林地蘑菇ITS鑒定及生物學(xué)特性初步研究*

馮連榮　張　妍　梁德軍　宋立志　矯麗曼　王勝東

（遼寧楊樹(shù)研究所，蓋州　115213）

林地蘑菇ITS鑒定及生物學(xué)特性初步研究*

馮連榮張妍梁德軍宋立志矯麗曼王勝東**

（遼寧楊樹(shù)研究所，蓋州115213）

對(duì)采集的野生林地蘑菇子實(shí)體進(jìn)行菌種分離后的研究結(jié)果表明，林地蘑菇分離株rDNA ITS片段長(zhǎng)度為705bp，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI與GenBank中已知菌種進(jìn)行BLAST比對(duì)，序列相似性在99%～91%之間，下載相似高的ITS序列，用Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，MEGA 2.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定分離菌種為林地蘑菇純菌種。生物學(xué)特性研究結(jié)果表明：適宜菌絲生長(zhǎng)的碳源為可溶性淀粉，適宜的氮源為硫酸銨，適宜的無(wú)機(jī)鹽為硫酸鈣和磷酸二氫鉀，菌絲最適溫度為25～30℃。

林地蘑菇；ITS鑒定；生物學(xué)特性

林地蘑菇（Agaricus silvaticus）屬傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬（Agaricus），在黑龍江、吉林、遼寧、江蘇、浙江等地均有分布，夏秋季于針闊葉林中單生至群生。蘑菇屬真菌在我國(guó)有著廣泛分布，是選育栽培品種的重要對(duì)象，其中雙孢蘑菇（A.bisporus）、雙環(huán)蘑菇（A.bitorquis）、姬松茸（A.blazei）等更是世界范圍的栽培種，在世界食用菌產(chǎn)業(yè)中占有非常重要的地位［1］。林地蘑菇作為一種可食用的野生食用菌，相對(duì)于上述廣泛栽培的品種而言，相關(guān)研究還比較少。為了解林地蘑菇的特性，本研究采用組織分離法對(duì)采集的野生林地蘑菇子實(shí)體進(jìn)行菌種分離，結(jié)合形態(tài)特征及分子生物學(xué)手段對(duì)菌種進(jìn)行了鑒定，并對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)所需的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及培養(yǎng)溫度等進(jìn)行了初步研究，以期為林地蘑菇的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1子實(shí)體

林地蘑菇子實(shí)體于2012年采自原遼寧省楊樹(shù)研究所小園內(nèi)。

1.1.2培養(yǎng)基

PDA/PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L+葡萄糖/蔗糖20 g/L+瓊脂18 g/L，pH值自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L+蛋白胨2 g/L+ MgSO4·7H2O 1 g/L+瓊脂18 g/L，pH6.5。

1.1.3主要試劑及引物

TIANGEN DNA secure新型植物基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCR擴(kuò)增試劑購(gòu)自 Thermo；ITS分析所用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3'）/ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1林地蘑菇形態(tài)鑒定及菌種分離

對(duì)采集的子實(shí)體進(jìn)行形態(tài)鑒定，觀察新鮮子實(shí)體的顏色、形狀、著生方式及附屬物等，測(cè)定菌蓋和菌柄的大小，用顯微鏡對(duì)孢子形態(tài)特征進(jìn)行觀察。

采用組織分離法對(duì)林地蘑菇進(jìn)行菌種分離。首先用70%酒精棉擦洗菌蓋及菌柄部位進(jìn)行表面消毒，在酒精燈火焰附近，用手將子實(shí)體從菌柄基部向菌蓋處撕開(kāi)，用燃燒后的手術(shù)刀片將菌蓋與菌柄之間的菌肉切成小方塊，然后用滅過(guò)菌的鑷子夾取一小塊菌肉組織，放入事先準(zhǔn)備好的裝有無(wú)菌培養(yǎng)基的PDA平板培養(yǎng)基中，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。菌絲直徑達(dá)到2 cm后，進(jìn)行純化培養(yǎng)，記為L(zhǎng)D，培養(yǎng)好的菌種置于4℃冰箱中存放。

采用玻片培養(yǎng)法進(jìn)行菌絲形態(tài)觀察。用打孔器打取菌絲圓片，接種在培養(yǎng)皿中心位置，將處理好的蓋玻片斜插到平板中，每皿插入兩片，待菌絲長(zhǎng)到蓋玻片中央時(shí)，用鑷子輕輕將蓋玻片抽出，蓋玻片中有菌絲的一面朝上，用顯微鏡觀察。

1.2.2林地蘑菇的ITS鑒定

分離得到的菌種接種到PDA平板培養(yǎng)基中，25℃下靜置暗光培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用 TIANGEN公司的DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作方法按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA溶于25 μL TE（pH8.0）中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以基因組DNA為模板，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，參照張妍等［2］的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3ITS序列分析與進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，找出與之最大相似性的序列，下載相似性序列的ITS區(qū)域，用Clustalw進(jìn)行多序列比對(duì)，并輔以人工修正，分析時(shí)所有參數(shù)均為軟件默認(rèn)值。用MEGA 2.0軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.4林地蘑菇生物學(xué)特性初步研究

1.2.4.1同步菌絲的制備

在超凈工作臺(tái)中，從分離的LD母種中挑取黃豆粒大小的菌絲塊，接種到綜合PDA平板培養(yǎng)基中央（培養(yǎng)皿直徑為90 mm），置于25℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，待菌絲快長(zhǎng)滿(mǎn)平皿時(shí)，用直徑6 mm的打孔器在平板上靠近菌絲邊緣相同直徑的圓圈上打取菌絲塊，保證試驗(yàn)所用菌絲塊均為相同菌齡。

1.2.4.2菌絲生物學(xué)特性研究

碳源試驗(yàn)：分別用果糖、麥芽糖、可溶性淀粉代替PSA培養(yǎng)基中的蔗糖，制成含有不同碳源的培養(yǎng)基配方，觀測(cè)不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

氮源試驗(yàn)：分別用酵母膏、尿素、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蛋白胨，制成含有不同氮源的培養(yǎng)基，觀測(cè)不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn)：分別用磷酸二氫鉀、氯化鈉、硫酸鈣代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硫酸鎂，制成含有不同無(wú)機(jī)鹽的培養(yǎng)基，觀測(cè)不同無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

溫度試驗(yàn)：以PDA為培養(yǎng)基，溫度設(shè)置20、25、30、35℃，觀測(cè)不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.4.3測(cè)定方法

各試驗(yàn)處理菌種接種到平板培養(yǎng)基中央，每種處理重復(fù)5次，當(dāng)其中一個(gè)處理菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，每天測(cè)量菌絲餅直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度，同時(shí)觀察菌絲長(zhǎng)勢(shì)、濃密度等生長(zhǎng)指標(biāo)。

2　結(jié)果分析

2.1林地蘑菇形態(tài)特征

子實(shí)體（圖1-A）菌蓋直徑7.8 cm，扁半球形，近白色，覆有淺褐色鱗片。菌肉白色。菌褶初白色，漸變粉紅色，后栗褐色至黑褐色，離生，稠密，不等長(zhǎng)。菌柄長(zhǎng)8.5 cm，粗0.8 cm，白色，基部略膨大。菌環(huán)白色，膜質(zhì)，單層，生菌柄上部。孢子印黑褐色，孢子褐色（圖1-B），光滑，橢圓形，基本符合《中國(guó)大型真菌》［3］對(duì)林地蘑菇的描述。子實(shí)體經(jīng)組織分離后獲得純種菌絲，菌絲在PDA培養(yǎng)基上呈白色（圖1-C）。顯微鏡下觀察菌絲有隔，有索狀聯(lián)合（圖1-D）。

圖1　林地蘑菇形態(tài)特征

2.2菌絲DNA提取及ITS-PCR擴(kuò)增

提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2-A），DNA條帶清晰、較明亮，可以作為PCR反應(yīng)的模板。以 DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對(duì)rDNA ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，片段大小約為700 bp左右（圖2-B）。

2.3序列相似性搜索及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

rDNA ITS區(qū)段序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為705bp。測(cè)序結(jié)果登錄GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastn搜索，與登錄號(hào)JF797178.1 （A.silvaticus）的菌種覆蓋度最高達(dá)100%，相似性達(dá)99%。得到的序列相似性在99%～91%之間，全部為蘑菇屬的不同種。下載相似高的ITS序列，用Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，并輔以人工修正后，基于分離株以及來(lái)自GenBank的最相似蘑菇屬16個(gè)種的ITS序列，用MEGA 2.0軟件采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)（采用默認(rèn)值，圖3）。從系統(tǒng)樹(shù)可看出，LD中的菌種與蘑菇屬中的林地蘑菇聚為一支，結(jié)合形態(tài)特征，鑒定分離菌種為林地蘑菇純菌種。

圖2　林地蘑菇DNA瓊脂糖凝膠及PCR擴(kuò)增電泳圖

圖3　林地蘑菇及來(lái)自GenBank的組相似物種的ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4菌絲的生物學(xué)特性

2.4.1不同碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

4種碳源均可以被林地蘑菇菌絲所利用（表1），其中以可溶性淀粉作為碳源時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)最強(qiáng)，菌絲健壯而濃密，與其他碳源相比差異顯著。其次是蔗糖、麥芽糖和果糖，三者對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響差異不顯著，但果糖菌絲致密程度不如麥芽糖和蔗糖。

表1　不同碳源對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)及生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.4.2不同氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

菌絲在硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快而健壯，菌絲濃密，與其他氮源培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)速度差異顯著；其次是以蛋白胨作為氮源的培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)較好；而以尿素為氮源時(shí)，菌絲不能生長(zhǎng)（表2）?？梢?jiàn)，進(jìn)行林地蘑菇菌絲培養(yǎng)時(shí)宜選擇硫酸銨作為氮源，尿素不宜選用。

表2　不同氮源對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)及生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.4.3不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

不同的無(wú)機(jī)鹽對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)具有一定的影響，在添加硫酸鈣和磷酸二氫鉀的培養(yǎng)基中，菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲健壯而濃密；添加硫酸鎂的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)速度與硫酸鈣和磷酸二氫鉀相比差異顯著，菌絲生長(zhǎng)較健壯但菌絲較稀；添加氯化鈉后菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般（表3）。

表3　不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)及生長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.4.4不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

林地蘑菇菌絲在20～30℃范圍內(nèi)可以生長(zhǎng)，隨著溫度上升，菌絲生長(zhǎng)速度逐漸加快；當(dāng)溫度超過(guò)35℃以后菌絲不能生長(zhǎng)。試驗(yàn)表明，林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為25～30℃（表4）。

表4　不同溫度對(duì)林地蘑菇菌絲生長(zhǎng)及生長(zhǎng)勢(shì)的影響

3　結(jié)論與討論

3.1ITS是核糖體rDNA中介于18S與5.8S之間、5.8S與28S之間的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，其保守性表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間高度特異［4］。ITS序列通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索比對(duì)，序列相似性≥99%，可以鑒別為相同種；序列相似性為95%～99%，可以鑒別為相同屬［5］。該方法在大型真菌屬內(nèi)種間及種群分類(lèi)研究中應(yīng)用日益廣泛［6-7］。本研究對(duì)采集的野生林地蘑菇進(jìn)行了菌種分離，并結(jié)合子實(shí)體、菌絲、孢子等形態(tài)特征，輔以rDNA ITS序列的比較分析及NJ法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，鑒定了所分離的菌種為林地蘑菇純種菌絲。

3.2本研究利用單因素試驗(yàn)確定了林地蘑菇培養(yǎng)階段適宜的碳源為可溶性淀粉，這與胡潤(rùn)芳的研究結(jié)果一致；適宜的氮源為硫酸銨，不宜選用的氮源為尿素；適宜的無(wú)機(jī)鹽為硫酸鈣和磷酸二氫鉀；適宜培養(yǎng)溫度為25～30℃，與雙孢蘑菇［8］、大肥菇［9］等蘑菇屬真菌相似。本研究只是進(jìn)行了林地蘑菇生物學(xué)特性的初步研究，對(duì)于各因素之間有無(wú)交互作用，如何組合還需要進(jìn)一步研究。

［1］李榮春.蘑菇屬不同種類(lèi)、不同品種在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)觀察［J］.中國(guó)食用菌，2000，19（增刊）:136-138.

［2］張妍，馮連榮，王克翰，等.卷邊樁菇組織分離與ITS序列分子鑒定［J］.林業(yè)科技通訊，2016（5）:8-11.

［3］卯曉嵐.中國(guó)大型真菌［M］.鄭州:河南科學(xué)技術(shù)出版社，2000.

［4］高磊.新疆南疆野生雙胞蘑菇的鑒定、生物學(xué)特性及其馴化栽培的研究［D］.塔里木:塔里木大學(xué)，2012.

［5］Renske L，Paula L，Thom W K，et al.Molecular Identification of Ectomycorrhizal Mycelium in Soil Horizons［J］.Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）:327-333.

［6］高山，胡平，邊銀丙，等.基于ITS序列對(duì)3個(gè)側(cè)耳菌種的分子鑒定［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，47（12）:1390-1393.

［7］張微思，羅孝坤，張麗英，等.松茸菌絲體的純培養(yǎng)及其鑒定［J］.中國(guó)食用菌，2010，29（3）:34-36.

［8］侯志江，李榮春.蘑菇屬主栽種栽培特性比較及馴化展望［J］.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，24（3）:474-478.

［9］丁湖光.大肥菇生物特性及高產(chǎn)栽培［J］.特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物，2006，9（8）:36.

第1作者簡(jiǎn)介：馮連榮（1983-），女，博士研究生，工程師，主要從事食用菌栽培及楊樹(shù)轉(zhuǎn)基因育種研究。

（責(zé)任編輯：王岳）

Preliminary Study on ITS Sequence and Biological Characteristics of Agaricus silvaticus

FENGLianrong
（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou115213）

The species were identified by morphological characteristics and molecular biological methods. The results showed amplified by PCR of tissue isolates ITS rDNA fragment of Agaricus silvaticus.the length of the amplified product was 705bp，compared with the known species of GenBank and Blastn in NCBI，sequence similarity is between 99%～91%，download ITS sequences of strains with high similarity，sequence alignment by Clustal W，construct phylogenetic tree by MEGA2.0，By tree graph analysis，Identification of isolates is Agaricus silvaticus pure strains.The results showed that the suitable carbon source for mycelium growth was soluble starch.The nitrogen source suitable was ammonium sulfate，the suitable inorganic salt was calcium sulfate and potassium dihydrogen phosphate，the suitable temperature was 25～30℃.

Agaricus silvaticus；ITS sequence；Biological characteristics

S664.4

C

1001-9499（2016）04-0020-04

*遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目（201420701）資助

王勝東（1966-），教授級(jí)高級(jí)工程師。

2016-06-30