添加劑提高酶穩(wěn)定性研究進(jìn)展

王亞軍，曹塊

（1.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

添加劑提高酶穩(wěn)定性研究進(jìn)展

王亞軍1，2，曹塊1，2

（1.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點實驗室，浙江杭州310014；2.浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江杭州310014）

酶作為一種高效的生物催化劑，以其獨特的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、食品、能源等各領(lǐng)域。然而，大多數(shù)酶在反應(yīng)時會遇到高溫、高鹽、極端pH等逆境，容易造成酶的失活，進(jìn)而降低生產(chǎn)效率，這嚴(yán)重限制其在工業(yè)上的推廣和應(yīng)用。因此，強(qiáng)化酶穩(wěn)定性已成為當(dāng)前研究的熱點和難點。添加穩(wěn)定劑是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的提高酶穩(wěn)定性的方法，對幾種不同類型添加劑的特點及其在改善酶穩(wěn)定性方面的應(yīng)用作了綜述，并從結(jié)構(gòu)和功能的角度進(jìn)一步解釋了相關(guān)機(jī)理。

酶；穩(wěn)定性；添加劑

生物催化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和、催化效率高、環(huán)境友好等特點，被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、材料等領(lǐng)域［1-2］。作為生物催化劑的酶是由生物體細(xì)胞合成的，在體內(nèi)生理條件下能夠較好地保持活性，但在酶的實際應(yīng)用環(huán)境下則會表現(xiàn)出耐受性差、容易失活、不易儲存等缺陷，嚴(yán)重制約了其在工業(yè)上的應(yīng)用。目前增加酶穩(wěn)定性的主要方法有分子改造［3］、化學(xué)修飾［4］、固定化［5］和添加穩(wěn)定劑［6］。其中通過添加穩(wěn)定劑提高酶穩(wěn)定性既經(jīng)濟(jì)又方便。合適的穩(wěn)定劑可以在保證酶活性的基礎(chǔ)上，增加酶的穩(wěn)定性［7］。目前添加穩(wěn)定劑提高酶穩(wěn)定性主要通過兩種途徑［8］：第一，添加劑與蛋白質(zhì)直接作用（與蛋白結(jié)合、靜電作用等），直接強(qiáng)化酶的穩(wěn)定性；第二，添加劑分子間相互作用，間接改變蛋白質(zhì)溶液外部環(huán)境（黏度、極性等），進(jìn)而改善酶穩(wěn)定性。

1　酶穩(wěn)定的機(jī)理

1.1熱力學(xué)作用

通常酶分子存在三種狀態(tài)：自然狀態(tài)、過渡態(tài)和失活狀態(tài)。酶的失活一般經(jīng)歷兩個步驟：首先發(fā)生熱力學(xué)變化，從天然狀態(tài)可逆轉(zhuǎn)變到過渡態(tài)，然后是動力學(xué)變化，從過渡態(tài)不可逆變成失活狀態(tài)［9］。酶熱力學(xué)穩(wěn)定性由天然狀態(tài)酶蛋白與失活酶蛋白之間的吉布斯自由能差（△Gu）決定，△Gu越大，酶穩(wěn)定性越高。有兩種增大△Gu的策略：第一種是降低天然酶蛋白的自由能；另一種是增加失活酶蛋白的自由能［10］。一些輔因子，如底物、輔酶和特異性金屬離子等，可以與酶蛋白結(jié)合，能夠降低酶蛋白天然狀態(tài)的自由能，提高酶穩(wěn)定性［11］。

1.2疏水相互作用

疏水相互作用在保證蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用，疏水相互作用不是疏水蛋白分子間的相互吸引造成的，而是極性環(huán)境將疏水性基團(tuán)擠壓進(jìn)蛋白質(zhì)的內(nèi)部。蛋白質(zhì)的疏水性與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水性氨基酸有直接關(guān)系，疏水相互作用主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵［12］。甘油、糖類和精氨酸可以在蛋白質(zhì)和水溶液之間形成兩親性表面結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定性和抑制部分未折疊蛋白的失活［8］。

1.3氫鍵作用

氫鍵不僅存在于酶分子內(nèi)部，也存在酶與周圍水分子之間，是指在3?范圍內(nèi)氫供體和氫受體之間夾角小于90°的作用力。在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成一個氫鍵所獲得平均能量約為1.3 kcal/mol［13］。當(dāng)氫鍵數(shù)目增加時，酶的穩(wěn)定性增強(qiáng)，斷開這些氫鍵會導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性降低。多羥基化合物添加到酶液后，穩(wěn)定劑之間或者與水分子間可以形成氫鍵，氫鍵之間相互作用已被證明會影響蛋白溶液的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)特性，如溶液中會形成較小水分子簇、改變?nèi)苜|(zhì)在水溶液中的擴(kuò)散系數(shù)等［14］，可增加酶的穩(wěn)定性。

除此之外，還有其他一些影響因素（如靜電作用［15］、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量［16-17］和分子剛性［18］等）對酶的穩(wěn)定性也有影響。以上的各種因素并不是獨立發(fā)揮作用的，而是相互影響、協(xié)同作用［17］。

2　添加劑在提高酶穩(wěn)定性方面的應(yīng)用

2.1多羥基化合物

2.1.1甘油

甘油能與酶形成多個氫鍵，并與水分子相互作用，在酶分子周圍形成水膜，防止酶因水解而變性［19］。甘油羥基與酶的酰胺基團(tuán)形成氫鍵提高酶的穩(wěn)定性，另外甘油分子較小，能進(jìn)入肽鏈的空隙，減少了酶分子蛋白間的相互碰撞，同時阻止變性劑接近酶的活性中心［20］。在醛酮還原酶中添加了甘油后，酶的失活活化能由對照組232.8 kJ/mol上升到730.5 kJ/mol，可見酶的穩(wěn)定性得到了大幅度提升［21］。一般來說，甘油是通過改變酶的變性平衡（天然狀態(tài)←→過渡狀態(tài)）朝著天然狀態(tài)移動的結(jié)果。

2.1.2糖類

糖類能提高酶的熱穩(wěn)定性，這是由于糖類中的羥基與酶分子之間形成氫鍵，維持酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定?？梢宰鳛榉€(wěn)定劑的糖類化合物有甘露糖、乳糖、海藻糖等。表1列舉了幾種糖醇的酶穩(wěn)定效果。

山梨糖醇添加到地衣芽孢桿菌和淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶溶液中，酶的熱穩(wěn)定性和活力均不同程度的增加［7］。與其他糖類相比，海藻糖不具有還原性，能與水形成大量的氫鍵，這使得海藻糖在保護(hù)酶穩(wěn)定性方面有獨特的優(yōu)勢。溶菌酶溶液中加入海藻糖后，海藻糖分子自身形成大量氫鍵，而酶蛋白與水分子之間的氫鍵數(shù)量減少，酶蛋白周圍的溶劑化層性質(zhì)也發(fā)生變化，使得酶蛋白內(nèi)部相互作用增強(qiáng)，增加酶的穩(wěn)定性［14］。

迄今為止，針對糖類的酶保護(hù)作用主要有兩種理論：第一種是“水替代”假說，認(rèn)為海藻糖的羥基和磷脂之間形成氫鍵，它們替代原有的磷脂與水之間的氫鍵并使磷脂頭部不能相互靠近，進(jìn)而降低磷脂的變性溫度，穩(wěn)定酶蛋白［22］；另一種是“玻璃態(tài)”假說，認(rèn)為海藻糖可以穩(wěn)定干燥生物質(zhì)的活性，因為海藻糖可以包裹住其附近的分子，形成一種跟玻璃相似的擴(kuò)散系數(shù)很低的結(jié)構(gòu)，蛋白樣品的分子運動減弱，穩(wěn)定性提高［23］。劉洋等［24］研究葡萄糖淀粉酶穩(wěn)定性時，加入1mol/L海藻糖，與不加穩(wěn)定劑的樣品相比，80℃時熱失活動力學(xué)常數(shù)變小，半衰期顯著增加，由2.7 min增加到37.4min。光譜分析也證實，海藻糖可以很大程度減小蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的變化，同時減輕蛋白質(zhì)聚集，提高酶蛋白穩(wěn)定性。

表1　糖醇對不同酶的穩(wěn)定效果

2.1.3多羥基聚合物

多羥基聚合物的酶穩(wěn)定化機(jī)制可以總結(jié)為：排除酶蛋白的溶劑化層，增加蛋白質(zhì)的剛性；靜電作用和隔離酶免受有害物質(zhì)影響［30］。聚乙二醇（PEG）是一種常用的高分子聚合物穩(wěn)定劑，不同分子量PEG均能不同程度地提高β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性，15%PEG1000能將β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶60℃下的半衰期延長約6.5倍［31］。Villalonga等［32］研究表明乙二醇?xì)ぞ厶牵℅lycol chitosan，0.04 g/L）可以有效提高胰蛋白酶（0.02 g/L）的穩(wěn)定性，55℃時酶的穩(wěn)定性提高約37倍，失活活化能增加了9.9 kJ/mol。

2.2鹽類

鹽離子保護(hù)劑分為特異性結(jié)合的陽離子和非特異性結(jié)合的鹽離子，前者的離子濃度通常較低，一般低于0.1mol/L，而后者濃度一般在0.1 mol/L以上［33］。值得注意的是，二價陽離子Ca2+的穩(wěn)定作用具有高度的特異性，不能作為一般應(yīng)用的穩(wěn)定劑［9］。例如，來源于嗜熱芽孢桿菌的嗜熱蛋白酶的天冬酰胺和谷氨酰胺的羧基有4個Ca2+結(jié)合位點，當(dāng)溶液中存在Ca2+時，Ca2+可以結(jié)合到酶的相應(yīng)位點上，增加酶分子的剛性，從而增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性［34］。至于非特異性結(jié)合的離子，它們與蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)和偶極子產(chǎn)生鹽析作用，致使酶的結(jié)構(gòu)更加緊湊。

當(dāng)然，鹽離子對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響也取決于鹽的種類和濃度。醛酮還原酶YtbE中加入1 mol/L氯化鉀，與空白對照組相比，YtbE殘余酶活提高約42%［21］。

2.3酯類

常用于穩(wěn)定酶蛋白的酯類化合物是非離子表面活性劑，一類具有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的兩性物質(zhì)。非離子表面活性劑穩(wěn)定酶蛋白的主要的機(jī)制包括界面競爭機(jī)制和絡(luò)合機(jī)制［35-38］。

界面競爭機(jī)制指的是表面活性劑的表面張力較大，相對于蛋白質(zhì)更容易占據(jù)兩相的界面，因此會與蛋白質(zhì)競爭吸附于兩相界面，減少了蛋白質(zhì)在兩相界面的吸附作用，降低蛋白質(zhì)的局部濃度，從而降低蛋白質(zhì)發(fā)生聚集和沉淀的風(fēng)險［35］。如圖1所示：A圖表示體系中沒有表面活性劑的情況下，蛋白質(zhì)易在界面處聚集并失活；B圖表示體系中有少量表面活性劑情況下，只能阻止部分蛋白聚集；C圖表示體系中添加足夠量的表面活性劑，可以有效阻止蛋白質(zhì)在界面處吸附。Joshi等［36］研究發(fā)現(xiàn)非離子表面活性劑的吸附性能與固液界面的疏水性有關(guān)，兩相界面疏水性越強(qiáng)，吐溫80抑制酶的吸附效果越佳。Dixit［37］發(fā)現(xiàn)吐溫80較蛋白質(zhì)具有更強(qiáng)的疏水性，可以減少蛋白質(zhì)在空氣和水溶液兩相界面處的聚集、吸附作用。

絡(luò)合機(jī)制則是指表面活性劑直接與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)結(jié)合，進(jìn)而增加蛋白質(zhì)的膠體穩(wěn)定性和熱力學(xué)穩(wěn)定性［35］。Perez等［38］使用熒光光譜和測量表面張力的方法研究表面活性劑聚山梨醇酯80對小牛血清的作用，發(fā)現(xiàn)蛋白與聚山梨醇酯混合后，混合溶液的表面張力比蛋白溶液或者聚山梨醇酯80表面張力都要大，臨界膠束濃度高于純表面活性劑的臨界膠束值，表面活性劑優(yōu)先結(jié)合到酶蛋白三級結(jié)構(gòu)的空腔中，并且可以與酶蛋白分子表面的疏水基團(tuán)相互作用，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

2.4專一性底物和輔因子

底物和輔因子能與酶特異性結(jié)合，改變酶分子構(gòu)象，降低酶構(gòu)象自由能，形成的復(fù)合物更加穩(wěn)定。例如，乳酸脫氫酶結(jié)合NAD+、NADH和乳酸后，酶的構(gòu)象更加穩(wěn)定，內(nèi)部能量處于較低狀態(tài)，酶的穩(wěn)定性增加［9］；向葡萄糖6-磷酸脫氫酶中加入底物葡萄糖6-磷酸和輔酶NADP，酶的半衰期t1/2分別提高了2.07和2.3倍［9］；來源于近平滑假絲酵母的羰基還原酶在添加了20 mmol/L輔酶NADH后，羰基還原酶穩(wěn)定性大幅度提高，殘余酶活提高5倍左右，這可能是輔酶與酶的活性中心結(jié)合后酶的構(gòu)象更加穩(wěn)定［39］。

2.5蛋白酶抑制劑及防腐劑

大部分酶容易被蛋白水解酶降解，乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）、苯甲基磺酰氟（PMSF）等蛋白酶抑制劑能減輕酶水解程度，前面提及的甘油、PEG等也具有輔助降低酶的水解作用。防止蛋白酶水解的過程中也應(yīng)注意防止微生物污染，在葡聚糖酶溶液中添加0.05%對羥基苯甲酸、0.03%異抗壞血酸鈉和0.05%山梨酸鉀的混合防腐劑，與對照組相比，葡聚糖酶溶液的殘余酶活提高了24.7%［40］。使用防腐劑時需十分小心且要控制在低濃度，因為高濃度的防腐劑本身反而可能會導(dǎo)致酶蛋白失活［40］。

3　結(jié)論

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，越來越多的酶資源將被開發(fā)出來。運用基因工程技術(shù)從分子水平上強(qiáng)化酶蛋白的穩(wěn)定性，再輔以穩(wěn)定劑使用、酶固定化技術(shù)和介質(zhì)工程強(qiáng)化酶的穩(wěn)定性，將有助于提升酶催化的競爭優(yōu)勢，拓展酶的工業(yè)應(yīng)用范圍。

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（責(zé)任編輯：朱小惠）

Advance in enzymes stability enhancement through additives supplementing

WANG Yajun1，2，CAO Kuai1，2
（1.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province，Hangzhou 310014，China；2.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

As highly efficient biocatalysts，enzymes have been widely used in the fields of chemical，pharmaceutical，food and energy industry with outstanding advantages.However，most enzymes face adverse conditions during the bioreaction，including high temperature，high salinity and extreme pH，and are very labile to lose activity，which severely limits their industrial applications.Therefore，it is critical and also challenging to enhance enzyme stability.Stabilizer additives supplementing is efficient to improve enzymes’stability.The characteristics of several different types of additives and their application in enzymes’stability enhancementwere reviewed，and the underlyingmechanismswere elucidated at the level of structure-function relationship.

enzyme；stability；additive

TS218

A

1674-2214（2016）03-0188-05

2016-05-04

國家自然科學(xué)基金（21476209）；省重大科技專項（2014C03010）

王亞軍（1975—），男，江蘇東臺人，教授，博士，研究方向為生物化工，E-mail：wangyj@zjut.edu.cn.通信作者：王亞軍教授，E-mail：wangyj@zjut.edu.cn.