǎn)狀（白細(xì)胞++～+++，上皮細(xì)胞未見(jiàn)）。見(jiàn)圖1。皰液、傷口分泌物標(biāo)本37℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，血平板上長(zhǎng)出灰黃色、扁平、濕潤(rùn)、不透明菌落；麥康凱平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不良；TCBS平板上長(zhǎng)出綠色濕潤(rùn)菌落。見(jiàn)圖2。挑取菌落涂片染色鏡檢，為G—桿菌，氧化酶陽(yáng)性。與血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本轉(zhuǎn)種培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況基本相同。

2.2細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果 所分離菌株經(jīng)VITEK2Compact全自動(dòng)鑒定及藥敏分析儀鑒定為創(chuàng)傷弧菌。見(jiàn)表2。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果 VV對(duì)頭孢唑林耐藥或中介，對(duì)頭孢替坦均為中介，1株VV對(duì)頭孢吡肟耐藥，而對(duì)氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、氨曲南、頭孢他啶、頭孢曲松、哌拉西林/他唑巴坦、亞胺培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、呋喃妥因、復(fù)方磺胺甲口惡唑等均敏感。見(jiàn)表3。

圖1　皰液及傷口分泌物細(xì)菌革蘭染色鏡下形態(tài)（×1 000）Figure 1 Microscopic morphology of gram staining bacteria from blister fluid and wound secretion（×1 000）

圖2　患者皰液標(biāo)本在各營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)平板上菌落生長(zhǎng)情況Figure 2 Colonial growth of bacteria isolated from blister fluid on all kinds of culture media

表2　不同患者標(biāo)本培養(yǎng)鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of bacteria from different patients'specimens

3　討論

VV或稱海洋弧菌，隸屬弧菌屬第五群，G—菌、兼性厭氧、單極端單鞭毛，無(wú)芽孢、無(wú)異染顆粒、有莢膜，按生化反應(yīng)特征可分為生物1、2和3型，引起人類感染的主要為生物1型。自然環(huán)境中該菌只能在鹽度為0.7%～1.6%、溫度＞20℃的水中生長(zhǎng)［2］；抵抗力不強(qiáng)，冷凍或煮沸可被殺滅。通常環(huán)境分離株常無(wú)致病性，臨床分離株有致病性。感染病例多分布于熱帶和亞熱帶沿海地區(qū)，3～11月好發(fā)，夏季（海面水溫23～29℃）是發(fā)病高峰期［3］。其致病機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為莢膜多糖（CPS）、運(yùn)動(dòng)鞭毛、Rtx毒素、鐵獲取能力等是必須的致病因子，脂多糖（LPS）、IV型菌毛、溶細(xì)胞素、金屬蛋白酶等亦可能發(fā)揮重要作用［1］。

本組4例VV感染患者，其中食源性感染2例（1例治愈），傷口感染2例。發(fā)病時(shí)間均為夏季，均表現(xiàn)為急起發(fā)熱伴畏寒，繼發(fā)下肢特征性大皰性皮損，并肝、腎、心、呼吸、循環(huán)功能不全，結(jié)合患者均有長(zhǎng)期吸煙史、長(zhǎng)期飲酒史（除患者B外），存在基礎(chǔ)疾病，并有海產(chǎn)品或海水接觸史等可作初步診斷，患者血、皰液、傷口分泌物等培養(yǎng)分離出VV而確診?？咕幬镏委熐凹皶r(shí)采集的D患者血培養(yǎng)，分離出VV，而于其余3例患者（抗菌藥物治療后）采集的血標(biāo)本均培養(yǎng)陰性。A、B患者皰液，以及C患者的傷口分泌物均分離出VV，陽(yáng)性率高，適用于已應(yīng)用抗菌藥物治療、血培養(yǎng)陰性者。實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，經(jīng)傷口感染VV的小鼠，其血培養(yǎng)（12 h）陽(yáng)性率僅為20%，而傷口分泌物培養(yǎng)陽(yáng)性率為100%，感染6 h后即可在小鼠傷口分離出VV，并持續(xù)12～72 h［4］。標(biāo)本保溫送檢并及時(shí)接種，棉拭子保濕送檢，培養(yǎng)基置室溫復(fù)溫均影響細(xì)菌存活和培養(yǎng)陽(yáng)性率。注射器抽取的皰液標(biāo)本宜離心取沉淀物接種，以提高陽(yáng)性率，或注入血培養(yǎng)瓶送檢。送檢同時(shí)告知必要的臨床資料，以及標(biāo)本直接涂片的染色鏡檢，有助于實(shí)驗(yàn)室選擇合適的培養(yǎng)基并采取有針對(duì)性的鑒定程序，縮短報(bào)告時(shí)間。鏡檢發(fā)現(xiàn)G—桿菌且氧化酶陽(yáng)性、TCBS平板上生長(zhǎng)呈綠色菌落，判斷分離到致病性弧菌，應(yīng)作為危急值及時(shí)通知臨床。

本組VV對(duì)多種抗菌藥物敏感性較好，而對(duì)頭孢唑林耐藥或中介，對(duì)頭孢替坦均為中介，僅1例對(duì)頭孢吡肟耐藥，與韋俊超等［5］報(bào)道的（分離自膿性分泌物）相近，與潘軍航等［6］報(bào)道（分離自糞便樣本）結(jié)果存在差異，后者對(duì)氨基糖苷類抗生素（如阿米卡星、慶大霉素）耐藥；王志剛等［7］報(bào)道的臨床分離株對(duì)慶大霉素、妥布霉素、氨曲南和頭孢唑林耐藥。VV表型復(fù)雜，不同來(lái)源分離株的耐藥表型差異，抗菌藥物治療應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行選擇。同時(shí)，環(huán)境分離株的耐藥現(xiàn)狀不容樂(lè)觀，海域分離株、患病魚(yú)的分離株、部分海/水產(chǎn)品分離株等對(duì)多種抗菌藥物，如青霉素類、磺胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類抗生素耐藥［4，8～9］。

及時(shí)就診并盡早使用抗菌藥物治療是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵。本組患者所應(yīng)用抗菌藥物，如亞胺培南/西司他丁、左氧氟沙星、哌拉西林/他唑巴坦等均為敏感藥物，因就診時(shí)機(jī)不同而治療效果出現(xiàn)差異。出現(xiàn)感染性休克者抗菌藥物療效不佳，患者A、B、D分別于2、11 d后死亡；患者C起病2 d后就診，予頭孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦等治療有效。盧中秋等［10］認(rèn)為，早期使用各類抗菌藥物治療均有效，但感染中晚期或嚴(yán)重感染時(shí)療效較差。

由于患者一般情況差，血小板降低及凝血功能障礙等不利于截肢手術(shù)，控制局部感染灶，并清創(chuàng)去除壞死組織尤為重要?；颊逤起病后自行使用消毒劑（具體不詳）頻繁清洗患處，入院后經(jīng)積極清創(chuàng)換藥，局部敷聚維酮碘，病情逐漸穩(wěn)定，于第47天行清創(chuàng)植皮術(shù)后痊愈。文獻(xiàn)［5，11］報(bào)道，VV感染患者單純行創(chuàng)口換藥1個(gè)多月后好轉(zhuǎn)，或經(jīng)頭孢曲松靜脈滴注、呋喃西林局部濕敷治療20 d后痊愈。一周后患者B下肢傷口分泌物、痰分別多次分離出鮑曼不動(dòng)桿菌和白假絲酵母菌，提示應(yīng)預(yù)防合并其他細(xì)菌及真菌感染。

鐵是VV生長(zhǎng)的必須營(yíng)養(yǎng)，環(huán)丙沙星聯(lián)合鐵螯合劑和鐵調(diào)素激動(dòng)劑體外實(shí)驗(yàn)［12—13］提示，通過(guò)降低血清鐵水平，可抑制VV生長(zhǎng)，利于改善感染預(yù)后。輸注壓積紅細(xì)胞的患者亦應(yīng)及時(shí)去鐵。

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室應(yīng)熟練掌握VV培養(yǎng)特性、鑒定要點(diǎn)及流行特點(diǎn)，同時(shí)應(yīng)提高送檢意識(shí)，規(guī)范標(biāo)本采集和送檢程序。汕頭地區(qū)素有食生腌貝甲類海鮮的習(xí)慣，應(yīng)加強(qiáng)VV感染的科普宣教，規(guī)范海產(chǎn)品餐飲加工處理過(guò)程。對(duì)相關(guān)易感因素應(yīng)采取有效防護(hù)措施，謹(jǐn)慎處理暴露于海水或接觸海產(chǎn)品的患者傷口，并及時(shí)就診。臨床及水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)避免抗菌藥物濫用，并加強(qiáng)VV耐藥性監(jiān)測(cè)。

表3　4例感染患者分離的VV藥敏試驗(yàn)結(jié)果（μg/mL）Table 3 Antimicrobial susceptibility testing results of V. vulnificus isolated from4 infected patients（μg/ mL）

［1］ Jones MK，Oliver JD.Vibrio vulnificus：disease and patho-genesis［J］.Infect Immun，2009，77（5）：1723—1733.

［2］ Nakafusa J，Misago N，Miura Y，et al.The importance of ser-um creatine phosphokinase level in the early diagnosis，and as aprognostic factor，of Vibrio vulnificus infection［J］.Br J Dermatol，2001，145（2）：280—284.

［3］ Klontz KC，Lieb S，Schreiber M，et al.Syndromes of Vibrio vulnificus infections.Clinical and epidemiologic features in Florida cases，1981—1987［J］.Ann Intern Med，1988，109 （4）：318—323.

［4］ 馬驄，郭建巍，郝秀紅，等.中國(guó)海域分離的創(chuàng)傷弧菌的致病性及其對(duì)抗生素的敏感性研究［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（6）：493—496.

［5］ 韋俊超，潘軍航，李月華.一株新MLST型創(chuàng)傷弧菌的分離鑒定［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24（8）：1109—1115.

［6］ 潘軍航，葉菊蓮，朱敏，等.腹瀉樣本中創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)分析［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2012，27（1）：59—61.

［7］ 王志剛，邵平揚(yáng)，吳曉燕，等.創(chuàng)傷弧菌的培養(yǎng)鑒定及其對(duì)抗菌藥物的敏感性［J］.中華臨床感染病雜志，2009，2（5）：293—296.

［8］ 趙典惠，孫際芳，王海芳，等.創(chuàng)傷弧菌的藥物敏感性［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，27（12）：1207—1211.

［9］ 虞艷，潘軍航，石亞素，等.多株創(chuàng)傷弧菌的基因分型和藥敏試驗(yàn)［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2013，28（2）：136—139.

［10］盧中秋，洪廣亮.創(chuàng)傷弧菌膿毒癥診治進(jìn)展［J］.臨床外科雜志，2011，19（3）：159—163.

［11］繆心軍，蔡平平，陳玉熹，等.原發(fā)性創(chuàng)傷弧菌膿毒血癥救治成功三例［J］.天津醫(yī)藥，2006，34（2）：136—137.

［12］Neupane GP，Kim DM.In vitro time-kill activities of cipro-floxacin alone and in combination with the ironchelator defera-sirox against Vibrio vulnificus［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2010，29（4）：407—410.

［13］Arezes J，Jung G，Gabayan V，et al.Hepcidin-induced hypoferre-mia is a critical host defense mechanism against the siderophilic bacteriumVibrio vulnificus［J］.Cell Host Microbe，2015，17 （1）：47—57.

（本文編輯：李春輝）

Laboratory analysis on 4cases of sporadic Vibrio vulnificus infection in Shantou City

CHEN Le-chuan1，ZHU Hong—jun1，ZHOU Ze-yan2，KE Yong—jian1，CHEN Chuan-wen1（1 Shantou Central Hospital，Shantou515031，China；2 Shantou Chaonan Minsheng Hospital，Shantou515144，China）

Objective To analyze characteristics of pathogenic microbiology and antimicrobial susceptibility of Vib-rio vulnificus（V.vulnificus）causing infection in patients at a hospital in Shantou City.Methods Four patients with V.vulnificus infection admitted to a hospital between June 2013 and June 2014 were analyzed retrospectively，blood specimens of patients were collected for culture，blister fluid and wound secretion were taken and inoculated on blood agar plates，MacConkey agar plates，and thiosulfate citrate bile salts sucrose（TCBS）plates，isolated strains were identified and performed antimicrobial susceptibility testing.Results Among 4 patients with V. vulnificus infection，3 died，1 was cured；patients developed primary septicemia and lower extremity infection be-cause of eating pickled crab，steamed scallop，or contacting with seafood products after trauma.Blister fluid from patients A and B，wound secretion from patient C，and blood from patient D were all isolated oxidase-positive gram-negative bacteria which produced green colonies on TCBS plate，these strains were identified as V.vulnificus，which were resistant or intermediate to cefazolin，intermediate to cefotetan，and 1 strain was resistant to cefepime. Conclusion Four patients infected with V.vulnificus have high mortality rate（3/4），positive rates of blister fluid and wound secretion are higher than blood；timely medical consultation，early antimicrobial therapy，and active de-bridement will help to cure the disease.

Vibrio vulnificus；antimicrobial susceptibility testing；drug resistance，microbial；drug resistance；foodborne infection；wound infection

R378

A

1671—9638（2016）04—0272—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.014

2015—03—18

陳樂(lè)川（1983—），男（漢族），廣東省汕頭市人，主管技師，主要從事臨床微生物研究。

朱紅軍 Email：zhugdst@163.com